彭亦雩 王梓 袁慶越 谷平 畢曉萍

外傷、炎癥、腫瘤、先天性疾病等造成的眼眶、顱面骨缺損，修復(fù)困難，常導(dǎo)致嚴重的面部畸形和視力損傷等功能障礙。目前臨床眼眶和顱面骨缺損修復(fù)中，因自體骨和異體骨移植存在供給短缺、修復(fù)流程長和攜帶病毒隱患等缺點[1]，各種人工材料應(yīng)用廣泛，但鈦網(wǎng)、高密度聚乙烯等材料都不可降解，易誘發(fā)移位、感染和排斥等并發(fā)癥，導(dǎo)致植入物周圍應(yīng)激性纖維包裹形成[2-3]；可降解材料，如聚乳酸（PLA）、聚谷氨酸（PGA）等有機聚合物材料，由于植入機體后局部酸性降解產(chǎn)物堆積，機械性能下降過快，而且缺乏生物活性，不能誘導(dǎo)新骨再生，導(dǎo)致在材料降解后骨缺損依然存在，從而使其臨床應(yīng)用受到限制。

隨著材料學和組織工程技術(shù)的發(fā)展，利用可降解材料結(jié)合干細胞或間充質(zhì)細胞及生長因子構(gòu)建組織工程骨修復(fù)骨缺損成為可能[4-5]。我們將BMSC及BMP修飾的BMSC結(jié)合β-TCP制成組織工程骨，可以部分修復(fù)犬眼眶骨缺損[6-7]。但是組織工程骨臨床轉(zhuǎn)化仍然面臨諸多阻礙：①引入體外培養(yǎng)的種子細胞以及外源性的生長因子會不可避免地存在傳播疾病的風險；②支架與骨缺損斷端接觸填充缺損部位，理想狀態(tài)下材料降解應(yīng)與新骨生成的速率相匹配，但材料降解速率調(diào)控困難，骨修復(fù)過程中常因材料降解和新骨生成不一致而導(dǎo)致缺損部位坍陷，或因降解速率過慢而阻礙新骨生成；③干細胞往往是通過促進缺損部位炎癥反應(yīng)的激發(fā)和進展而促進新骨生成，但骨組織工程中植入的種子細胞常在進入體內(nèi)后因機體免疫反應(yīng)被很快清除而無法起效[8-10]，并存在癌變風險[11]。顱面骨為扁平骨，成年后仍有紅骨髓存在，可以提供足夠的自體干細胞。因此，眼眶骨等顱面骨再生修復(fù)可以通過植入具有骨引導(dǎo)及骨誘導(dǎo)性的修復(fù)材料來促進自體骨再生，同時可避免因干細胞移植而帶來的一系列倫理和安全問題。

骨組織由礦化的羥基磷灰石和膠原構(gòu)成，而膠原占骨基質(zhì)的17%～20%，在骨組織內(nèi)，骨單位為主要的構(gòu)成單位，寬度約為250 μm，中央被稱為哈弗氏管的血管通道由膠原蛋白形成的板層包裹[12]，骨小梁的原子力顯微鏡成像顯示，骨小梁表面的膠原纖維呈密集的編織結(jié)構(gòu)，羥基磷灰石結(jié)晶沿膠原纖維長軸每67 nm聚集成直徑為30～200 nm的礦物盤[13]，膠原纖維支撐能力較弱，羥基磷灰石脆性過高，二者結(jié)合能有效增強骨組織的機械性能。大量實驗表明，膠原具有良好的生物相容性和可降解性，對于缺損部位的骨質(zhì)沉積礦化也起到了不可或缺的作用[14-15]。膠原電紡絲經(jīng)過處理可維持其纖維形態(tài)長達3個月，且兼具生物相容性[16]。靜電紡絲技術(shù)逐漸成熟，其交聯(lián)方法的進步也使其在生物領(lǐng)域的應(yīng)用更加廣泛，并減少了交聯(lián)劑的毒性作用[17]，可用于模擬膠原蛋白獨特的三重螺旋結(jié)構(gòu)，制成近似原骨基質(zhì)的膠原電紡絲。實驗證明，膠原電紡絲可以支持間充質(zhì)干細胞的生長[18]，促進正常骨基質(zhì)的生物礦化過程[15]。模擬體液（SBF）具有與人體內(nèi)環(huán)境相似的無機鹽、酸堿度以及溫度，可使礦化顆粒沉積在材料表面，從而達到生物礦化的目的，使無機質(zhì)有效有序地與有機材料相結(jié)合[19-20]。礦化后材料將無機質(zhì)與有機材料有效復(fù)合，結(jié)構(gòu)更加接近天然骨組織，比其他單純的有機材料具有更好的骨誘導(dǎo)性和骨傳導(dǎo)性[21-23]。

