李俊豪，解 斌，景淑怡，宋宇琴，李六林

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西太谷 030800)

梨是中國(guó)主栽果樹之一，具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值。由于不合理灌溉和施肥等諸多因素，使得土壤次生鹽漬化問(wèn)題不斷加劇，土壤鹽漬化成為嚴(yán)重影響梨產(chǎn)業(yè)正常發(fā)展的主要非生物脅迫之一。

在鹽脅迫下植物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量自由基，從而使植物產(chǎn)生膜質(zhì)過(guò)氧化作用，膜透性增加，導(dǎo)致植物體內(nèi)穩(wěn)態(tài)被打亂，顯著抑制植物的正常生長(zhǎng)和發(fā)育[1]。植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，相應(yīng)形成了由酶促和非酶促組成的抗氧化防御系統(tǒng)，酶促反應(yīng)系統(tǒng)包括超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)等保護(hù)酶，以減輕或清除ROS的傷害，從而增強(qiáng)植物對(duì)逆境脅迫的耐受或抵抗能力[2]。目前研究認(rèn)為，利用外源物質(zhì)例如鈣和一氧化氮等對(duì)栽培作物進(jìn)行誘抗處理是提高其逆境耐受性的簡(jiǎn)便、有效、可行的方法之一[3]。鈣是植物必需的一種礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素，作為細(xì)胞內(nèi)生理生化反應(yīng)的第二信使偶聯(lián)胞外信號(hào)，在調(diào)控多種酶活性等過(guò)程中均具有重要的作用，外源“補(bǔ)鈣”可以改變植物生長(zhǎng)特性。已有研究表明，外源CaCl2可以緩解鹽脅迫[4]、干旱脅迫[5]和病菌侵染[6]等逆境對(duì)植物產(chǎn)生的傷害。一氧化氮(NO)也是植物體內(nèi)一種重要的信號(hào)分子，具有調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育、參與植物應(yīng)答各種逆境脅迫的生理功能。周萬(wàn)海等人[7]研究發(fā)現(xiàn)外源SNP處理能明顯緩解鹽脅迫對(duì)苜蓿幼苗根系生長(zhǎng)的抑制，李翠芳等[8]研究表明外源SNP能增強(qiáng)葉片抗氧化能力，改善葉質(zhì)。因此，研究鹽脅迫下外源SNP及CaCl2對(duì)梨愈傷組織的保護(hù)酶系統(tǒng)的調(diào)控作用，對(duì)于深入理解梨在生長(zhǎng)過(guò)程中抵抗逆境、減少活性氧積累的機(jī)制具有十分重要的意義。

組織培養(yǎng)具有實(shí)現(xiàn)植物遺傳背景一致，生長(zhǎng)環(huán)境可控的優(yōu)勢(shì)。因此，試驗(yàn)以組織培養(yǎng)杜梨和雪花梨愈傷組織為材料，研究?jī)烧弑Ｗo(hù)酶系統(tǒng)在響應(yīng)NaCl脅迫時(shí)的變化差異，同時(shí)使用外源CaCl2和NO處理，測(cè)定雪花梨在NaCl脅迫下保護(hù)酶的活性變化情況，以期明確CaCl2和NO在提高梨抗鹽性過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制，為外源鈣和硝普鈉(SNP)在逆境緩解效應(yīng)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為杜梨和雪花梨莖段愈傷組織。梨莖段于2017年5月采自山西省農(nóng)科院果樹研究所梨資源圃，并在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇生長(zhǎng)旺盛且均勻一致的杜梨和雪花梨愈傷組織，分別接種于含100 mmol/L NaCl[9]的MS培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接種30瓶。在NaCl處理的雪花梨愈傷組織培養(yǎng)瓶中，分別外施10 mmol/L CaCl2和一氧化氮供體100 μmol/L硝普鈉(SNP)，每個(gè)處理接種30瓶，分別于處理的0、6、12和24 h隨機(jī)采樣0.2 g，液氮速凍，保存于零下80 ℃的冰箱中備用。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

酶液制備參照安玉艷[10]等的方法，并略作修改：取保存的愈傷組織，液氮研磨，加1.6 mL預(yù)冷的提取液(50 mmol/L，pH 7.8 磷酸緩沖液)，于4 ℃下12 000 r/min離心20 min，上清液即為酶提取液，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

