向 玉， 劉玉林， 呂姣姣， 胡 容， 趙琪林**, 吳曉偉

(1.遂寧市中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科, 四川 遂寧 629000； 2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 呼吸科， 陜西 西安 710061)

表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)基因是晚期非小細(xì)胞肺癌患者較為常見的易突變基因，治療EGFR基因突變型肺癌患者的一線藥物為EGFR酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs)[1-3]。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，我國(guó)僅有少部分肺癌患者在選擇治療方式之前進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)，而導(dǎo)致這種情況的主要原因之一即腫瘤組織的獲取十分困難。因此，在不需要患者腫瘤組織的前提下，即可對(duì)EGFR基因的突變狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)，能夠有效提高我國(guó)肺癌患者EGFR基因狀態(tài)檢測(cè)率，有助于治療方案的制定。研究證實(shí)，肺癌患者外周血中腫瘤DNA水平高于健康人群，對(duì)血清與腫瘤組織樣本中EGFR水平進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)二者一致性高達(dá)60%～95%[4-6]。直接測(cè)序作為檢測(cè)基因突變狀態(tài)的“金標(biāo)準(zhǔn)”具有準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，近年來二代測(cè)序法逐漸應(yīng)用于腫瘤易感性以及個(gè)性化用藥中。為此，本研究以110例非小細(xì)胞肺癌患者為研究對(duì)象，采用二代測(cè)序測(cè)定非小細(xì)胞肺癌患者血清EGFR基因突變分布情況，并進(jìn)一步分析EGFR基因突變狀態(tài)與患者臨床特征及EGFR-TKIs治療效果的相關(guān)性，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料及分組

選取2016年12月～2017年6月收治的110例非小細(xì)胞肺癌患者為研究對(duì)象，根據(jù)二代測(cè)序結(jié)果，將其分為EGFR突變型患者(EGFR突變組，n=37)和EGFR野生型患者(EGFR野生組，n=73)。

1.1.1入組標(biāo)準(zhǔn) 經(jīng)細(xì)胞學(xué)或病理組織學(xué)確認(rèn)的晚期非小細(xì)胞肺癌，年齡20～65歲，性別不限，身體一般狀況評(píng)分(ECOG )為0～3分，存在至少有1處可測(cè)量病灶，入組前未接受過任何藥物治療及放療，臨床資料完整者。

1.1.2排除標(biāo)準(zhǔn) 合并主要器官疾病患者，血、尿、大便3大常規(guī)檢查異常者，存在肝腎功能、心功能嚴(yán)重障礙者，合并其他惡性腫瘤患者，臨床資料不全者。

1.2 研究方法

1.2.1樣本搜集與DNA提取 全部受試者均于治療前取5 mL外周靜脈血，將所取血樣在室溫狀態(tài)下靜置2 h，隨后置入低溫高速離心機(jī)中以3 000 r/min離心10 min，取上層血漿置2 mL凍存試管保存于-80 ℃冰箱中待測(cè)。血漿內(nèi)DNA提取采用血液試劑盒(DNeasy，德國(guó)Qiagen公司)說明書中要求進(jìn)行，采用超微量分光光度計(jì)(NanoDrop2000， ThermoFisher公司)進(jìn)行濃度及純度的檢測(cè)， DNA樣品OD260/OD280值為1.8～2.0。

1.2.2二代測(cè)序法測(cè)定EGFR基因突變EGFR基因序列參照GenBank公開發(fā)表的編號(hào)為AY588246的序列，引物設(shè)計(jì)應(yīng)用ABI Prism TM Primer Express軟件，引物序列見表1，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法分別對(duì)EGFR基因第18、19、20、21外顯子進(jìn)行擴(kuò)增。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化后，采用ABI Ion ProtonTM二代測(cè)序儀進(jìn)行雙向測(cè)序，應(yīng)用Chromas軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。對(duì)于發(fā)生突變或缺失的樣本，均采用反向引物進(jìn)行反向測(cè)序以驗(yàn)證。

