王 松，劉曉蘭*，江成英，鄭喜群

（1.齊齊哈爾大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品加工黑龍江省普通高校重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

我國作為農(nóng)業(yè)大國，畜牧業(yè)產(chǎn)品產(chǎn)量居世界前列，但是對于糧食和飼料在我國一直處于薄弱地位。同時，由于各種農(nóng)作物及副產(chǎn)品的處理不當(dāng)對資源與環(huán)境也造成了巨大壓力[1-3]。我國從20世紀(jì)90年代開始研究微生物發(fā)酵飼料，大量研究表明[4-6]，微生物發(fā)酵飼料可提高原料的營養(yǎng)價值、動物的消化利用率等特點，對建立一個正常，平衡的動物體內(nèi)微生物生態(tài)系統(tǒng)起著重要的作用。當(dāng)前，生物飼料的開發(fā)已逐漸成為我國飼料加工的熱點[7]。

玉米蛋白粉作為一種重要的蛋白飼料資源含有豐富的蛋白質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于各類蛋白飼料生產(chǎn)中[8-10]，基于微生物發(fā)酵飼料的生產(chǎn)特點，利用微生物發(fā)酵玉米蛋白粉，不僅解決了玉米蛋白粉的浪費和吸收率問題，由于發(fā)酵產(chǎn)物中含有豐富的氨基酸等各類營養(yǎng)物質(zhì)，還可有效提高動物的生長率[11]。

在發(fā)酵飼料行業(yè)中，產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）主要作為益生菌及飼用發(fā)酵菌劑使用，常被用于生產(chǎn)多種具有功能性的生物物質(zhì)。研究表明[12]，飼料中添加產(chǎn)朊假絲酵母，提高了仔鵝生長性能，優(yōu)化了其盲腸菌群。采用產(chǎn)朊假絲酵母混菌發(fā)酵玉米蛋白粉，可以提高其營養(yǎng)價值。并且近年來隨著誘變育種技術(shù)的發(fā)展，相對于單一的誘變方式，復(fù)合誘變能夠更好的提高目標(biāo)微生物的各項功能性產(chǎn)物代謝量，如李學(xué)思等[13]從宋河大曲中酵法篩選出1株高產(chǎn)蛋白酶菌株MSPN-11，經(jīng)紫外誘變技術(shù)得1株高產(chǎn)蛋白酶菌株MSPR 8，酶活提高了26.38%。朱明軍等[14]對產(chǎn)中性蛋白酶的枯草芽孢桿菌以紫外線、硫酸二乙酯為誘變劑，對其進行兩輪復(fù)合誘變，誘變菌的發(fā)酵液酶活較出發(fā)菌提高了59.68%。本研究采用紫外-光復(fù)活誘變方式對目標(biāo)菌株進行處理，對目標(biāo)菌株進行篩選[15]，進而得到高產(chǎn)蛋白酶的菌株，并將其應(yīng)用于發(fā)酵玉米蛋白粉飼料生產(chǎn)，可有效提高飼料利用率，降低成本，具有良好的綠色與經(jīng)濟前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）：齊齊哈爾大學(xué)生物工程實驗室保藏。

1.1.2 化學(xué)試劑

無水乙醇、胰蛋白胨、瓊脂粉、碳酸鈉、酪蛋白、酪氨酸、葡萄糖、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三氯乙酸等（均為分析純或生化試劑）：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；脫脂牛奶：市售。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養(yǎng)基[16]：2%胰蛋白胨，2%葡萄糖，100 mL水，115℃，滅菌30 min。YPD固體培養(yǎng)基加入2%瓊脂；

脫脂牛奶培養(yǎng)基：A 5 g脫脂牛奶與50 mL蒸餾水混合；B 2 g瓊脂50 mL蒸餾水。A、B分別115℃滅菌20 min，冷卻至60℃混勻后倒入平板。

1.2 儀器與設(shè)備

PYX-DHS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱；上海躍進醫(yī)療器械廠；PHS-25數(shù)顯pH計；上海精密科學(xué)儀器有限公司；TV1901紫外可見分光光度計；北京譜析通用儀器有限公司；DSX-280不銹鋼壓力蒸汽滅菌器；上海申安醫(yī)療器械廠；ZHJH-C2109C超凈工作臺；上海智城分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種生長曲線測定

采用比濁法測定出發(fā)菌株的生長曲線[17]。

1.3.2 菌懸液的制備

接種一環(huán)產(chǎn)朊假絲酵母至YPD液體培養(yǎng)基中，于28℃、200 r/min培養(yǎng)20 h，得到菌懸液。

1.3.3 紫外誘變

使用紫外燈對菌懸液進行不同時間（0～150s）的照射，每隔5s進行一次取樣，稀釋之后進行YPD平板涂布。將YPD平板倒扣培養(yǎng)進行菌落計數(shù)，繪制致死率曲線。致死率計算公式如下：

