崔曉利 楊翰 鄔霞 鄭丹 尤振宇 黨麗云

結(jié)核病作為一種慢性傳染性疾病，是國(guó)家重大的民生健康問(wèn)題。據(jù)WHO[1]2018年發(fā)布的最新數(shù)據(jù)，2/3的結(jié)核病患者來(lái)自8個(gè)國(guó)家：印度(27%)、中國(guó)(9%)、印度尼西亞(8%)、菲律賓(6%)、巴基斯坦(5%)、尼日利亞(4%)、孟加拉國(guó)(4%)和南非(3%)，據(jù)估算的結(jié)核病發(fā)病數(shù)計(jì)算的中國(guó)利福平耐藥結(jié)核病患者數(shù)為7.3萬(wàn)例(占全球的13%)；根據(jù)已發(fā)現(xiàn)的肺結(jié)核患者數(shù)計(jì)算的中國(guó)利福平耐藥肺結(jié)核患者數(shù)為5.8萬(wàn)例；根據(jù)已發(fā)現(xiàn)的病原學(xué)陽(yáng)性肺結(jié)核患者數(shù)計(jì)算的中國(guó)利福平耐藥肺結(jié)核患者數(shù)為2.1萬(wàn)例。由于結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱(chēng)“藥敏試驗(yàn)”)耗時(shí)長(zhǎng)，患者常常得不到早期準(zhǔn)確的用藥而影響治療效果。耐藥基因檢測(cè)可以快速、準(zhǔn)確地得到患者的分子藥敏試驗(yàn)結(jié)果，有利于早期治療。筆者通過(guò)收集2017年西安市胸科醫(yī)院各類(lèi)型標(biāo)本分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性，并經(jīng)菌種鑒定為結(jié)核分枝桿菌菌種的利福平、異煙肼耐藥基因相關(guān)數(shù)據(jù)，回顧性分析不同性別、年齡組間耐藥基因突變率及其與表型藥敏試驗(yàn)的符合率。

資料和方法

一、一般資料

搜集2017年1—12月西安市胸科醫(yī)院對(duì)痰液、組織和胸腹腔積液等各類(lèi)型標(biāo)本進(jìn)行MGIT 960液體分枝桿菌培養(yǎng)的標(biāo)本27 867份，其中培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本5941份，陽(yáng)性率23.32%。排除重復(fù)患者標(biāo)本后，經(jīng)基因芯片法菌種鑒定，其中非結(jié)核分枝桿菌感染患者41例，結(jié)核分枝桿菌感染患者2677例。將2677例結(jié)核分枝桿菌感染患者的菌液納入本次研究。2677例結(jié)核病患者中，同時(shí)進(jìn)行MGIT 960 液體藥敏試驗(yàn)(MGIT 960試劑盒，批號(hào)6352668，BACTECTMMGIT 960操作系統(tǒng)，購(gòu)自美國(guó)BD公司)和耐藥基因檢測(cè)(結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)試劑盒，批號(hào)：01112171606，基因芯片雜交儀，購(gòu)自北京博奧生物科技有限公司)的患者958例，其中男622例，女336例。年齡分組為5～歲年齡組114例；21～歲年齡組466例；41～歲年齡組208例；61～83歲年齡組170例。

二、結(jié)核分枝桿菌對(duì)一線抗結(jié)核藥物的表型藥敏試驗(yàn)[2]

1.樣本準(zhǔn)備：取MGIT 960系統(tǒng)報(bào)陽(yáng)且菌種鑒定為結(jié)核分枝桿菌的菌液，報(bào)陽(yáng)當(dāng)天算作第0天，如果是第1、2天直接進(jìn)行藥敏試驗(yàn)接種，第3～5天則用滅菌生理鹽水按照1∶4稀釋(1 ml菌懸液，4 ml生理鹽水)，然后進(jìn)行藥敏試驗(yàn)接種。