表1 引物序列Tab.1 List of primer sequences

1.2.3觀察指標(biāo) (1)采用二代測(cè)序技術(shù)分析晚期非小細(xì)胞肺癌患者EGFR基因突變分布情況；(2)記錄并比較兩組受試者性別、年齡、癌癥類型、TNM分期以及吸煙史等臨床特征；(3)采用多元Logistic回歸分析非小細(xì)胞肺癌患者血清EGFR基因突變狀態(tài)與其臨床病理特征之間的相關(guān)性；(4)評(píng)價(jià)兩組受試者治療效果；(5)比較兩組受試者中位無疾病進(jìn)展生存期(progression free survival，PFS)，PFS的計(jì)算方式為患者從開始接受治療直至疾病進(jìn)展或尚未進(jìn)展的最后一次隨訪時(shí)間，本研究以2017年12月31日為隨訪截止時(shí)間；(6)采用電化學(xué)發(fā)光法應(yīng)用全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(Cobas e601，羅氏公司)檢測(cè)兩組受試者癌胚抗原(CA125)、鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原(SCC-Ag)、糖類抗原(CA19-9)及細(xì)胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)等血清腫瘤標(biāo)志物表達(dá)水平。

1.2.4療效評(píng)判標(biāo)準(zhǔn) 完全緩解：全部靶病灶均消失且無新病灶出現(xiàn)，腫瘤標(biāo)志物達(dá)到正常水平并持續(xù)4周以上；部分緩解：全部靶病灶最大徑之和降低不低于30%并為持續(xù)4周以上；疾病穩(wěn)定：全部靶病灶最大徑之和增加低于20%或降低不足30%；疾病進(jìn)展：出現(xiàn)新病灶或原有全部靶病灶最大徑之和增加超過20%?？傆行?(完全緩解+部分緩解)/患者總數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 EGFR基因突變

37例EGFR基因突變患者中共檢測(cè)出19del、L858R、L861Q、S768I及G719X 5種突變，其中19del、L858R兩種突變例數(shù)和所占比例較高，分別為17(45.95%)、16(43.24%)，L861Q、S768I、G719X這3種突變例數(shù)和所占比例分別為2(5.41%)、1(2.70%)和1(2.70%)。

2.2 一般資料和臨床特征

EGFR突變組中，女性患者所占比例明顯高于男性，腺癌患者所占比例明顯高于非腺癌患者，TNM分期為Ⅲb期患者所占比例明顯低于IV期患者，且有吸煙史患者所占比例較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；EGFR突變組與EGFR野生組患者在性別、癌癥類型、TNM分期及吸煙史比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.3 EGFR基因突變狀態(tài)與臨床病理特征的相關(guān)性

多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，EGFR基因突變狀態(tài)與非小細(xì)胞肺癌患者在癌癥類型、性別、TNM分期、吸煙史顯著相關(guān)(P<0.05)，與年齡無顯著相關(guān)性，見表3。

2.4 療效評(píng)價(jià)

治療后，EGFR突變組患者臨床有效率明顯高于EGFR野生組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.873，P<0.05)，見表4。

2.5 PFS

隨訪結(jié)果顯示，EGFR突變組PFS為(9.75±1.64)月，EGFR野生組患者PFS為(5.51±0.40)月，EGFR突變組PFS明顯高于EGFR野生組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 兩組非小細(xì)胞肺癌患者一般資料及臨床特征比較(n，%)Tab.2 Patient information, EGFR mutation status and clinical features

表3 EGFR基因突變狀態(tài)與臨床病理特征的多元Logistic分析Tab.3 Multivariate logistic analysis of EGFR gene mutation status and clinicopathological features

表4 兩組非小細(xì)胞肺癌患者臨床療效比較(n，%)Tab.4 The correlation between therapeutic effects and EGFR mutation status

2.6 血清腫瘤標(biāo)志物

EGFR突變組受試者CEA表達(dá)水平明顯高于EGFR野生組，CA125、CY21-1及SCC-Ag明顯低于EGFR野生組，兩組間血清腫瘤標(biāo)志物表達(dá)水平比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表5。

表5 兩組非小細(xì)胞肺癌患者血清腫瘤標(biāo)志物表達(dá)水平比較Tab.5 The correlation between Serum tumor markers and EGFR mutation status