1.3.4 紫外-光復(fù)活誘變

對菌懸液采用最佳紫外誘變時間（120 s）進行照射，然后放置白熾燈下進行不同時間（0～30 s）的光復(fù)活照射，每隔5 s進行一次取樣，稀釋后進行YPD平板涂布，將YPD平板倒扣避光培養(yǎng)進行菌落計數(shù)，計算光復(fù)活率及正突變率，其計算公式如下：

1.3.4 突變株的篩選

將經(jīng)紫外-光復(fù)活誘變處理后的菌懸液稀釋后涂布于脫脂牛奶平板上32℃，培養(yǎng)48 h。根據(jù)透明圈直徑與菌落直徑的比值，篩選出產(chǎn)蛋白酶活力較強的菌株。菌落的透明圈直徑與菌落直徑比值大小可以表示菌株產(chǎn)蛋白酶能力的強弱，該比值越大，則代表菌株產(chǎn)蛋白酶能力越強。

1.3.5 酶活力測定

將篩選菌株接入YPD液體培養(yǎng)基，于32℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)48 h，取培養(yǎng)液采用Folin-酚法測定中性蛋白酶活力。

1.3.6 遺傳穩(wěn)定性試驗

根據(jù)菌株產(chǎn)蛋白酶活力篩選出一株較出發(fā)菌株提高最大的突變株進行連續(xù)傳代試驗，將篩選所得菌株接入YPD固體培養(yǎng)基進行連續(xù)傳代5次培養(yǎng)后，取各代菌種接入液體培養(yǎng)基于32℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)48 h，取培養(yǎng)液采用Folin-酚法測定其中性蛋白酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 出發(fā)菌株的生長曲線

對微生物進行紫外誘變處理前，一般要求出發(fā)菌株應(yīng)處于對數(shù)生長期，當(dāng)菌株處于對數(shù)生長期時對紫外線照射更加敏感，易發(fā)生突變，而且處于對數(shù)生長期的菌種自身代謝能力強，相對穩(wěn)定，生長速度快繁殖旺盛[18]。以產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）作為出發(fā)菌株，接種至YPD液體培養(yǎng)于32℃、180r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)，在波長600nm處測定不同生長時間的OD600nm值，繪制菌株生長曲線見圖1。

圖1 產(chǎn)朊假絲酵母生長曲線Fig.1 Growth curve ofCandida utilis

由圖1可知，0～4 h期間菌體濃度幾乎無變化，此時菌種處于生長延遲期。從第6小時開始菌體濃度劇增，此時菌種進入對數(shù)生長期，20h后菌種生長速度減緩，進入穩(wěn)定期，30 h后，隨著菌種的生長緩慢，菌懸液濃度幾乎保持不變，進入衰亡期。結(jié)果表明，出發(fā)菌種的對數(shù)生長期為6～20 h，應(yīng)選擇對數(shù)中前期的菌種進行紫外誘變處理。因此，選擇經(jīng)過12 h培養(yǎng)的菌液進行紫外誘變處理。

2.2 紫外誘變處理

進行紫外誘變育種時，為了得出最佳誘變劑量，需先對出發(fā)菌種的紫外線致死率進行計算，產(chǎn)朊假絲酵母致死率曲線見圖2。

圖2 產(chǎn)朊假絲酵母致死率曲線Fig.2 Lethality rate curve ofCandida utilis

由圖2可知，隨著紫外線照射時間的增加，菌株的死亡率也隨之增加。產(chǎn)朊假絲酵母在紫外照射劑量為120 s時的致死率達(dá)到80%，由于致死率為80%時，紫外誘變處理的效果最佳，菌種正突變率最高。因此，采用120 s為產(chǎn)朊假絲酵母的最佳紫外誘變劑量。

2.3 紫外-光復(fù)活誘變[19]

在紫外照射120 s后放入白熾燈下進行不同時間（0～30 s）的光復(fù)活照射，通過平板涂布法計算光復(fù)活率，并測量計算透明圈直徑與菌落直徑比值，與單一誘變突變株進行比較，通過計數(shù)透明圈直徑比大于原始菌株直徑比的菌落數(shù)，與菌落總數(shù)的比值計算正突變率，產(chǎn)朊假絲酵母光復(fù)活率及正突變率曲線見圖3。

圖3 產(chǎn)朊假絲酵母光復(fù)活率及正突變率曲線Fig.3 Photoreactivation rate and positive mutation rate curve of Candida utilis

由圖3可知，隨著光復(fù)活時間在0～30 s范圍內(nèi)增加，菌株光復(fù)活率也隨之由10.01%增加至32.42%。隨著光復(fù)活時間在0～30s內(nèi)的增加，正突變率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，并且在白熾燈照射劑量達(dá)到20 s時，菌株正突變率最大達(dá)到14.99%，隨后便隨著白熾燈照射時間的增加而減小。因此，確定在紫外照射120 s后，白熾燈照射20 s為最佳光復(fù)活劑量。

