彭輝 肖仁斌 王江濤

[摘要]目的 探討Keap1/Nrf2/HIF-1α通路在宮頸癌患者中的表達及臨床意義。方法 選擇2017年3月～2018年10月江西省萍鄉(xiāng)市湘雅萍礦合作醫(yī)院治療的40例宮頸癌患者作為研究對象，所有患者均行手術治療，術中切除病灶組織及癌旁組織，獲得新鮮標本。采用免疫組織化學法測定獲得宮頸癌組織及癌旁組織的低氧誘導因子-1α（HIF-1α）、NF-E2相關因子2（Nrf2）、Keap1陽性率。采用反轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）技術測定Keap1-Nrf2-HIF-lα基因通路表達量。結果 宮頸癌組織中的HIF-1α、Nrf2、Keap1陽性率，均高于癌旁組織（P<0.05）。免疫組化下Nrf2主要表達于宮頸癌細胞核內，部分位于胞質內，而HIF-1α、Keap1在宮頸癌組織中多表達于細胞胞質內。宮頸癌組織中的Keap1/Nrf2/HIF-1α基因通路表達量，高于癌旁組織（P<0.05）。結論 Keap1/Nrf2/HIF-1a通路在宮頸癌中呈表達，可能參與了宮頸癌疾病發(fā)生和發(fā)展的過程。

[關鍵詞]Keap1/Nrf2/HIF-1α通路;宮頸癌;免疫組織化學法;RT-PCR技術

[中圖分類號] R277.733.4? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）3（c）-0004-04

[Abstract] Objective To explore the expression and clinical significance of Keap1/Nrf2/HIF-1α pathway in cervical cancer. Methods A total of 40 patients with cervical cancer treated in our hospital from March 2017 to October 2018 were selected as subjects in this study. All the patients were treated by surgery. The lesion tissue and adjacent tissues were removed during the operation， and fresh specimens were obtained. The positive rates of hypoxia-inducible factor-1α （HIF-1α）， NF-E2 related factor 2 （Nrf2） and Keap1 in cervical cancer tissues and adjacent tissues were determined by immunohistochemistry. The expression of Keap1/Nrf2/HIF-1α gene pathway was determined by RT-PCR. Results The positive rates of HIF-1α， Nrf2 and Keap1 in cervical cancer tissues were higher than those in adjacent tissues （P<0.05）. Under immunohistochemistry， Nrf2 was mainly expressed in the nucleus of cervical cancer cells， partially in the cytoplasm; while HIF-1α and Keap1 were mainly expressed in the cytoplasm of cervical cancer tissues. The expression of the Keap1/Nrf2/HIF-1α gene pathway was higher in cervical cancer tissues than that in the adjacent tissues （P<0.05）. Conclusion The Keap1/Nrf2/HIF-1α pathway is expressed in cervical cancer and may be involved in the pathogenesis and development of cervical cancer.

[Key words] Keap1/Nrf2/HIF-1α pathway; Cervical cancer; Immunohistochemistry; RT-PCR technology