超氧化物歧化酶活性：氮藍(lán)四唑光還原法測(cè)定；過(guò)氧化物酶活性：愈創(chuàng)木酚顯色法；過(guò)氧化氫酶采用紫外線吸收法測(cè)定，具體參照高俊鳳[11]的實(shí)驗(yàn)方法；抗壞血酸過(guò)氧化物酶活性參照鄒琦等[12]的方法進(jìn)行。每個(gè)指標(biāo)重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。

使用Microsoft Excel 2013 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，使用SAS 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)超氧化物歧化酶活性的影響

SOD是植物體內(nèi)清除超氧自由基的關(guān)鍵酶類，可催化O2-生成H2O2和O2[13]。由圖1-A可知，在NaCl處理下，杜梨愈傷組織SOD酶活性呈先升高后降低的趨勢(shì)，在處理6 h時(shí)達(dá)到峰值，約為對(duì)照的1.5倍；雪花梨愈傷組織的SOD酶活性隨著NaCl脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)則呈降低趨勢(shì)，且均低于對(duì)照，在處理24 h時(shí)為對(duì)照的0.83倍，差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。

如圖1-A所示，在NaCl處理的同時(shí)施以CaCl2和SNP，對(duì)雪花梨愈傷組織SOD酶活性影響顯著。外源CaCl2和SNP均能改變SOD酶活性降低的趨勢(shì)，但呈現(xiàn)出不同的變化特征。在CaCl2處理組中，雪花梨愈傷組織SOD酶活性呈緩慢上升趨勢(shì)，在24 h達(dá)到峰值，約為單獨(dú)NaCl處理的1.22倍。在SNP處理組中，雪花梨愈傷組織SOD酶活性呈先升高后降低的趨勢(shì)，且在6 h時(shí)酶活即達(dá)到峰值，約為單獨(dú)NaCl處理的1.17倍。

通過(guò)上述結(jié)果可以看出，在NaCl脅迫下，CaCl2處理和SNP處理均能提高SOD酶活性，與單獨(dú)NaCl處理相比，差異顯著。而與CaCl2處理相比，SNP處理能更快激活SOD的酶活性，且酶活更高。說(shuō)明在NaCl脅迫下，經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)拟}和SNP處理能使SOD酶的活性增加，進(jìn)而增強(qiáng)雪花梨對(duì)NaCl脅迫的耐受性。

2.2 不同處理對(duì)過(guò)氧化物酶活性的影響

POD是膜脂過(guò)氧化防御系統(tǒng)的主要保護(hù)酶，通常用以反映植物抗鹽性強(qiáng)弱[14]。如圖1-B所示，在NaCl處理24 h內(nèi)，杜梨愈傷組織POD酶活性有顯著提高(P<0.05)，且其最大酶活在處理12 h時(shí)出現(xiàn)，約為對(duì)照處理的2.29倍；隨著NaCl脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，雪花梨愈傷組織POD酶活性呈降低趨勢(shì)，且均顯著低于對(duì)照(P<0.05)，在處理12 h時(shí)降至對(duì)照的0.38倍。表明在NaCl脅迫下，杜梨愈傷組織POD酶能在抗氧化酶系統(tǒng)中起到積極作用，而雪花梨愈傷組織POD酶受到一定程度破壞。

在NaCl處理的同時(shí)施以CaCl2和SNP，對(duì)雪花梨愈傷組織POD酶活性同樣影響顯著(圖1-B)。在CaCl2處理組中，雪花梨愈傷組織POD酶活性被快速激活，在處理6 h時(shí)達(dá)到峰值，為對(duì)照處理的1.35倍，為單獨(dú)NaCl處理6 h時(shí)POD酶活的1.97倍，且在處理12 h和24 h時(shí)均降低至對(duì)照水平，其與CaCl2處理下的SOD酶活相比，表現(xiàn)更為活躍。在SNP處理組中，雪花梨愈傷組織POD酶活性也在處理6 h時(shí)出現(xiàn)峰值，約為對(duì)照處理的1.33倍。

