王家東，李 婧，賈玉香，張嬌嬌，杜 鵬，鄭 宇，宋 佳*

（1.信陽農(nóng)林學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，河南 信陽 464000；2.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展、工業(yè)現(xiàn)代化程度的提高，人們的生活節(jié)奏明顯加快。現(xiàn)代都市中青年普遍使用電腦辦公，工作壓力大，節(jié)奏快，夜生活不節(jié)制，經(jīng)常熬夜，極易造成便秘的情況[1-4]。便秘會(huì)加重患者的思想負(fù)擔(dān)，增添焦慮緊張情緒，并對(duì)人體內(nèi)環(huán)境、內(nèi)分泌系統(tǒng)均有一定影響，日久也可能誘發(fā)或加重其他疾病，影響患者的生活質(zhì)量[5-7]。因此，潤腸通便，防治大便秘結(jié)對(duì)于保持身體健康，延年益壽具有十分重要的意義。

果醋是以果實(shí)或果酒為原料，通過微生物發(fā)酵成的酸性飲料或者調(diào)味品，兼具食醋和水果的雙重營養(yǎng)保健功能[8]。果醋含有豐富的有機(jī)酸、氨基酸、維生素及礦物質(zhì)，具有食療保健，美白護(hù)膚、抗病、抗衰老、抗疲勞等功能，被譽(yù)為“21世紀(jì)的食品”[9-13]。目前市場(chǎng)上的果醋多為單一品種的水果果醋，而對(duì)于采用兩種或兩種以上水果為原料釀制復(fù)合果醋的產(chǎn)品并不常見。如果能充分利用豐富的水果資源開發(fā)果醋及果醋飲料產(chǎn)品，就可以有效解決鮮果滯銷的問題，為果蔬深加工提供廣闊地發(fā)展空間[14-15]。

含果醋乳飲料的開發(fā)是近年來研究的熱點(diǎn)，較之于單純的傳統(tǒng)食醋或者果醋開發(fā)，以及單純酸性乳飲料開發(fā)，含果醋乳飲料兼具了果醋保健和酸乳營養(yǎng)豐富的優(yōu)點(diǎn)[16-17]。但目前市場(chǎng)上含果醋乳飲料的開發(fā)主要是將發(fā)酵型的果醋和乳制品進(jìn)行調(diào)配，如將成品果醋和牛奶按一定比例調(diào)配或者將發(fā)酵型蘋果醋和酸奶進(jìn)行調(diào)配制成蘋果醋酸奶乳飲料。但調(diào)配型果醋乳飲料原料利用率較低，質(zhì)量不穩(wěn)定，風(fēng)味物質(zhì)損失嚴(yán)重[18-19]。

針對(duì)當(dāng)前果醋乳飲料存在的問題，本研究研發(fā)一種具有潤腸通便功能的發(fā)酵型復(fù)合果醋乳飲料，以茶淀葡萄、蘋果和柚子為原料經(jīng)過酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵、益生菌發(fā)酵后調(diào)配成發(fā)酵型復(fù)合果醋乳飲料，并研究其對(duì)小鼠潤腸通便功能的影響，為果蔬深加工以及果醋乳產(chǎn)品的開發(fā)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與試劑

茶淀葡萄、蘋果、柚子、脫脂牛奶：天津市蔬菜水果批發(fā)市場(chǎng)；白砂糖（一級(jí)）：市售；檸檬酸鈉、羧甲基纖維素鈉、果膠（均為食品級(jí)）：國藥集團(tuán)（天津自貿(mào)區(qū)）供應(yīng)鏈有限公司；阿拉伯膠（分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠；活性炭：廣州舒野環(huán)保材料有限公司；復(fù)方地芬諾酯片、鹽酸洛哌丁胺：長春長紅制藥有限公司。

1.1.2 菌株

巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）AS1.41：天津科技大學(xué)微生物制藥研究室；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CICC 1012、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）CICC 22150：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；葡萄酒酵母RW：安琪酵母有限公司。