因此，本研究擬利用電紡絲技術(shù)制備膠原纖維支架，通過生物礦化方法，構(gòu)建以膠原為基體材料攜帶無機礦化顆粒的仿生支架，用于引導(dǎo)大鼠顱骨標準骨缺損新骨再生，對其有效性和安全性進行評價，為臨床眼眶骨和顱面骨缺損修復(fù)提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

5周齡雄性SD大鼠 （10只），8周齡雌性SD大鼠（6只）。所有實驗程序均經(jīng)上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院動物研究委員會批準，動物使用許可號：SYXK（滬）2016-0016。

模擬體液（YL416s，上海優(yōu)培諾生物科技有限公司）；細胞活性/細胞毒性試劑盒（L3224，Thermo Fisher，美國）；αMEM 培養(yǎng)液 （Gibco， 美國）；EZPress RNA純化試劑盒（B0004D，上海海方生物技術(shù)有限公司）；PrimeScript RT 試劑盒（RR047A，Takara，日本）；POWERSYBR PCRmix 酶（4367659，Applied Biosystems，美國）；一抗 opn、bsp、ocn（Santa Cruz，美國）；山羊抗鼠 IgG 二抗（Sigma，美國）。

掃描電鏡 （SU8010，日立，日本）；口腔環(huán)鉆（Nouvag AG，Goldach， 瑞士）；Model E42 型萬能力學試驗機 （MTS， 美國）；Micro CT掃描機（SkyScan1076，Bruker， 德國）；MicroView 軟件（GE Healthcare，Waukesha，美國）。

1.2 制備膠原電紡絲

將豬Ⅰ型膠原溶于六氟異丙醇中制成紡絲液，終濃度為5%（w/v），將紡絲液注入5 mL注射器中，注射器金屬針頭內(nèi)徑為0.21 mm，連接10 KV左右的高壓靜電，室溫下進行靜電紡絲。紡絲工藝參數(shù)：流速為1.0 mL/h，接收裝置連接-2 KV的高壓靜電發(fā)生器，且與針頭的距離為10 cm，紡絲時間4 h。將紡好的靜電紡絲膠原膜置于真空干燥箱中，室溫下真空（1 Torr）干燥約24 h后取出，得到干燥的靜電紡絲膠原膜。將干燥的膠原膜置于戊二醛蒸汽中交聯(lián)24 h，得到測試用的膠原膜樣品，75%乙醇蒸氣熏蒸24 h滅菌，真空干燥24 h后使用。體外實驗相關(guān)的電紡絲膜交聯(lián)在圓形細胞爬片上，體外實驗所用支架材料裁剪成8 mm直徑的圓片。

1.3 膠原電紡絲的生物礦化

將膠原電紡絲利用不銹鋼環(huán)固定在6孔板皿底，加入2 mL模擬體液（SBF），37℃下震蕩水浴，在浸泡0周、2周和4周后，吸取皿中SBF，再用PBS輕柔吹洗3遍，吸凈液體后分別進行理化性能檢測。

1.4 材料理化性能檢測

1.4.1 靜電紡絲膠原膜的SEM表征

掃描電鏡下觀察靜電紡絲膠原的微觀結(jié)構(gòu)及形態(tài)。

1.4.2 力學性能測試

將濕態(tài)的靜電紡絲膠原膜貼附于離型紙上，一起裁剪成5 mm×30 mm的長條，其厚度由測厚儀測試3次，取平均值。將試樣連同離型紙一起固定在拉伸模具上，固定標距20 mm，待試樣和離型紙干燥自行分開后剪去離型紙，并用噴壺對試樣進行噴水潤濕后，采用配備25 N傳感器的Model E42型萬能力學試驗機以10 mm/min的速度進行拉伸測試，每個樣品測試3次，取平均值。

