孫恒 蔣海越 馬世澤 劉霞 滕利

細(xì)胞三維培養(yǎng)更接近體內(nèi)環(huán)境，更有利于維持細(xì)胞表型或功能[1-3]。研究認(rèn)為，三維的培養(yǎng)環(huán)境和適當(dāng)?shù)臋C(jī)械刺激有助于組織工程軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的分泌[4-6]。其中，微載體空間利用率高，成為貼壁細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)最常用的技術(shù)，微載體三維培養(yǎng)方法可在快速擴(kuò)增軟骨細(xì)胞的同時(shí)保持軟骨細(xì)胞的表型[7-8]。

多種商用微載體已經(jīng)問(wèn)世，但大部分微載體不可降解，且多是實(shí)心結(jié)構(gòu)。后來(lái)出現(xiàn)了多孔微載體，可提供的表面積更大。微載體材料方面，也出現(xiàn)了可降解材料，在收獲細(xì)胞時(shí)無(wú)需胰酶消化，等材料自然降解即可。多孔微載體除了用作培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的載體，還可用作構(gòu)建可注射組織工程軟骨的支架。目前常用的商業(yè)化微載體中，滿足孔徑合適且可降解要求的僅有Cultispher微載體，其孔徑約為20 μm，有研究將其用于構(gòu)建組織工程軟骨[9]。但相比Cultispher微載體，我們制備的PLLA（左旋聚乳酸）多孔微球孔徑更大，約為25 μm，且孔隙率更高。本研究主要比較PLLA多孔微球和商業(yè)多孔微球Cultispher G對(duì)豬耳郭軟骨細(xì)胞體外三維培養(yǎng)的影響。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

DMEM 培養(yǎng)基（Hyclone，USA），胎牛血清（Gibco，USA），0.25%胰酶（Hyclone，USA），Ⅱ型膠原酶（sigma，USA），CCK-8試劑盒、DIO細(xì)胞膜綠色熒光探針（碧云天，中國(guó)）， RNeasy mini kit（QIAGEN，德國(guó)），Cultispher G 多孔微載體（PercellBiolytica，瑞典），PLLA 多孔微球（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所）。

RCCS 生物反應(yīng)器（Synthecon，USA），LightCyclerR480Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)（Roche，瑞士）。

1.2 豬耳郭軟骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)

3只健康長(zhǎng)楓雜交豬，雌雄不限，50～60日齡，體質(zhì)量6～8 Kg。無(wú)菌條件下切取雙側(cè)耳朵，于超凈臺(tái)分離出耳軟骨，剪切至1 mm3大小，加入5倍體積0.25%胰蛋白酶于37℃恒溫?fù)u床內(nèi)消化40 min，再加入5倍體積0.2%Ⅳ型膠原酶，37℃恒溫?fù)u床內(nèi)震蕩消化8 h。將消化的細(xì)胞懸液經(jīng)濾網(wǎng)過(guò)濾后，收集并離心，以2×104cells/mL的細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)皿中，每3天換液一次。細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%～90%融合時(shí)1∶3傳代，本實(shí)驗(yàn)選用第1代軟骨細(xì)胞。

1.3 微載體預(yù)處理

將PLLA、Cultispher G兩種多孔微球各150 mg用無(wú)鈣、鎂離子的PBS浸泡過(guò)夜，再用PBS洗滌兩次，高溫高壓滅菌30 min，再以DMEM培養(yǎng)基洗滌兩次，并浸泡于DMEM培養(yǎng)基中，置4℃冰箱中備用。

1.4 微球材料接種細(xì)胞

將軟骨細(xì)胞用綠色熒光探針染色（DIO）后，分別接種于兩種微球上（各4×107cells），加入到盛有RCCS的容器中，并補(bǔ)加 DMEM培養(yǎng)基至容器內(nèi)充滿液體為止。將RCCS反應(yīng)器置于培養(yǎng)箱中，于5%CO2、100%濕度、37℃常規(guī)條件下培養(yǎng)，調(diào)整RCCS容器旋轉(zhuǎn)速度，使微載體可以懸浮于培養(yǎng)容器中，隔天換液。接種后第1天待細(xì)胞貼附于微載體后，取樣品測(cè)量接種率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。接種率=微球上細(xì)胞數(shù)/總接種細(xì)胞數(shù)×100%。在體外培養(yǎng)7、21 d時(shí)以熒光倒置顯微鏡觀察微球形態(tài)和細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