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，在我國(guó)乃至全球，肺癌的發(fā)病率以及致死率均高居惡性腫瘤之首，肺癌患者中約有85%為非小細(xì)胞肺癌，該疾病嚴(yán)重威脅到人們的身體健康甚至生命[7]。以EGFR-TKIs為代表的靶向藥物對(duì)于存在EGFR基因突變的非小細(xì)胞肺癌患者具有顯著的治療效果，而EGFR基因野生型患者將無法從EGFR-TKIs藥物治療中獲益[8-9]。故而，為提高治療效果，臨床上對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者采取治療措施之前，應(yīng)該明確其EGFR基因突變狀態(tài)[10]。EGFR基因突變檢測(cè)的首選材料為患者的腫瘤組織，然而由于晚期非小細(xì)胞肺癌患者的腫瘤組織標(biāo)本主要是支氣管鏡活檢或肺穿刺的小標(biāo)本，標(biāo)本量無法滿足基因檢測(cè)的需要，此外，腫瘤異質(zhì)性可能會(huì)降低活檢腫瘤小標(biāo)本在反映腫瘤整體的基因突變的準(zhǔn)確性。近年來，研究人員提出可將血液樣本作為基因檢測(cè)的生物材料，大量研究證實(shí)，非小細(xì)胞肺癌患者外周血與組織樣本中EGFR突變檢測(cè)結(jié)果具有較高的一致性，提示采用二代測(cè)序法對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者血清中EGFR基因突變狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)具有較高的可行性[11-13]。

本研究采用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)110例晚期非小細(xì)胞肺癌患者血清EGFR基因突變狀態(tài)進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中EGFR基因突變患者約占33.64%(37例)，與同類型研究結(jié)論相一致[14-15]；在EGFR基因突變患者中，共發(fā)現(xiàn)5處突變位點(diǎn)，其中19del、L858R兩種突變所占比例較高分別為45.95%、43.24%，L861Q突變比例為5.41%，S768I與G719X兩種突變所占比例較低，均僅為2.70%、2.70%。臨床特征方面研究返現(xiàn)，EGFR基因發(fā)生突變患者中，女性所占比例高于男性，腺癌高于非腺癌、無吸煙史者高于有吸煙史者，TNM分期為Ⅲb期者低于IV期者，進(jìn)一步通過多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，EGFR基因突變狀態(tài)與非小細(xì)胞肺癌患者癌癥類型、性別、TNM分期、吸煙史顯著相關(guān)(P<0.05)，大量研究指出，EGFR基因是非小細(xì)胞肺癌患者的第一代驅(qū)動(dòng)基因，在亞裔、女性、腺癌以及不吸煙患者中突變發(fā)生率較高[16-17]，這一結(jié)論與本研究結(jié)果相一致。

國(guó)外研究團(tuán)隊(duì)指出，對(duì)于EGFR基因突變型的晚期非小細(xì)胞肺癌患者，采用EGFR-TKIs藥物進(jìn)行一線治療的臨床有效率和疾病控制率分別為40%和70%，且患者平均PFS超過9個(gè)月；另有研究證實(shí)，相較于常規(guī)化療方案，血清EGFR基因存在突變的非小細(xì)胞肺癌患者采用吉非替尼治療后的臨床效果以及無進(jìn)展生存期均明顯優(yōu)于接受標(biāo)準(zhǔn)化療方案更優(yōu)；研究人員通過對(duì)比分析晚期肺癌患者組織及血漿中游離DNA發(fā)現(xiàn)，二者在靶向藥物臨床治療效果的預(yù)測(cè)方面具有高度一致性[18-20]。本文研究發(fā)現(xiàn)，EGFR突變組患者臨床有效率以及PFS均明顯高于EGFR野生組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與上述同類型研究結(jié)論一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)EGFR基因突變患者與EGFR基因野生型患者間血清腫瘤標(biāo)志物表達(dá)水平具有顯著差異(P<0.05)，其機(jī)理有待進(jìn)一步分析。值得注意的是，二代測(cè)序法檢測(cè)血清中EGFR基因突變狀態(tài)并非適用于全部肺癌患者，這是由于血液腫瘤DNA的水平會(huì)受到腫瘤分期的影響，Ⅲ期及Ⅳ期患者血EGFR檢出率較高，而對(duì)于I、II期患者檢測(cè)靈敏度較低，這也是本研究選擇晚期非小細(xì)胞肺癌患者為研究對(duì)象的主要原因。

綜上所述，EGFR突變狀態(tài)與非小細(xì)胞肺癌患者性別、癌癥類型、腫瘤分期以及吸煙史等臨床特征以及臨床效果、腫瘤標(biāo)志物表達(dá)水平密切相關(guān)，二代測(cè)序法作為EGFR基因突變狀態(tài)的重要檢測(cè)方式，在對(duì)患者的臨床治療方面具有重要指導(dǎo)意義。