1.4.3 熱分析（TGA）表征

取1～3 mg靜電紡絲膠原膜置于坩堝內(nèi)，40℃～500℃范圍內(nèi)以10℃/min的升溫速率進行熱失重分析，粗測高溫灼燒后剩余無機鹽含量。

1.4.4 電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP）表征

取1～3 mg靜電紡絲膠原膜，加硝酸后用微波消解器進行微波消解，加入容量瓶內(nèi)，定容后，以ICP測試儀測試其礦化相關(guān)無機鹽成分（鈣、磷）的含量。

1.5 細胞培養(yǎng)及分組處理

取5周齡雄性SD大鼠的股骨和脛骨，以文獻[24]的方法提取BMSCs。將BMSCs用含10%胎牛血清和100 U/mL青霉素的αMEM培養(yǎng)液于37℃、5%CO2下培養(yǎng)。取第3代BMSCs以1×106cells/mL的密度接種于6孔板中，用于后續(xù)實驗。

BMSCs接種在礦化4周的生物膠原支架材料上繼續(xù)培養(yǎng)，為礦化后組；BMSCs接種單純PBS浸泡4周的膠原電紡絲，為礦化前組；單純相同細胞量的BMSCs設(shè)為空白對照組。觀察礦化前、后膠原電紡絲材料對細胞的影響。

1.6 生物毒性檢測

按LIVE/DEAD細胞活性/細胞毒性試劑盒配置檢測液，加入培養(yǎng)3 d的BMSCs中，避光反應(yīng)15 min后在鏡下進行熒光拍攝，確定細胞存活情況。

1.7 體內(nèi)生物相容性檢測

將生物礦化膠原支架制備為5 mm×5 mm均一大小的方形片狀，植入SD大鼠背部皮下，術(shù)后2周、4周、8周時連同周圍組織取材后行病理切片，HE染色，觀察材料降解情況。

1.8 體外成骨效果檢測

1.8.1 RT-PCR

將相同數(shù)量的 BMSCs（1×106cells/mL）分別接種在空白6孔板、礦化前膠原電紡絲交聯(lián)玻片、礦化后膠原電紡絲交聯(lián)玻片上，培養(yǎng)3 d后，用EZ-Press RNA純化試劑盒收集純化 BMSCs的總RNA，用PrimeScript RT試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄。采用POWERSYBR PCRmix酶在實時PCR檢測系統(tǒng)上對定量RT-PCR進行優(yōu)化分析。相關(guān)引物序列：骨橋蛋白（OPN）、骨唾液蛋白（BSP）、骨鈣素（OCN）和GAPDH，參照以前報道過的實驗方案[25]。

1.8.2 Western－blot

礦化前組、礦化后組和空白對照組的BMSCs培養(yǎng)7 d后，利用RIPA緩沖液和上樣緩沖液，在6孔板中提取蛋白。在80 V下電泳30 min，后轉(zhuǎn)120 V電泳30 min。電泳后轉(zhuǎn)膜，5%BSA室溫封閉1 h。一抗 OPN、BSP、OCN、β-actin 過夜孵育，TBST 緩沖液清洗3次，加入山羊抗鼠IgG二抗。最后，用顯影液潤濕膜表面，以天能-5200型圖像掃描儀對顯影后的膜進行掃描成像。利用β-actin灰度值對蛋白質(zhì)含量進行定量處理。

1.8.3 ALP及ARS染色

礦化前組、礦化后組、空白對照組的BMSCs培養(yǎng)7 d后，PBS沖洗吸凈，用4%多聚甲醛固定，室溫下用ALP染色緩沖液避光染色2 h。相同條件下培養(yǎng)14 d后，用4%多聚甲醛固定，用茜素紅ARS染液染色過夜，次日用ddH2O沖洗漂凈后拍照。