1.1.3 動(dòng)物

健康雄性昆明小鼠[體質(zhì)量（20±2）g，100只]：中國食品藥品檢定研究院，許可證號(hào)：SCXK（京）2014-0013。

1.1.4 培養(yǎng)基

醋酸菌培養(yǎng)基：30 g葡萄糖、10 g酵母膏、10 g蛋白胨溶解于1 000 mL水中，于115℃條件下滅菌20 min，冷卻后在無菌條件下加入35 mL無水乙醇。

MRS乳酸菌培養(yǎng)基：10 g蛋白胨、10 g酵母膏、20 g葡萄糖、1.0 mL吐溫80、2 g K2HPO4、5 g醋酸鈉、2 g檸檬酸二銨、0.58 gMgSO4·7H2O、0.25 gMnSO4·4H2O溶解于1 000 mL水中，pH 6.2～6.6，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

BG2004型電子分析天平：南京安鐸貿(mào)易有限責(zé)任公司；TGL-16B型高速臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器；WE-3型水浴恒溫振蕩器：天津市歐諾儀器儀表有限公司；WYT型手持式糖度計(jì)：上海天壘儀器公司；JYL-C60T榨汁機(jī)：九陽股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 復(fù)合果醋乳飲料加工工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：

原料制漿：根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，茶淀葡萄12 kg、蘋果6 kg及柚子（含皮）3 kg破碎榨汁，添加適量抗壞血酸，以防止褐變。

酶解：于復(fù)合果汁中添加0.018 g/L果膠酶，45℃酶解2 h，在70℃鈍化酶，殺菌、冷卻待用。

酒精發(fā)酵：用蔗糖調(diào)節(jié)總糖質(zhì)量濃度至250g/L，按0.2g/L的接種量接入已經(jīng)用30℃1%蔗糖水溶液活化20min后的活性干酵母RW，25℃進(jìn)行酒精發(fā)酵，當(dāng)發(fā)酵液中的總糖質(zhì)量濃度低于5 g/L時(shí)終止發(fā)酵，得到復(fù)合果酒醪液，此時(shí)酒精度為（8.5±0.5）%vol。

醋酸發(fā)酵：將酒精發(fā)酵獲得的果酒醪液中酒精濃度用純凈水稀釋至7.5%vol后，接入巴氏醋桿菌AS1.41種子液（10%接種量），30℃、180 r/min條件下進(jìn)行醋酸發(fā)酵，當(dāng)發(fā)酵液中的總酸含量達(dá)到（6.5±0.5）g/100 mL，終止發(fā)酵得到復(fù)合果醋醪液。

混合：將復(fù)合果醋醪液稀釋至酸度為（0.5±0.1）g/100mL后按70%的添加量加入已滅菌的脫脂生牛乳液得到混合液，經(jīng)過濾、均質(zhì)、滅菌備用。

益生菌發(fā)酵：混合液中接入植物乳桿菌種子液（10%接種量），42℃條件下靜置發(fā)酵3 d。

調(diào)配：發(fā)酵完成的復(fù)合果醋乳中加入（10±2）%原料果汁后，再加入蔗糖、檸檬酸鈉、羧甲基纖維素鈉和果膠進(jìn)行調(diào)配。

灌裝、成品：將調(diào)配得到的復(fù)合果醋乳經(jīng)超高溫瞬時(shí)滅菌后在無菌條件下灌裝入250 mL無菌紙盒（康美包：采用PE/白紙板/PE/Al/粘合層/PE 6層復(fù)合結(jié)構(gòu)），即得復(fù)合果醋乳飲料成品。

1.3.2 復(fù)合果醋乳飲料配方優(yōu)化單因素試驗(yàn)

為使復(fù)合果醋乳飲料在口感上更加柔和，風(fēng)味上更加突出，對(duì)其配方進(jìn)行優(yōu)化，選取2.5%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%蔗糖添加量調(diào)整甜度，0.25‰、0.50‰、0.75‰、1.00‰、1.25‰檸檬酸鈉添加量調(diào)節(jié)酸度，0.5‰、1.0‰、1.5‰、2.0‰、2.5‰果膠添加量和0.25‰、0.50‰、0.75‰、1.00‰、1.25‰羧甲基纖維素鈉添加量調(diào)節(jié)黏稠度及穩(wěn)定性，調(diào)配后進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

