張巧玲，呂錫斌，秦 興，陳良強(qiáng)，楊 帆，王和玉，王 莉*

（貴州茅臺酒股份有限公司，貴州 仁懷 564501）

以小麥為原料制成的醬香型高溫大曲含有多種菌種及酶類[1-2]，在醬香型白酒生產(chǎn)過程中起著菌種劑、糖化、發(fā)酵、生香以及提供營養(yǎng)底物的功能，大曲的質(zhì)量直接關(guān)系著酒的風(fēng)格和質(zhì)量[3-6]。在制曲的過程中，由于發(fā)酵倉內(nèi)溫度、水分等參數(shù)指標(biāo)的差異，使得大曲拆倉時(shí)易形成三種類別的大曲，即白曲、黃曲和黑曲[7-9]。在實(shí)際生產(chǎn)中，白曲、黃曲和黑曲經(jīng)過存儲后混合磨碎投入制酒生產(chǎn)使用，因此大曲質(zhì)量的評判對制酒生產(chǎn)有重要影響[10]。

在制曲過程中，大曲中的游離氨基酸和碳水化合物作用產(chǎn)生美拉德反應(yīng)，使大曲顏色加深，美拉德反應(yīng)是大曲色澤形成的重要原因[11]，從而影響大曲質(zhì)量的感官判別。同時(shí)，游離氨基酸是微生物生長代謝賴以生存的氮源來源之一，影響著微生物的生長情況和代謝物的產(chǎn)生[12]。氨基酸還可作為高級醇、酯類等大曲香氣物質(zhì)形成的重要前體物質(zhì)[13-14]，不同的氨基酸能呈現(xiàn)甜、鮮、苦等味道，對白酒的風(fēng)味及口感形成起著重要作用。

吳光斌等[15]對不同等級中溫大曲的氨基酸含量進(jìn)行了研究，并發(fā)現(xiàn)游離氨基酸與大曲質(zhì)量有一定的關(guān)系。龔士選等[16]曾提出用α-氨基酸態(tài)氮含量評價(jià)大曲質(zhì)量。炊偉強(qiáng)[17]通過分析濃香型高溫大曲和中高溫大曲的游離氨基酸，發(fā)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)大曲中游離氨基酸總量均高于普級大曲，高溫優(yōu)質(zhì)大曲中鮮味氨基酸顯著高于普級大曲。該研究結(jié)合感官評價(jià)分類結(jié)果，采用茚三酮衍生法對醬香型白酒高溫大曲拆倉大曲進(jìn)行游離氨基酸分析，以探討大曲游離氨基酸與大曲質(zhì)量的關(guān)系，為進(jìn)一步揭示不同類別大曲的功能奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為醬香型大曲制曲標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬香型白酒高溫大曲：經(jīng)感官評價(jià)分類的高溫拆倉大曲，其中白曲16個(gè)，黃曲19個(gè)，黑曲21個(gè)，均取自貴州茅臺酒股份有限公司。

酸性和中性氨基酸及相關(guān)化合物標(biāo)準(zhǔn)品（β-丙氨酸、L-丙氨酸、α-氨基己二酸、α-氨基丁酸、α-氨基異丁酸、天冬酰胺、天冬氨酸、瓜氨酸、胱硫醚、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、羥脯氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、磷酸絲氨酸、脯氨酸、磷酸乙醇胺、蘇氨酸、牛磺酸、蘇氨酸、酪氨酸、纈氨酸）、生理和堿性氨基酸及相關(guān)化合物標(biāo)準(zhǔn)品（γ-氨基丁酸、鵝肌肽、精氨酸、肌肽、乙醇胺、組氨酸、同半胱胺酸、羥賴氨酸、賴氨酸、1-甲基組氨酸、3-甲基組氨酸、鳥氨酸、色氨酸）：美國Sigma Aldrich公司；磺基水楊酸（分析純）：中國BBI生命科學(xué)公司；Ultra Physiological Fluid Chenical Kit：英國Biochrmo公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Biochrom30+氨基酸分析儀：英國Biochrom公司；MIKRO 220R臺式高速冷凍離心機(jī)：德國Hettich公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

取1g大曲加入至10mL純凈水中，劇烈振蕩混勻10min，4℃放置過夜，浸出其可溶性成分，10000r/min離心15min。取濾液5 mL于離心管中，加入5 mL 10%的磺基水楊酸，振蕩混勻后12000r/min離心15min，取上清液1mL，用0.45μm微孔濾膜過濾后，上機(jī)檢測。