1.9 體內(nèi)成骨臨床研究

1.9.1 大鼠顱骨缺損修復(fù)實驗

為探討膠原電紡絲對大鼠顱骨缺損的體內(nèi)成骨作用，我們制作了6只大鼠顱骨缺損模型（8周齡雄性SD大鼠）。水合氯醛麻醉后，以口腔環(huán)鉆制作雙側(cè)5 mm直徑圓孔狀的大鼠顱骨缺損，將礦化前、后膠原電紡絲裁剪成直徑8 mm圓片，覆蓋缺損，并隔絕骨缺損周圍組織對缺損部位的嵌頓，為新骨生成提供充足的再生空間。6只大鼠左側(cè)顱骨缺損分別植入2種植入物，即礦化前膠原電紡絲（n=3）和礦化后膠原電紡絲（n=3），右側(cè)顱骨缺損為空白對照，將大鼠顱骨缺損部位骨膜及上皮組織逐層縫合。術(shù)后2周、4周、6周依次腹腔注射四環(huán)素25 mg/Kg、鈣黃綠素20 mg/Kg、茜素紅30 mg/Kg，熒光標記不同時期生成的新骨組織。

1.9.2 組織形態(tài)學檢測

術(shù)后8周時取材，去除周圍軟組織，剝離并取出顱骨，4%多聚甲醛浸泡。Micro CT行冠狀面和矢狀面掃描：管電流（250 μA）、X 線管電位（40 KV）、采樣區(qū)（直徑 5 mm）、體素分辨率（35 mm）。用 MicroView軟件檢測骨缺損的相對骨體積 （骨量/組織體積，BV/TV），骨表面積和骨體積之比（BS/TV），骨小梁數(shù)量（Tb.N）和骨密度（BMD）。掃描后，標本經(jīng)70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%乙醇梯度處理后，埋入聚甲基丙烯酸甲酯，進行梯度脫水，最后將標本切成300 μm冠狀切片，在不同的發(fā)光波長下（四環(huán)素405 nm，鈣黃綠素488 nm，茜素紅543 nm）由共聚焦相機拍攝圖像。

1.1 0 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用 Graphpad Prism 6和 Origin 8.0（Origin Lab，美國）軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以（x±s）表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 礦化膠原電紡絲電鏡及理化檢測結(jié)果

掃描電鏡觀察顯示，膠原電紡絲在浸泡2周后開始有礦化顆粒沉積，至4周已有大量分布均勻的礦化結(jié)晶顆粒形成（圖1A）。在礦化前、后對其進行拉力測試，利用Origin 8.0軟件進行繪圖，發(fā)現(xiàn)礦化后其斷裂伸長率存在部分下降，礦化2周后拉伸強度有所增加，但礦化4周后有所下降，考慮與膠原電紡絲部分降解有關(guān)（圖1B、1C）。熱分析表征結(jié)果顯示，高溫灼燒后剩余無機物含量與礦化時間成正比（圖2A）。ICP結(jié)果則顯示，礦化4周后鈣磷含量均高于礦化2周后材料和原材料，三者之間均存在顯著性差異，P＜0.05（圖 2B）。

2.2 生物毒性及生物相容性檢測

對礦化前、后膠原支架進行生物毒性檢測發(fā)現(xiàn)，其對BMSCs增殖無明顯影響（圖3A）。體內(nèi)生物相容性檢測結(jié)果證實，材料具有良好的生物相容性，無明顯異物反應(yīng)，8周時約90%的材料已經(jīng)降解 （圖3B），說明生物礦化后的膠原電紡絲具有良好的生物相容性和可降解性。

2.3 礦化膠原電紡絲的體外促成骨作用

BMSCs在不同材料上培養(yǎng)3 d后，提取RNA進行PCR檢測成骨相關(guān)mRNA表達量（圖4A），結(jié)果表明，礦化后組OPN、BSP、OCN表達量均高于礦化前組和空白對照組（P＜0.05）。其中，OPN含量礦化前組與空白對照組無顯著差異 （P＞0.05），BSP和OCN含量礦化前組高于空白對照組（P＜0.05）。