1.3.3 復(fù)合果醋乳飲料配方優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用4因素3水平的正交設(shè)計(jì)L9（34）優(yōu)化復(fù)合果醋乳飲料配方，正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 復(fù)合果醋乳飲料配方優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for formula optimization of compound fruit vinegar milk beverage

1.3.4 復(fù)合果醋乳飲料品質(zhì)分析

感官評(píng)定：復(fù)合果醋乳飲料感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2，隨機(jī)抽取10名食品專業(yè)學(xué)生組成評(píng)分小組按照感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行打分，取平均值作為感官評(píng)分結(jié)果，滿分100分。

表2 復(fù)合果醋乳飲料感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of compound fruit vinegar milk beverage

理化指標(biāo)：蛋白質(zhì)和苯甲酸含量測(cè)定參照GB/T21732—2008《含乳飲料》中方法進(jìn)行[20]。

微生物測(cè)定：大腸桿菌采用菌落計(jì)數(shù)法；致病菌參照GB/T 22429—2008《食品中沙門氏菌、腸出血性大腸埃希氏菌O157及單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的快速篩選檢驗(yàn)酶聯(lián)免疫法》中的方法測(cè)定[21]。

1.3.5 潤腸通便功能評(píng)價(jià)動(dòng)物試驗(yàn)

參考《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范實(shí)施手冊(cè)》中規(guī)定的通便功能檢驗(yàn)方法，考察復(fù)合果醋乳飲料潤腸通便的功能。

（1）動(dòng)物分組及飼養(yǎng)

健康雄性昆明小鼠，體質(zhì)量18～22g，飼養(yǎng)溫度（24±1）℃，相對(duì)濕度40%～60%，晝夜間隔12 h；設(shè)置空白組、模型組、高、中、低劑量組，每組20只。

（2）動(dòng)物給藥方式及劑量

墨汁的配制：阿拉伯膠100 g，加水800 mL，煮沸至透明溶液，稱取活性炭粉末50 g，加入上述溶液煮沸3次，冷卻至室溫后補(bǔ)水至1 000 mL，4℃保存，用前搖勻。

劑量計(jì)算：按照成人（體質(zhì)量按70 kg計(jì)算）每天飲用1瓶，即100 mL計(jì)算，小鼠折算劑量按人體10倍計(jì)，即小鼠每天飲用1 000 mL/70 kg，每只小鼠按20 g計(jì)，即每只小鼠每天飲用0.33 mL。

空白組受試小鼠，每天灌胃1次，每次0.33 mL生理鹽水，連續(xù)灌胃14 d；模型組受試小鼠，利用鹽酸洛哌丁胺建立便秘模型組；實(shí)驗(yàn)組受試小鼠，給已建立的便秘模型組受試小鼠灌胃復(fù)合果醋乳飲料，高劑量組每天灌胃0.6 mL，低劑量組每天灌胃0.3 mL，連續(xù)灌胃14 d。

（3）小鼠小腸運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)

連續(xù)灌胃14 d后，各組小鼠禁食不禁水12 h；模型組和高、中、低劑量組分別灌胃給予復(fù)方地芬諾酯5 mg/kg體質(zhì)量，空白組給蒸餾水；復(fù)方地芬諾酯灌胃30 min后，各組進(jìn)行最后一次劑量灌胃；灌胃后空白組、模型組和高、中、低劑量組分別灌胃0.4 mL墨汁；30 min后立即處死各組受試小鼠，分離獲取幽門至盲部的腸管，拉直后分別測(cè)量腸管總長度、幽門至墨汁前沿的墨汁推進(jìn)長度，并計(jì)算每只受試小鼠墨汁推進(jìn)率，其計(jì)算公式為小鼠墨汁推進(jìn)率=墨汁推進(jìn)長度/腸管總長度×100%。