分析上述結(jié)果可以看出，與單獨(dú)NaCl處理相比，外施CaCl2和SNP可以使POD酶活性峰值出現(xiàn)時(shí)間提前，均出現(xiàn)在處理后6 h內(nèi)。表明在NaCl脅迫下，兩種外源物質(zhì)處理均可提高POD酶的活性，以此幫助雪花梨盡快適應(yīng)高鹽環(huán)境。

CK表示未經(jīng)NaCl處理的樣本，6、12、24 h表示NaCl處理對(duì)應(yīng)時(shí)間的樣本；不同小寫字母表示在5%水平上差異顯著(P<0.05)，圖2同圖1 NaCl脅迫下鈣和一氧化氮對(duì)梨愈傷組織SOD酶和POD酶活性的影響Note:CK indicates the samples without NaCl treatment in the figure,6 h,12 h and 24 h indicate the samples with NaCl treatment corresponding treated time; and different lowercase letters show significant difference at 5% level (P < 0.05), the other figures are as same.Fig.1 Effect of calcium and nitric oxide on superoxide dismutase activity andperoxidaseactivity in pear callus under NaCl stress

2.3 不同處理對(duì)過(guò)氧化氫酶活性的影響

CAT主要存在于乙醛酸循環(huán)體、線粒體和過(guò)氧化物體中，是催化并清除H2O2的重要酶類[15]。NaCl處理下杜梨和雪花梨愈傷組織過(guò)氧化氫酶活性的變化規(guī)律如圖2-A所示。在NaCl處理下，杜梨CAT酶活性在處理6 h時(shí)出現(xiàn)大幅下降，之后顯著升高(P<0.05)，其中在NaCl處理12 h時(shí)杜梨愈傷組織CAT酶活性顯著高于對(duì)照組和NaCl處理6 h時(shí)的酶活性(P<0.05)，分別是2.10倍和5.19倍；在處理24 h時(shí)，CAT酶活雖出現(xiàn)下降，但仍顯著高于對(duì)照組和處理6 h時(shí)的酶活性(P<0.05)。雪花梨愈傷組織CAT酶活性變化趨勢(shì)表現(xiàn)出與杜梨類似的趨勢(shì)，在NaCl處理12 h和24 h時(shí)，雪花梨愈傷組織CAT酶活性均顯著高于處理6 h時(shí)的酶活性，分別達(dá)3.22倍和2.52倍，但與對(duì)照處理酶活性相比，差異均未達(dá)顯著水平(P>0.05)。

在NaCl脅迫條件下，施加CaCl2和SNP的雪花梨愈傷組織與未施加的相比，其CAT酶活性變化存在顯著差異(P<0.05)(圖2-A)。結(jié)果顯示，在外源CaCl2和SNP處理下，雪花梨愈傷組織CAT酶活性被快速激活，在處理6 h時(shí)達(dá)到峰值，分別為對(duì)照處理的1.61倍和1.89倍，另外，分別也為單獨(dú)NaCl處理的4.72倍和5.76倍，隨后酶活性呈下降趨勢(shì)。CAT酶活性在經(jīng)鈣和一氧化氮處理后發(fā)生明顯改變，表明兩種外源物質(zhì)對(duì)雪花梨愈傷組織的CAT酶活性起到明顯促進(jìn)作用。

圖2 NaCl脅迫下鈣和一氧化氮對(duì)梨愈傷組織CAT酶和APX酶活性的影響Fig.2 Effect of calcium and nitric oxide on catalase activity and ascorbate peroxidase activity in pear callus under NaCl stress

2.4 不同處理對(duì)抗壞血酸過(guò)氧化物酶活性的影響

APX是抗氧化系統(tǒng)的關(guān)鍵解毒酶，能夠?qū)2O2分解為H2O。如圖2-B所示，經(jīng)NaCl處理不同時(shí)間后，杜梨和雪花梨愈傷組織APX酶活性變化規(guī)律存在顯著差異。在NaCl處理下，杜梨APX酶活性在處理6 h時(shí)未有明顯增加，在處理12 h時(shí)杜梨愈傷組織APX酶活性顯著高于對(duì)照組和處理6 h時(shí)的酶活性(P<0.05)，分別是3.51倍和2.55倍，在處理24 h時(shí)，APX酶活雖出現(xiàn)下降，但仍顯著高于對(duì)照組和處理6 h時(shí)的酶活性(P<0.05)。雪花梨愈傷組織APX酶活性變化趨勢(shì)與其SOD酶活性變化一致，在NaCl處理24 h內(nèi)，雪花梨愈傷組織APX酶活性顯著低于對(duì)照處理的APX酶活性(P<0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明，APX酶在耐鹽性杜梨適應(yīng)鹽脅迫的過(guò)程中發(fā)揮積極作用。