培養(yǎng)7 d后提取蛋白進行Western－blot檢測成骨相關(guān)蛋白表達量 （圖4B），結(jié)果顯示，礦化后組OPN、BSP、OCN相關(guān)蛋白含量均高于礦化前組與空白對照組，而礦化前組略高于空白對照組。

培養(yǎng)14 d后通過ALP染色和ARS染色 （圖4C）可見細胞在礦化前組、礦化后組的材料上成骨分化，礦化后組材料上的細胞成骨分化更加明顯。

上述結(jié)果顯示，礦化后材料不影響大鼠BMSCs在材料上的增殖，而且還明顯促進材料表面的成骨分化。

2.4 大鼠顱骨缺損的修復(fù)結(jié)果

8周時micro CT檢測結(jié)果顯示，植入礦化后膠原電紡絲的顱骨缺損絕大部分已修復(fù)，植入礦化前膠原電紡絲的顱骨缺損部分修復(fù)，空白對照未修復(fù)（圖 5A，5B）。 電鏡掃描結(jié)果（圖 5C-F）顯示，植入礦化后膠原電紡絲的顱骨和植入礦化前膠原電紡絲的顱骨在骨體積分數(shù)（BV/TV）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）、骨表面積和組織體積之比（BS/TV）、骨密度（BMD）參數(shù)上均明顯優(yōu)于空白對照，礦化后膠原電紡絲修復(fù)顱骨的BS/TV、BMD顯著優(yōu)于礦化前膠原電紡絲修復(fù)的顱骨。熒光標記的新骨生成量同樣證實，不同時間段內(nèi)新骨生成速率和總量上，礦化后膠原電紡絲明顯優(yōu)于礦化前膠原電紡絲和空白對照，證明其可以有效誘導(dǎo)骨再生（圖6）。

圖1 膠原電紡絲電鏡及力學檢測結(jié)果Fig.1 Electron microscopic scanning and mechanical analysis of mineralized collagen electrospin scaffold

圖2 TGA及ICP檢測膠原電紡絲無機鹽含量Fig.2 Determination of inorganic salt content in electrospinning collagen scaffold by TGA and ICP

圖5 顱骨缺損修復(fù)micro CT及定量分析結(jié)果 （*：P＜0.05；**：P＜0.005；***：P＜0.000 5）Fig.5 The micro CT scanning and quantitative analysis of rat calvaria defect reconstruction (*:P＜0.05;**:P＜0.005;***:P＜0.000 5)

圖3 生物礦化膠原電紡絲生物毒性及生物相容性檢測Fig.3 Biotoxicity and biocompatibility detection of mineralized collagen scaffold

圖4 膠原電紡絲體外促成骨效果Fig.4 The osteogenic effect of collagen scaffold in vitro

圖6 顱骨切片熒光顯影結(jié)果（鈣黃綠素標記為黃綠色，茜素紅標記為紅色，四環(huán)素標記為綠色）Fig.6 Results of fluorescence imaging of skull sections(calcein marked in yellow green,Alizarin red S marked in red,tetracycline marked in green)

3 討論

膠原已被廣泛應(yīng)用于組織修復(fù)中，但其單純的有機成分導(dǎo)致降解速率過快，支撐性能較弱，而這一問題可以通過靜電紡絲來優(yōu)化。以往也有實驗研究膠原電紡絲的制作，并初步探討將其應(yīng)用于骨再生、藥物輸送等方面的可行性[26]。我們通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，礦化前的膠原電紡絲可以一定程度上促進其在材料表面的成骨分化，證明膠原電紡絲具有良好的促成骨作用。眼眶骨等顱面骨為非承重骨，對于修復(fù)材料的支撐作用要求不同于四肢骨等長骨，因此膠原材料用于眼眶骨等非承重骨修復(fù)具有一定的可行性，機械性能的不足亦可通過交聯(lián)方法進行增強。