2.含藥培養(yǎng)基準(zhǔn)備：于MGIT 960試劑盒取5只培養(yǎng)管，第一管標(biāo)記GC(空白對(duì)照)，其余4只管分別標(biāo)記Sm(鏈霉素)、INH(異煙肼)、RFP(利福平)、EMB(乙胺丁醇)；無(wú)菌操作下每管加入0.8 ml增菌劑；4 ml滅菌蒸餾水溶解藥物干粉，在相應(yīng)含藥標(biāo)記管加入100 μl相應(yīng)藥物；對(duì)照管內(nèi)加入0.5 ml 的1∶100倍稀釋菌懸液(0.1 ml菌液，10 ml滅菌生理鹽水)，其余4管含藥培養(yǎng)基加入未稀釋菌懸液0.5 ml，蓋緊螺旋蓋并混勻。

3.結(jié)果報(bào)告：將上述培養(yǎng)管放入MGIT 960系統(tǒng)內(nèi)培養(yǎng)，等待機(jī)器報(bào)告結(jié)果。

三、結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)[3-4]

取1 ml菌液加入1.5 ml離心管中，15 000×g離心5 min，棄上清；再加入1 ml生理鹽水渦旋振蕩后，15 000×g離心5 min，棄上清。向沉淀中加入50 μl核酸提取液并轉(zhuǎn)入帶磁珠的核酸提取管中，提取儀快速振蕩10 min，然后95 ℃水浴5 min，得到菌液核酸。每份標(biāo)本均進(jìn)行分枝桿菌屬探針序列(擴(kuò)增產(chǎn)物1)、ropB基因位點(diǎn)突變序列(擴(kuò)增產(chǎn)物2)、KatG和inhA基因位點(diǎn)突變序列(擴(kuò)增產(chǎn)物3)擴(kuò)增，擴(kuò)增程序按說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物于95 ℃變性10 min，立即置冰水中3 min，每份標(biāo)本分為2管，分別加入9 μl雜交緩沖液，其中一管加入3 μl擴(kuò)增產(chǎn)物1和2，另一管中加入3 μl擴(kuò)增產(chǎn)物1和3，吹吸混勻后從雜交盒的小孔處加入13.5 μl雜交混合物，置于50 ℃雜交儀中雜交2 h。按說(shuō)明書(shū)配置洗液1和洗液2，按已設(shè)置的洗滌程序洗片，讀片結(jié)束后置于甩干儀中甩干，然后把芯片放入掃描儀中自動(dòng)讀取數(shù)據(jù)。

結(jié)果判讀：待測(cè)樣品某一基因所有檢測(cè)位點(diǎn)均為野生型則報(bào)告該基因?yàn)橐吧停蝗舸郎y(cè)樣本某一個(gè)或幾個(gè)位點(diǎn)為突變型，則報(bào)告全部為突變型。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。比較不同性別間的耐藥基因突變率和不同年齡組間耐藥基因突變率。計(jì)數(shù)資料使用卡方檢驗(yàn)，當(dāng)樣本例數(shù)理論數(shù)T<1或n<40,采用Fisher確切概率法，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

結(jié) 果

一、958例結(jié)核分枝桿菌耐藥患者的基因突變情況

958份同時(shí)進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)與藥敏試驗(yàn)的菌株中，任一耐藥基因突變(ropB、katG、inhA)菌株的患者187例，突變率為19.52%。其中利福平耐藥基因ropB未突變832例(86.85%)，突變126例(13.15%)。異煙肼耐藥基因katG未突變823例(85.91%)，突變135例(14.09%)；inhA未突變926例(96.66%)，突變32例(3.34%) (表1)。

表1 958例患者耐藥基因各突變位點(diǎn)與突變率

二、不同年齡組和性別間基因突變情況

三、初、復(fù)治患者在3個(gè)耐藥基因不同突變位點(diǎn)中的分析

ropB、katG、inhA3個(gè)基因位點(diǎn)任一突變菌株的患者共187例,初治115例，復(fù)治72例。初、復(fù)治患者ropB基因突變位點(diǎn)大致相同，主要以531(C-T)為主(初治37/66，復(fù)治40/60)，且與表型藥敏試驗(yàn)符合率高(96.10%，74/77)；526(C-T)次之(初治6/66，復(fù)治9/60)。值得注意的是初治患者在511(T-C)位點(diǎn)突變率為15.15%(10/66)，而復(fù)治患者統(tǒng)計(jì)未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)突變(0/60)，兩者的511(T-C)位點(diǎn)突變率差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fisher確切概率法，P=0.001)；但511(T-C)位點(diǎn)突變的10例患者的表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果均為敏感(表3)。初、復(fù)治患者在異煙肼耐藥基因inhA、katG突變位點(diǎn)大致相同，以katG315(G-C)為主，與表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果的符合率分別為katG315(G-C)98.45%，315(G-A)66.67%，inhA15(C-T)90.63%(表4)。