雪花梨愈傷組織在NaCl處理的同時(shí)施以CaCl2和SNP與單獨(dú)NaCl處理相比，其APX酶活性隨處理時(shí)間延長(zhǎng)變化趨勢(shì)存在差異(圖2-B)。結(jié)果顯示，外源CaCl2和SNP雖均未改變NaCl脅迫下雪花梨愈傷組織APX酶活性的下降趨勢(shì)，但減緩了下降的幅度。在施加CaCl2處理中，NaCl處理6 h時(shí)的APX酶活性與對(duì)照差異不顯著(P>0.05)，但為單獨(dú)NaCl處理的1.72倍；CaCl2處理12 h時(shí)的APX酶活性為不加CaCl2的4.9倍。在施加SNP處理6 h和12 h時(shí)的酶活性分別為單獨(dú)NaCl處理1.29倍和2.87倍。以上結(jié)果證實(shí)了在應(yīng)對(duì)高鹽環(huán)境時(shí)，外源鈣和一氧化氮對(duì)雪花梨所受損傷的緩解作用。

3 討論與結(jié)論

在逆境環(huán)境下，需氧生物活性氧代謝失調(diào)引起的自由基積累及自由基對(duì)大分子的破壞是植物組織遭受傷害的重要特征。超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶和抗壞血酸過(guò)氧化物酶等是植物評(píng)價(jià)抗性的重要指標(biāo)[16]。馬麗清等[17]對(duì)蘋果砧木的研究中發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫條件下，耐鹽種珠美海棠膜保護(hù)酶系統(tǒng)活性較高。研究結(jié)果顯示，杜梨愈傷組織在NaCl脅迫下，具有更加活躍的保護(hù)酶系統(tǒng)，而雪花梨的各類保護(hù)酶出現(xiàn)了不同程度的下降，說(shuō)明與雪花梨愈傷組織相比，杜梨愈傷組織具有更強(qiáng)的自我保護(hù)機(jī)制，以抵抗鹽生環(huán)境的傷害。

Ca2+是一種良好的生物膜保護(hù)劑，可以提高抗氧化酶活性，增強(qiáng)清除活性氧自由基的能力；NO作為一種信號(hào)分子可以激活抗氧化酶基因表達(dá)，能調(diào)節(jié)植物對(duì)逆境脅迫的適應(yīng)及反應(yīng)，促進(jìn)植物的防衛(wèi)反應(yīng)，增強(qiáng)抗逆性[18]。王策等[19]研究表明，10 mM CaCl2處理可通過(guò)促進(jìn)NaCl脅迫下酸棗幼苗植株體內(nèi)抗氧化酶活性的提高，增強(qiáng)植株對(duì)NaCl脅迫的適應(yīng)性。王延秀等[20]研究表明，SNP處理能夠激活水分脅迫下楸子幼苗的抗氧化酶系統(tǒng)，增強(qiáng)其耐旱性。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外源CaCl2和SNP的施用，雖對(duì)APX酶活性的影響不顯著，但可以有效提高鹽脅迫下雪花梨愈傷組織SOD、POD和CAT等抗氧化酶活性，對(duì)緩解鹽脅迫影響、促進(jìn)植株正常生長(zhǎng)發(fā)育有重要作用。從酶活變化趨勢(shì)看，在外源SNP處理下，NaCl脅迫下雪花梨愈傷組織SOD、POD和CAT均在處理6 h時(shí)顯著上升，之后下降；在外源CaCl2處理下，NaCl脅迫下雪花梨愈傷組織SOD呈逐漸上升趨勢(shì)，而POD和CAT變化波動(dòng)較大。說(shuō)明兩種外源物質(zhì)分別參與不同的抗氧化酶調(diào)控機(jī)制，緩解鹽脅迫傷害。這一結(jié)果可能與鈣和一氧化氮在植物體內(nèi)所發(fā)揮的信號(hào)作用密切相關(guān)，而具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步證實(shí)。