（4）小鼠排便實(shí)驗(yàn)

連續(xù)灌胃14 d后，各組小鼠禁食不禁水12 h；模型組和高、中、低劑量組分別灌胃給予復(fù)方地芬諾酯5 mg/kg體質(zhì)量，空白組給蒸餾水；復(fù)方地芬諾酯灌胃30 min后，各組進(jìn)行最后一次劑量灌胃；灌胃后空白組、模型組和高、中、低劑量組分別灌胃0.4 mL墨汁，灌胃后各組動(dòng)物單獨(dú)飼養(yǎng)，自由攝食攝水，并記錄自灌胃墨汁起，每只動(dòng)物排首粒黑便的時(shí)間。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，多組數(shù)據(jù)比較采用方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異顯著；P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合果醋乳飲料配方優(yōu)化結(jié)果

以感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)復(fù)合果醋乳飲料調(diào)配工序中蔗糖、檸檬酸鈉、羧甲基纖維素鈉和果膠的添加量進(jìn)行優(yōu)化，以期得到一種風(fēng)味較好、符合大眾口味的復(fù)合果醋乳飲料。

2.1.1 復(fù)合果醋乳飲料配方優(yōu)化單因素試驗(yàn)

由圖1A可知，當(dāng)果醋乳飲料蔗糖添加量在5.0%～10.0%時(shí)感官評(píng)分較高，蔗糖較多時(shí)，口感甜度太濃；含量較少時(shí)，酸味的刺激較明顯，酸味較重。因此，蔗糖添加量選擇7.5%較合適。由圖1B可知，當(dāng)果醋乳飲料檸檬酸鈉添加量在0.50‰～1.00‰時(shí)感官評(píng)分較高，添加量過低時(shí)酸味明顯，刺激感較大；添加量較高時(shí)，口味較澀。因此，檸檬酸鈉添加量選擇1.00%較合適。由圖1C可知，當(dāng)果醋乳飲料羧甲基纖維素鈉添加量在0.75‰～1.25‰時(shí)感官評(píng)分較高，此時(shí)果醋乳的體態(tài)均勻，口感潤滑；添加量過低時(shí)，產(chǎn)品太稀，有顆粒；添加量較高時(shí)，產(chǎn)品過于黏稠，無爽滑感；因此，羧甲基纖維素鈉添加量選擇1.00%較合適。由圖1D可知，當(dāng)果醋乳果膠添加量在1.5‰～2.5‰時(shí)感官評(píng)分較高，組織細(xì)膩，無分層和沉淀現(xiàn)象；添加量較低時(shí)，產(chǎn)品有輕微分層現(xiàn)象；添加量較高時(shí)，產(chǎn)品澀感明顯；因此，果膠添加量選擇2.0‰較合適。

圖1 各組分添加量對(duì)復(fù)合果醋乳飲料感官品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of each component addition on sensory quality of compound fruit vinegar milk beverage

2.1.2 復(fù)合果醋乳飲料配方優(yōu)化正交試驗(yàn)

以感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)對(duì)蔗糖（A）、檸檬酸鈉（B）、果膠（C）及羧甲基纖維素鈉（D）和的添加量進(jìn)行優(yōu)化，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表3。由表3可知，對(duì)復(fù)合果醋乳飲料影響因素由大到小的順序依次為蔗糖添加量（A）＞羧甲基纖維素鈉添加量（D）＞檸檬酸鈉添加量（B）＞果膠添加量（C）；由k值確定最優(yōu)配方組合為A2B2C3D2，即蔗糖7.5%、檸檬酸鈉1.00‰、果膠2.5‰、羧甲基纖維素鈉1.00‰。在此優(yōu)化配方條件下，感官評(píng)分為95分。

表3 復(fù)合果醋乳飲料配方優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for formula optimization of compound fruit vinegar milk beverage

2.2 產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)