宮頸癌是臨床上常見的婦科惡性腫瘤，其病死率在所有婦女癌癥死亡率中居于第二位[1]。手術是宮頸癌患者首選治療方法，通過手術能切除病灶組織，延緩病情發(fā)展，但是由于宮頸癌發(fā)病早期臨床癥狀缺乏典型性，多數(shù)患者確診時已經是中、晚期，喪失手術時機[2]?；?、放療是手術的補充治療方法，雖然能改善患者癥狀，但是患者治療耐受性較差，會對機體免疫水平產生影響。臨床研究表明[3-4]：宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素過程，存在缺氧微環(huán)境，尤其是在腫瘤擴增中，缺氧更加利于腫瘤細胞代謝、凋亡抵抗，有助于新生血管的生成、腫瘤的轉移。低氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）是由缺氧誘導的、連接在促紅細胞生成素基因缺氧反應元件上的一個核因子;而目前抗氧化應激信號通路中以Keap1（Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1，Keap1）-NF-E2相關因子2（NF-E2 related factor 2，Nrf2）誘導機體的內源性抗氧化應答機制多見，但是在宮頸癌中的表達及臨床意義缺乏研究[5-6]。因此，本文采用隨機對照方法開展研究，探討Keap1/Nrf2/HIF-1α通路在宮頸癌患者中的表達，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選擇2017年3月～2018年10月江西省萍鄉(xiāng)市湘雅萍礦合作醫(yī)院治療的40例宮頸癌患者作為研究對象，年齡35～76歲，平均（67.85±5.66）歲;病程1～5個月，平均（2.35±0.45）個月。病理類型：鱗癌34例，腺癌6例。納入標準：①患者符合宮頸癌臨床診斷[7]，均經手術病理最終確診;②患者均行手術治療，均能耐受手術;③患者能遵醫(yī)完成相關檢查、治療者。排除標準：①合并精神異?；驘o法耐受手術治療者;②術前行放化療、免疫治療或其他方法治療者。選擇同期手術患者癌旁5 cm正常組織作為對照。本研究均得到我院醫(yī)院倫理委員會批準，患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑

抗人的HIF-1α（28b）單抗及?？故蟮亩蘒gG抗。即用型超敏免疫組化染色試劑盒及顯色試劑盒（Vector股份有限公司），兔抗人多克隆β-action（PR-0255）抗體和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（德國羅氏診斷有限公司）;RT-PCR試劑盒和膜（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.3方法

1.3.1 HIF-1α、Nrf2、Keap1陽性率的測定? 采用免疫組織化學法測定獲得宮頸癌組織及癌旁組織HIF-1α、Nrf2、Keap1表達。取手術過程中的病灶組織，向不同組織中加入蒸餾水與濃度為30.0%的H2O2，常溫下加入內源性酶并進行10 min滅活，PBS連續(xù)進行3次洗滌。將最終獲得的切片放置在0.01 M枸櫞酸鹽緩沖液中，加入生理鹽水控制溶液使pH最終為6。電爐加熱直到煮沸，間隔5 min后再次進行煮沸，常溫下冷卻，采用PBS完成2次洗滌，每次洗滌5 min，最后加入5% BSA封閉液并加入HIF-1α、Nrf2、Keap1蛋白（稀釋濃度為1：100）一抗，一滴。滴加完畢后進行3次PBS洗滌;在1 ml底物中加入HIF-1α、Nrf2、Keap1蛋白二抗一滴，混合后常溫下顯色，蘇木素復染后封片，倒置顯微鏡下觀察細胞數(shù)量，每份標本測定3次，取平均值[8-9]。

1.3.2判斷方法? 參考奧爾雷德評分標準，分別從細胞的陽性數(shù)量（1～4分）、染色強度（0～12分）完成免疫組化染色評分，總分16分，分值越高，陽性率越高[10-11]。

1.3.3 Keap1/Nrf2/HIF-1α基因通路表達量? 采用反轉錄-聚合酶鏈反應（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）技術測定Keap1/Nrf2/HIF-1α基因通路表達量。①設計引物，完成標本組織RNA的提取，并對獲得的標本完成逆轉錄反應、電泳。②Keap1/Nrf2/HIF-1α基因測定。采用PCR完成目的基因的擴增，以β-actin基因作為對照，設定總反應體50 μl（10×Reaction Buffer 5 μl）、dNTP（2.5 μmol/leach）的混合物2 μl、預測引物1（12.5 pmol/μl）、預測引物2（12.5 pmol/μl）、Actin引物1、Actin引物2各1 μl、逆轉錄反應液3 μl、Taq DNA Polymerase（5 U/μl）1 μl、ddH2O擴容至50 μl）。③擴增條件的設定。設定反應條件：30℃，10 min;42℃，30 min;99℃，5 min;5℃，5 min，連續(xù)進行35個循環(huán)，最后72℃下完成10 min延伸，10℃保存。擴增產物取5 μl在1.2%瓊脂糖（含EB 0.5 ng/ml）上電泳，紫外燈下觀察結果觀察結果并照相，吸光度掃描儀掃描后PCR條帶用軟件進行定量分析，每一個基因的表達量用β-actin內參進行標準化，結果為基因表達量HIF-lα對β-actin內參的比值，以上結果重復3次，取平均值[12]。