1.5 掃描電鏡觀察

取兩組空白微球和體外培養(yǎng)7、21 d的細(xì)胞培養(yǎng)樣品，PBS清洗3次，加2%戊二醛固定24 h，隨后乙醇梯度脫水，再用乙酸異戊酯置換2次，二氧化碳臨界干燥器干燥后，真空噴濺鉑金離子，用SU-8010冷場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況并拍照。

1.6 CCK－8檢測(cè)細(xì)胞增殖

于培養(yǎng) 第 1、5、9、13、17、21 天時(shí)， 二組分別取1 mL 樣品，加入 100 μL CCK－8，培養(yǎng)箱孵育 2 h，熒光酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm吸光度值。

1.7 熒光定量PCR

培養(yǎng)14、21 d后，兩組分別取適量細(xì)胞－微球復(fù)合物，根據(jù)RNA提取試劑盒使用說(shuō)明提取RNA，取1 000 ng RNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)規(guī)則在pubmed上設(shè)計(jì)及驗(yàn)證（表1），由擎科公司合成（中國(guó)，北京）。qPCR測(cè)量通過(guò)Roche480系統(tǒng)完成。采用2^-△△Ct法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用 t檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種多孔微球形態(tài)檢測(cè)及接種率比較

電鏡和組織切片觀察兩種空白微球可見(jiàn)：PLLA多孔微球表面孔徑（25 μm左右）比Cultispher G（20 μm左右）略大，而且PLLA多孔微球孔隙率高，內(nèi)部孔徑也較Cultispher G微球均勻（圖1）。PLLA多孔微球的細(xì)胞接種率為（37.67%±2.33%），Cultispher G的接種率為（73.67%±3.53%）（圖 2）。Cultispher G 高于PLLA微球，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 微球形態(tài)和細(xì)胞生長(zhǎng)情況

培養(yǎng)7 d時(shí)（圖3），熒光倒置顯微鏡下看PLLA組細(xì)胞量少于Cultispher G組，電鏡觀察顯示細(xì)胞在微球表面呈單層分布，細(xì)胞形態(tài)呈不規(guī)則扁平狀，周邊舒展，生出偽足，緊附于微載體表面。PLLA組細(xì)胞未完全覆蓋多孔微球，Cultispher G組細(xì)胞已將多孔微球完全覆蓋。由于細(xì)胞外基質(zhì)的分泌，微球間產(chǎn)生連接，聚集在一起，但不太緊密。培養(yǎng)21 d時(shí)（圖4），熒光倒置顯微鏡下軟骨細(xì)胞數(shù)量在微球上進(jìn)一步增殖，電鏡下見(jiàn)細(xì)胞呈多層生長(zhǎng)，細(xì)胞外基質(zhì)也明顯增加，將微球完全包裹，細(xì)胞外基質(zhì)將多個(gè)微球緊緊包裹，形成不易分開(kāi)的整體。兩組材料均長(zhǎng)滿細(xì)胞，但PLLA組微球體積更大，細(xì)胞可黏附面積也更大。

圖1 空白微球電鏡和切片照片F(xiàn)ig.1 SEM and section photos of blank ball

圖3 軟骨細(xì)胞在PLLA、Cultispher G多孔微球生長(zhǎng)7 d時(shí)DIO熒光和電鏡照片F(xiàn)ig.3 DIO fluorescence and SEM photos of chondrocytes on PLLA and Cultispher G porous microspheres in the 7 days