1.3.2 測定方法

測定條件：Peeku-1884離子分離柱，鋰型Ultropac8陽離子交換樹脂，梯度洗脫，分離柱柱溫31～67℃，反應(yīng)單元溫度135℃；泵Ⅰ（緩沖液）流速35mL/h，泵壓力1.5～14.5MPa，泵Ⅱ（反應(yīng)液）流速25 mL/h，泵壓力0.2～1.2 MPa；檢測波長：一通道570 nm，二通道440 nm。

1.3.3 分析方法

采用外標(biāo)法定量并計(jì)算各種氨基酸的含量[18-19]；應(yīng)用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及student's-ttest（非成對數(shù)據(jù)比較分析）；應(yīng)用xlstat軟件（2015試用版）對大曲進(jìn)行判別分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品中含有酸性、中性、堿性氨基酸及相關(guān)化合物，對混合標(biāo)準(zhǔn)氨基酸樣品分析檢測，檢測結(jié)果見圖1。由圖1可知，570 nm通道可檢測36種氨基酸及相關(guān)化合物，440 nm通道可檢測出羥脯氨酸和脯氨酸2種氨基酸。所有的氨基酸及相關(guān)化合物能夠在125 min內(nèi)得到較理想的分離效果。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)游離氨基酸測定結(jié)果計(jì)算得到各種氨基酸的校正因子，各氨基酸質(zhì)量濃度Y（mg/L）對峰面積X的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程見表1。由表1可知，相關(guān)系數(shù)R2均＞0.99，結(jié)果表明，各氨基酸質(zhì)量濃度與峰面積在一定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品色圖譜Fig.1 Chromatogram of mixed amino acids standards

表1 游離氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Table 1 Standard curve regression equation of free amino acids

2.2 大曲游離氨基酸含量分析

大曲樣品經(jīng)過處理進(jìn)樣后，游離氨基酸分析圖譜見圖2，從圖2可看出，峰型及分離效果良好。從拆倉大曲中共檢出氨基酸及相關(guān)化合物21種。

圖2 大曲氨基酸色圖譜Fig.2 Chromatogram of amino acids in Daqu

對白曲、黃曲和黑曲游離總氨基酸含量（不含α-氨基丁酸、γ-氨基酸丁酸）進(jìn)行分析，結(jié)果見圖3。由圖3可知，不同類別拆倉大曲氨基酸總量存在極顯著差異（P＜0.01），拆倉大曲游離氨基酸總量大小順序?yàn)楹谇军S曲＞白曲，白曲游離總氨基酸含量為9.65 mg/g，黃曲游離氨基酸總量為10.57 mg/g，黑曲游離總氨基酸含量為12.52 mg/g。

圖3 不同類別大曲游離總氨基酸含量Fig.3 Total content of free amino acids in different types of Daqu

白曲、黃曲和黑曲中均檢測出天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸和脯氨酸共18種氨基酸，未檢出色氨酸和瓜氨酸。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得大曲游離氨基酸的含量，白曲、黃曲和黑曲游離氨基酸（不含氨）平均含量及占比見表2。

從表2可看出，黃曲和白曲中谷氨酸含量最高，平均含量分別為1.24 mg/g、1.30 mg/g，占總氨基酸的11.51%及13.18%，其次為脯氨酸、丙氨酸。在黑曲中脯氨酸含量最高，平均含量為1.58 mg/g，占總氨基酸的12.36%，其次為丙氨酸、異亮氨酸和谷氨酸。此外，在3種大曲中均檢測出了γ-氨基丁酸，平均含量均為0.13 mg/g。

表2 不同類別大曲游離氨基酸平均含量及占比Table 2 Average content and distribution of free amino acids in different types of Daqu

在18種氨基酸中，中性氨基酸含量最高（含甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸），占游離氨基酸總量的34.89%（白曲）～38.68%（黑曲），其次為酸性氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）、雜環(huán)氨基酸（脯氨酸、組氨酸）以及芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸），含硫氨基酸含量最低。