2.4 高產(chǎn)蛋白酶突變菌株篩選

2.4.1 紫外誘變突變株篩選

將出發(fā)菌株進行單一紫外誘變處理（紫外照射120 s）后，將其倒扣避光培養(yǎng)于32℃恒溫培養(yǎng)箱中48 h，根據(jù)透明圈直徑與菌落直徑的比值，篩選出產(chǎn)蛋白酶活力較強的菌株，并測定其酶活力，結(jié)果見表1。

表1 紫外誘變突變株的初篩Table 1 Primary screening of UV mutated strain

由表1可知，出發(fā)菌株透明圈與菌落直徑比值為7.62，由于脫脂牛奶培養(yǎng)基上菌落的透明圈直徑與菌落直徑比值大小可以反映菌株產(chǎn)蛋白酶能力的強弱，該比值越大，則代表菌株產(chǎn)蛋白酶能力越強。所以通過120 s的紫外線照射，篩選出較出發(fā)菌株比值提高最大的5株突變株，其中以YC-3最大達(dá)到13.11，將篩選所得5株菌株于32℃搖床培養(yǎng)48 h后測定其酶活力，得出發(fā)菌株酶活力為21.93 U/mL，突變株中以YC-3酶活力最大達(dá)到35.55 U/mL，是出發(fā)菌株酶活力的1.62倍，但提升效果較差，為更好的提高菌株產(chǎn)蛋白酶能力，對經(jīng)紫外誘變后的菌株再次進行光復(fù)活試驗。

2.4.2 紫外-光復(fù)活誘變突變株篩選

出發(fā)菌株的菌懸液經(jīng)過紫外照射120 s后，再經(jīng)白熾燈照射20 s，得到紫外-光復(fù)活誘變菌株，涂布于脫脂牛奶培養(yǎng)基于32℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。計算透明圈直徑與菌落直徑比值，并測定其酶活力，結(jié)果見表2。

表2 紫外-光復(fù)活誘變的突變株篩選Table 2 Screening of mutant strain by UV photoreactivation mutagenesis

由表2可知，YC-3的透明圈與菌落直徑比值為13.11，從測得的突變株中篩選透明圈與菌落直徑比值＞13.11的突變株。經(jīng)篩選共得出5株比值較YC-3提高最大的突變株，其中以突變株FC-20.14的比值最大為17.14。將篩選出的5株突變株分別接入YPD液體培養(yǎng)基中于32℃搖床培養(yǎng)48 h后離心取上清液測定其中性蛋白酶活力[20]，其中以突變株FC-20.14酶活力最高為64.18 U/mL。是單一紫外誘變的突變株YC-3的酶活力35.55 U/g的1.81倍，是出發(fā)菌株酶活力21.93 U/mL的2.93倍。

2.6 遺傳穩(wěn)定性試驗

將突變株FC-20.14接至YPD斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)傳代。連續(xù)培養(yǎng)5代后，將每代均接種于YPD液體培養(yǎng)基中，測定其中性蛋白酶活力[21-24]，結(jié)果見表3。

表3 突變株FC-20.14遺傳穩(wěn)定性Table 3 Genetic stability of mutant strain FC-20.14

由表3可知，對突變株FC-20.14進行連續(xù)傳代5次，酶活力稍有降低。從第1代至第5代，酶活力變化了0.21 U/mL，變化率為0.32%，變化幅度不顯著，證明連續(xù)傳代會對突變株FC-20.14的蛋白酶活力造成一定影響，但減少程度較小，由此可得出，該突變株遺傳性狀穩(wěn)定，遺傳性能良好，可用作發(fā)酵玉米蛋白粉飼料。

3 結(jié)論

本研究通過紫外-光復(fù)活誘變育種篩選出一株遺傳性狀穩(wěn)定的較出發(fā)菌株蛋白酶活力有明顯提高的產(chǎn)朊假絲酵母突變菌株FC-20.14用作微生物發(fā)酵玉米蛋白粉飼料，經(jīng)測定出發(fā)菌株經(jīng)單一紫外誘變過后，篩選出一株紫外突變株YC-3，蛋白酶活力為35.55 U/mL，較出發(fā)菌株的蛋白酶活力提高了0.62倍。經(jīng)紫外-光復(fù)活誘變處理后，篩選出一株紫外-光復(fù)合突變株FC-20.14，該突變株透明圈直徑與菌落直徑比值為17.14，蛋白酶活力為64.18U/mL，較出發(fā)菌株提高1.93倍。通過遺傳穩(wěn)定性試驗發(fā)現(xiàn)連續(xù)傳代5次后該突變株蛋白酶活力變化率為0.32%，變化幅度不顯著，證明其擁有穩(wěn)定的遺傳性能，可用于發(fā)酵玉米蛋白粉飼料，為發(fā)酵玉米蛋白粉飼料的研究奠定了基礎(chǔ)。