骨本質(zhì)上是由有機成分膠原和無機成分羥基磷灰石等為主要部分組成的。為了有效促進骨缺損修復(fù)，支架材料需盡可能地模擬天然骨質(zhì)的成分。通過浸泡模擬體液完成生物礦化是一種有效的方法，不僅可使膠原表面附著無機成分，而且較長時間的礦化浸泡還可使礦化顆粒有機地結(jié)合于材料內(nèi)部，避免了短時間浸泡礦化后礦化成分易被沖洗剝離的缺陷[27-28]。本研究表明，經(jīng)SBF浸泡4周后，膠原電紡絲表面形成大量均勻分布的顆粒，形態(tài)上呈球形、簇狀，與礦化顆粒外形相符；TGA實驗證實浸泡周期延長，高溫灼燒殘存無機鹽成分升高；ICP實驗進一步證明浸泡4周后鈣磷等元素明顯升高，無機鹽成分中含有磷酸鈣等礦化顆粒，證明SBF浸泡可以有效生物礦化。

本研究還發(fā)現(xiàn)，礦化后的膠原電紡絲不影響B(tài)MSC在材料上的增殖，而材料在植入大鼠皮下8周后基本上完全降解，且周圍組織無明顯炎癥反應(yīng)，這與目前已有的有關(guān)于礦化膠原電紡絲的實驗結(jié)論一致，證實了礦化膠原電紡絲的生物安全性[18]。

體外成骨檢測顯示，礦化后膠原電紡絲體外促成骨能力優(yōu)于礦化前組和空白對照組。結(jié)合ICP檢測鈣、磷元素含量可以看出，SBF浸泡使得材料由表及里充分礦化，有機成分與無機成分有效結(jié)合，再加上靜電紡絲模擬天然膠原纖維形態(tài)，材料成分和結(jié)構(gòu)都接近自體骨，能夠提供優(yōu)良的成骨外環(huán)境，有效誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞成骨分化。大鼠顱骨缺損修復(fù)實驗結(jié)果表明，礦化后膠原電紡絲可明顯加快骨重建的進程。定量分析表明，植入礦化后膠原電紡絲的顱骨和植入礦化前膠原電紡絲的顱骨在骨體積分數(shù)（BV/TV）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）、骨表面積和組織體積之比（BS/TV）、骨密度（BMD）參數(shù)上明顯優(yōu)于空白對照，礦化后膠原電紡絲修復(fù)顱骨的BS/TV、BMD顯著優(yōu)于礦化前膠原電紡絲修復(fù)的顱骨。此外，四環(huán)素、鈣黃綠素和茜素紅熒光標記新骨生成，進一步證實礦化后膠原電紡絲在不同時間段內(nèi)新骨生成速率和總量上明顯優(yōu)于礦化前膠原電紡絲和空白對照。證明了生物礦化膠原電紡絲能夠有效引導(dǎo)骨再生，促進顱骨缺損修復(fù)。

本實驗中，我們應(yīng)用單純膠原電紡絲覆蓋在大鼠顱骨缺損表面，既可隔絕周圍軟組織的嵌頓，又可作為引導(dǎo)骨再生的支架來修復(fù)骨缺損。在未引入外源性干細胞的條件下，利用骨缺損周圍的內(nèi)源性干細胞和間充質(zhì)細胞等修復(fù)顱骨缺損，避免了引入外源性干細胞的疾病傳播和干細胞癌變的風險[29-30]。顱面骨作為一種特殊的成年后仍攜帶紅骨髓的骨質(zhì)，在修復(fù)過程中也可以提供一定量的干細胞。顱面骨缺損在具有良好骨引導(dǎo)和骨誘導(dǎo)性能的材料支持下可以再生修復(fù)。

綜上所述，礦化膠原電紡絲支架作為一種將有機無機材料充分結(jié)合的復(fù)合支架，能夠在體外促進成骨分化，在不依賴種子細胞的條件下引導(dǎo)體內(nèi)新骨生成，修復(fù)大鼠顱骨缺損，是一種具有廣闊前景的成骨材料，其引導(dǎo)性骨修復(fù)效果可能與膠原電紡絲與自體骨膠原纖維相近的形態(tài)，以及SBF浸泡誘導(dǎo)材料充分礦化形成與自體骨相近的成骨環(huán)境有關(guān)。