感官指標(biāo)：色澤為淡紫色、液體澄清，無沉淀、口味清新，具有酸乳獨(dú)特的口感，感官評(píng)分為95分。

理化指標(biāo)：乳蛋白質(zhì)含量為1.3 g/100 g，苯甲酸含量為0.01 g/kg，符合GB/T 21732—2008《含乳飲料》中乳蛋白質(zhì)≥1.0 g/100 g、苯甲酸≤0.03 g/kg的規(guī)定。

微生物指標(biāo)：細(xì)菌總數(shù)＜100 CFU/mL，大腸桿菌＜3 MPN/100 mL，致病菌未檢出。

2.3 潤腸通便功能評(píng)價(jià)

2.3.1 復(fù)合果醋乳飲料對(duì)小鼠小腸運(yùn)動(dòng)的影響

復(fù)合果醋乳飲料對(duì)小鼠小腸運(yùn)動(dòng)的影響結(jié)果見表4。

表4 復(fù)合果醋乳飲料對(duì)小鼠小腸運(yùn)動(dòng)的影響Table 4 Effect of compound fruit vinegar milk beverage on small intestine movement of mice

由表4可知，與空白組相比，模型組墨汁推進(jìn)率顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，低劑量組墨汁推進(jìn)率有顯著提高（P＜0.05），高劑量組墨汁推進(jìn)率有極顯著提高（P＜0.01）。

2.3.2 復(fù)合果醋乳飲料對(duì)小鼠排便的影響

復(fù)合果醋乳飲料對(duì)小鼠排便的影響結(jié)果見表5。由表5可知，與空白組相比，模型組首次排黑便時(shí)間極顯著延長（P＜0.01）；與模型組相比，高、低劑量組首次排黑便時(shí)間極顯著縮短（P＜0.01），且高劑量組排黑便時(shí)間與空白組相近。

表5 復(fù)合果醋乳飲料對(duì)小鼠排便的影響Table 5 Effect of compound fruit vinegar milk beverage on defecation of mice

綜上所述，該發(fā)酵型復(fù)合果醋乳飲料連續(xù)灌胃14 d后，在各組動(dòng)物單獨(dú)飼養(yǎng)，自由攝食攝水，無人為影響其活動(dòng)的基礎(chǔ)上，模型組與空白組存在極顯著差異（P＜0.01），即復(fù)方地芬諾酯可顯著抑制空白組動(dòng)物的正常排便行為。而劑量組動(dòng)物的排便行為與模型組存在極顯著差異（P＜0.01），與空白組無顯著性差異（P＞0.05），結(jié)果表明，劑量組動(dòng)物在復(fù)方地芬諾酯刺激后，其被抑制的排便行為得以恢復(fù)至正常水平，該結(jié)果與程陽等[22]針對(duì)羊棲菜褐藻酸鈉對(duì)便秘模型小鼠的潤腸通便的研究相符。因此，通過小鼠小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)和小鼠排便實(shí)驗(yàn)相關(guān)結(jié)果結(jié)果，表明該復(fù)合果醋乳飲料具有良好的促進(jìn)潤腸通便的功能。

3 結(jié)論

本研究結(jié)合當(dāng)前市場(chǎng)要求，首次以茶淀葡萄、蘋果、柚子和牛奶為原料，經(jīng)過微生物三次發(fā)酵開發(fā)出了的一種新型的復(fù)合果醋乳飲料，通過單因素和正交試驗(yàn)對(duì)該飲料的調(diào)配工藝進(jìn)行優(yōu)化，最終確定復(fù)合果醋乳飲料的配方為：蔗糖7.5%、檸檬酸鈉1.00‰、果膠2.5‰、羧甲基纖維素鈉1.00‰。在此優(yōu)化條件下，感官評(píng)分為95分。該飲料產(chǎn)品在色澤、香氣和滋味等方面均能顯示其產(chǎn)品特色，其理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)均符合國家標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)考察該飲料對(duì)小鼠機(jī)體潤腸通便功能的影響，進(jìn)一步證明該復(fù)合果醋乳飲料具有良好的潤腸通便的功能，是一種具有開發(fā)潛力的發(fā)酵型飲品。