2.3 大曲游離氨基酸差異性比較

為了進(jìn)一步了解白曲、黃曲和黑曲之間游離氨基酸的差異，基于大曲游離氨基酸含量進(jìn)行了student's-t test（非成對數(shù)據(jù)比較）差異性分析，結(jié)果見圖4。由圖4可知，白曲、黃曲、黑曲在不同游離氨基酸含量上存在顯著性差異（P＜0.05），大曲氨基酸差異具體為白曲和黃曲在蘇氨酸、絲氨酸上存在顯著性差異（P＜0.05），天冬氨酸、天冬酰胺、纈氨酸、組氨酸和精氨酸上存在極顯著性差異（P＜0.01）。白曲和黑曲在谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸和鳥氨酸含量上存在顯著性差異（P＜0.05），天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、組氨酸、精氨酸差異極顯著（P＜0.01）。黃曲和黑曲在丙氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸上差異顯著（P＜0.05），天冬氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸有極顯著差異（P＜0.01）。其中天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和精氨酸在大曲中均隨著大曲顏色加深而上升，這幾類氨基酸在黑曲中含量最高，在白曲中含量最低。谷氨酸則呈相反趨勢，在白曲中含量最高，黑曲中含量最低，同時(shí)白曲中的組氨酸含量也顯著高于黑曲和黃曲（P＜0.05）。除了上述幾種氨基酸，黃曲的丙氨酸、苯丙氨酸含量顯著低于黑曲（P＜0.05），而黑曲的脯氨酸則顯著高于黃曲和白曲（P＜0.05）。

圖4 不同類別大曲氨基酸差異性分析Fig.4 Difference analysis of amino acids in different types of Daqu

在發(fā)酵過程中，氨基酸為酵母代謝提供氮源，氨基酸的碳骨架可參與酵母細(xì)胞內(nèi)其他氨基酸或蛋白的合成[20]。天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、脯氨酸的碳骨架來源于糖類化合物[21]，同時(shí)脯氨酸在整個(gè)發(fā)酵過程中不能被酵母利用[22]，因此，雖然在三類大曲中這幾種氨基酸存在顯著差異，但是其初始濃度可能對釀造過程風(fēng)味影響相對較小。而甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的碳骨架雖能由糖類合成，但在發(fā)酵后期主要來自于原料中的此類氨基酸，這幾類氨基酸的差異可能影響發(fā)酵過程中風(fēng)味物質(zhì)的形成。組氨酸、亮氨酸、賴氨酸和精氨酸的碳骨架則幾乎不由糖類物質(zhì)合成，完全來自于原料中相應(yīng)的氨基酸，這幾類氨基酸的差異可能對酵母氮代謝產(chǎn)生影響并影響白酒品質(zhì)。纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸等氨基酸可作為高級醇的前體物質(zhì)同時(shí)也會(huì)影響乙醇的生成[23-25]。甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、亮氨酸、賴氨酸和精氨酸在三種大曲中均存在不同程度的差異性，可能導(dǎo)致三類大曲的功能存在差異并影響大曲的風(fēng)味及制酒發(fā)酵過程酵母氮代謝及風(fēng)味物質(zhì)代謝。

2.4 判別分析

為了進(jìn)一步了解游離氨基酸與大曲類別之間的關(guān)系，基于天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸和脯氨酸含量，利用xlstat軟件對56個(gè)拆倉大曲對大曲進(jìn)行判別分析，建立判別模型見圖5。由圖5可知，利用上述氨基酸能將白曲、黃曲和黑曲進(jìn)行區(qū)分，分別位于不同的維度，利用該模型對大曲進(jìn)行判別，判別正確率為86.79%。

圖5 不同類別大曲判別模型圖Fig.5 Discriminant model of different types of Daqu

3 結(jié)論

本研究結(jié)合感官評價(jià)分類結(jié)果對高溫拆倉大曲的游離氨基酸進(jìn)行分析比較，結(jié)果表明，大曲中能檢測出天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸和脯氨酸共18種氨基酸和活性物質(zhì)γ-氨基酸丁酸，色氨酸及瓜氨酸未檢出。黑曲游離總氨基酸含量最高（12.52 mg/g），黃曲次之（10.57 mg/g），白曲最低（9.65 mg/g）。白曲、黃曲、黑曲在氨基酸含量上存在顯著性差異（P＜0.05），其中天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和精氨酸在大曲中均隨著發(fā)酵程度升高而上升，這幾類氨基酸在黑曲中含量最高，在白曲中含量最低。谷氨酸則呈相反趨勢，在白曲中含量最高，黑曲中含量最低，同時(shí)白曲中的組氨酸含量也顯著高于黑曲和黃曲（P＜0.05）。除了上述幾種氨基酸，黃曲中的丙氨酸、苯丙氨酸含量顯著低于黑曲（P＜0.05），而黑曲的脯氨酸則顯著高于黃曲和白曲（P＜0.05）。進(jìn)一步運(yùn)用xlstat軟件基于上述18種氨基酸建立判別模型，可利用氨基酸濃度對大曲類別進(jìn)行有效判別。通過分析不同類別高溫拆倉大曲中游離氨基酸，為大曲分類評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的完善和提升提供理論基礎(chǔ)，并為研究大曲功能提供了新思路。