1.4統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗;計數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1不同組織中HIF-1α、Nrf2、Keap1陽性率的比較及宮頸癌組織免疫組化結果

宮頸癌組織中的HIF-1α、Nrf2、Keap1陽性率，均高于癌旁組織的陽性率（P<0.05）（表1）。

2.2不同組織中的Keap1/Nrf2/HIF-1α基因通路表達量情況

宮頸癌組織中的Keap1/Nrf2/HIF-1α基因通路表達量高于癌旁組織中的表達量（P<0.05）（圖2）。

3討論

臨床文獻報道，宮頸癌的發(fā)生與內源性氧化應激反應或細胞氧化過程中核黃素的轉運有關。從大的角度來說，氧化應激是指機體在受到體內外各種不良因素刺激時，打破體內氧化和抗氧化的平衡，引起體內細胞凋亡或異常增生，從而誘導某種疾病的發(fā)生、發(fā)展[13]。

目前，抗氧化應激信號通路中Keap1/Nrf2/HIF-1α通路最為常見。對于正常人而言，Keap1、Nrf2、HIF-1α均位于細胞質中，且表達水平相對較低或不表達，二者相結合處于穩(wěn)態(tài)。Nrf2蛋白在泛素蛋白酶體途徑介導下降會不斷降解，造成Nrf2表達量較低[14]。但是，當細胞發(fā)生致病因素，如：致瘤因素刺激時，HIF-1α、Keap1部分結構將會被修改，并且與Nrf2結構部位構象發(fā)生改變，持續(xù)引起Nrf2解離，造成信號通路失活[15]。本研究結果提示，宮頸癌組織中的HIF-1α、Nrf2、Keap1陽性率，均高于癌旁組織的陽性率（P<0.05）。免疫組化下Nrf2主要表達于宮頸癌細胞核內，部分位于胞質內，而HIF-1α、Keap1在宮頸癌組織中多表達于細胞胞質內，由此看出HIF-1α、Nrf2、Keap1在宮頸癌組織中陽性率較高，能參與疾病的發(fā)生、發(fā)展。HIF-1α在低氧狀態(tài)下表達水平較高，其基因結構活躍，能迅速對低氧做出反應，HIF-1α迅速積累，使細胞和機體能夠耐受低氧環(huán)境，這種對氧濃度變化的迅速的協(xié)同的反應，對于機體具有顯著的保護意義[16-17]。本研究結果提示，宮頸癌組織中的Keap1/Nrf2/HIF-1α基因通路表達量，高于癌旁組織的表達量（P<0.05）。臨床研究表明，細胞在缺氧條件下產生的HIF-1α能與靶基因結合，促進靶基因的轉錄，機理可能為：①能促進紅細胞生成素的編碼基因[18];②能影響血管內皮生長因子的表達;③能影響血紅素加氧酶、誘導型一氧化氮合酶的編碼[19];④能促進葡萄糖載體蛋白、糖酵解酶表達水平。因此，臨床上可以加強Keap1/Nrf2/HIF-1α通路水平測定評估患者預后，指導臨床治療[20]。但是，本研究中亦存在諸多不足，一方面，納入病例數(shù)較少，尚需要大樣本容量驗證;另一方面，進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理時存在較大的人為誤差，均需要進一步研究與探討。

綜上所述，Keap1/Nrf2/HIF-1α通路在宮頸癌中呈表達，可能參與了宮頸癌疾病發(fā)生和發(fā)展的過程。

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（收稿日期：2018-10-22? 本文編輯：孟慶卿）