2.3 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線對(duì)比

Cultispher G多孔微球組細(xì)胞接種量高，也更早趨于飽和，至2周左右后細(xì)胞總量不再增加；PLLA多孔微球組接種細(xì)胞量低，初始細(xì)胞總數(shù)少，到達(dá)細(xì)胞最大量時(shí)間較Cultispher G多孔微球組晚，但其細(xì)胞總數(shù)至觀察終點(diǎn)時(shí)仍在緩慢增長(zhǎng)。雖然PLLA多孔微球組開(kāi)始接種細(xì)胞量少，但是培養(yǎng)21 d后，細(xì)胞總數(shù)高于Cultispher G多孔微球組（圖5）。

2.4 對(duì)軟骨細(xì)胞分化的影響

培養(yǎng)21 d后，PLLA多孔微球組軟骨分化基因ACAN、COL2、SOX9、COMP 的表達(dá)量均高于 Cultispher G多孔微球組。軟骨肥大分化基因COL10表達(dá)量在培養(yǎng)14 d后兩組未見(jiàn)差異，培養(yǎng)21 d后PLLA多孔微球組表達(dá)量更高；COL1表達(dá)量在培養(yǎng)14 d后Cultispher G多孔微球組更高，而培養(yǎng)21 d后兩組未見(jiàn)差異（圖6）。

圖2 PLLA和Cultispher G多孔微球接種率（P＜0.05）Fig.2 Inoculation rates of PLLA and Cultispher G porous microsphere(P＜0.05)

圖4 細(xì)胞在PLLA、Cultispher G多孔微球生長(zhǎng)21 d時(shí)DIO熒光和電鏡照片F(xiàn)ig.4 DIO fluorescence and SEM photos of chondrocytes on PLLA and Cultispher G porous microspheres in the 21 days

圖5 軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Fig.5 Growth curve of chondrocytes

3 討論

微載體可分為多孔微載體和實(shí)心微載體，多孔微載體可以提供更大的表面積，有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的交換和吸收及細(xì)胞的生長(zhǎng)。Chung等[10]發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞不但在多孔微球上黏附和增殖多于無(wú)孔微球，且軟骨表型維持更好。與無(wú)孔微球相比，多孔微球細(xì)胞在微球內(nèi)部可避免外部機(jī)械力沖擊，更好地生長(zhǎng)[11]。另外，同樣體積多孔微球材料比無(wú)孔微球少很多，降解產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的影響也更小，多孔微球密度也較無(wú)孔微球低，在容器中更容易懸浮[12]。

微載體孔徑大小對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)也有影響，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在大孔微球上比小孔微球上增殖更快，且分布更均勻；小孔微球僅在表面長(zhǎng)出一層細(xì)胞，且死細(xì)胞比大孔微球多，因?yàn)樾】讖较拗屏藸I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的交流。

Cultispher G是明膠材料，細(xì)胞親和性好、黏附率高，細(xì)胞利用率高。合成聚合物材料和天然聚合物相比，細(xì)胞親和性弱，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也同樣顯示PLLA多孔微球細(xì)胞接種率低。細(xì)胞增殖方面可見(jiàn)PLLA多孔微球培養(yǎng)21 d后細(xì)胞增殖總量大于Cultispher G多孔微球，可能是因?yàn)镻LLA多孔微球孔徑和孔隙率高于Cultispher G多孔微球，細(xì)胞更易長(zhǎng)入多孔微球內(nèi)部，空間更大更有利于細(xì)胞的進(jìn)一步增殖。維持軟骨細(xì)胞表型方面，Cultispher G多孔微球不如PLLA多孔微球。培養(yǎng)21 d后，軟骨相關(guān)基因表達(dá)均為PLLA多孔微球更高。

本研究對(duì)比了軟骨細(xì)胞在兩種微球上的黏附、增殖和分化。PLLA微球雖然細(xì)胞親和性稍差，但總體優(yōu)于Cultispher G。后續(xù)將對(duì)PLLA多孔微球進(jìn)行表面修飾，改善其細(xì)胞親和性。

圖6 相關(guān)基因表達(dá)量Fig.6 Related gene expression