表2 958例患者不同突變類(lèi)型及突變率在不同性別和各年齡組間的分布

注“-”為采用“Fisher確切概率法”；表中括號(hào)外數(shù)值為“突變率(%)”；括號(hào)內(nèi)數(shù)值分子為“突變例數(shù)”，分母為“檢測(cè)例數(shù)”

表3 ropB基因突變位點(diǎn)在初、復(fù)治患者中的分布及與表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)分析

注符合率=初復(fù)治耐藥患者例數(shù)/(初復(fù)治敏感患者例數(shù)+初復(fù)治耐藥患者例數(shù))

表4 katG、inhA突變位點(diǎn)在初、復(fù)治患者中的分布及與表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)分析

注符合率=初復(fù)治耐藥患者例數(shù)/(初復(fù)治敏感患者例數(shù)+初復(fù)治耐藥患者例數(shù))

討 論

分子檢測(cè)技術(shù)是近年來(lái)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥性的熱點(diǎn)技術(shù)[5-8]，不斷有新的技術(shù)應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌耐藥基因的檢測(cè)，主要以利福平與異煙肼3個(gè)耐藥基因片段(ropB、inhA、katG)檢測(cè)為主。

本研究分析了本院2017年的分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性菌液，通過(guò)對(duì)結(jié)核分枝桿菌的利福平與異煙肼3個(gè)耐藥基因片段(ropB、inhA、katG)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)利福平突變位點(diǎn)主要集中在ropB531(C-T)(8.04%，77/958)，異煙肼突變位點(diǎn)主要集中在katG315(G-C)(13.47%，129/958)，這與全國(guó)其他地區(qū)的突變率相似[9-10]。

在分析不同性別和不同年齡組間3個(gè)基因片段的突變率時(shí)，發(fā)現(xiàn)61～83歲年齡組耐藥基因突變率較高，所以這部分年齡階段應(yīng)當(dāng)成為重點(diǎn)普查的對(duì)象。

2014年劉亞芹等[11]與郝寶林等[12]，2018年單永梅等[13]通過(guò)對(duì)比基因芯片法與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)的耐藥性檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)耐藥基因檢測(cè)具有快速、敏感與特異度高的特點(diǎn)，對(duì)耐多藥肺結(jié)核患者快速篩查有著重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，基因片段的突變雖然特異度高，但細(xì)分到不同的突變位點(diǎn)時(shí)，不同位點(diǎn)的突變與表型藥敏試驗(yàn)的相關(guān)性是不同的，甚至某些位點(diǎn)突變[如ropB511(T-C)]在MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)時(shí)顯示并不耐藥，所以筆者認(rèn)為耐藥基因檢測(cè)還應(yīng)該結(jié)合具體的突變位點(diǎn)來(lái)進(jìn)行分析，不同位點(diǎn)與表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)性是不同的，相關(guān)性較差的突變位點(diǎn)應(yīng)該結(jié)合患者的藥敏試驗(yàn)結(jié)果與整體治療情況來(lái)進(jìn)行個(gè)體化治療。

綜上所述，ropB、katG、inhA3個(gè)耐藥基因位點(diǎn)與表型藥敏試驗(yàn)相符率高，但個(gè)別突變位點(diǎn)還是應(yīng)當(dāng)結(jié)合臨床治療情況進(jìn)行觀察與分析。耐藥基因突變率在不同年齡組人群中存在一定差異，對(duì)臨床診斷和選擇調(diào)整耐藥結(jié)核病患者治療方案有一定的指導(dǎo)意義。