洪創(chuàng)躍 李金莉 趙廣錄 桂靜 朱玉梅 楊爭(zhēng) 余衛(wèi)業(yè)

非結(jié)核分枝桿菌 (non-tuberculous mycobacterium,NTM)是指除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和麻風(fēng)分枝桿菌以外的其他分枝桿菌，其種類繁多，感染率從1990年的4.9%到2000年的11.1%，再到2010年的22.9%，疫情呈明顯上升趨勢(shì)，已逐步成為重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。由于NTM肺病的臨床癥狀和影像學(xué)表現(xiàn)與肺結(jié)核相類似，極易誤診為肺結(jié)核而行對(duì)NTM感染者無(wú)效的抗結(jié)核藥物治療[2]，導(dǎo)致患者病情遷延不愈。故早期行NTM菌種鑒定及分析本地區(qū)的菌種分布狀況，對(duì)臨床治療和公共衛(wèi)生預(yù)防具有重要意義。本研究對(duì)2013—2017年深圳市耐藥結(jié)核病監(jiān)測(cè)項(xiàng)目臨床分離株中的NTM菌株進(jìn)行菌種鑒定，以了解深圳市NTM的菌種分布狀況，為本地區(qū)NTM病的防治提供參考依據(jù)。

材料和方法

1.菌株和資料來(lái)源：搜集2013—2017年深圳市慢性病防治中心及各區(qū)慢性病防治院實(shí)施深圳市耐藥結(jié)核病監(jiān)測(cè)項(xiàng)目中的37 630例疑似肺結(jié)核患者，其中深圳市慢性病防治中心390例，各區(qū)慢性病防治院37 240例，登記患者基本信息、戶籍、既往史、抗結(jié)核藥物使用情況、復(fù)治患者記錄其既往用藥方案，同時(shí)收集患者痰液進(jìn)行痰分枝桿菌培養(yǎng)，將培養(yǎng)陽(yáng)性的8850株菌株送至深圳市慢性病防治中心進(jìn)行耐藥檢測(cè)。8850例患者中，男5893例，女2957例；初治患者8104例，復(fù)治患者746例；來(lái)自市中心患者2941例，來(lái)自郊區(qū)患者5909例；流動(dòng)人口患者8323例，戶籍人口患者527例。采用MPB64免疫膠體金法和對(duì)硝基苯甲酸(PNB) 生長(zhǎng)試驗(yàn)進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群與NTM的初步菌種鑒定，對(duì)初步鑒定為NTM的菌株進(jìn)一步菌種鑒定。同一例患者的多份菌株標(biāo)本按同一菌株處理。MTB質(zhì)控菌株(標(biāo)準(zhǔn)菌株)H37Rv(ATCC27294)、胞內(nèi)分枝桿菌(ATCC13950)、恥垢分枝桿菌(ATCC19420)、戈登分枝桿菌(ATCC14470)、堪薩斯分枝桿菌(ATCC12478)、鳥(niǎo)分枝桿菌(ATCC25291)、膿腫分枝桿菌(ATCC19977)、偶然分枝桿菌(ATCC6841)、龜分枝桿菌(ATCC35752)均來(lái)源于中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心，本實(shí)驗(yàn)室保存。

2.研究方法：(1)分枝桿菌培養(yǎng)：采用BACTEC MGIT 960 系統(tǒng)(美國(guó)BD公司)和改良羅氏法(培養(yǎng)基由廣東省結(jié)核病防治所提供)；(2)初步菌種鑒定：BACTEC MGIT 960采用MPB64免疫膠體金法，改良羅氏法采用PNB進(jìn)行生長(zhǎng)試驗(yàn)；(3)NTM菌種鑒定：膠體金法檢測(cè)陰性和PNB陽(yáng)性的菌株采用HAIN基因分型試劑盒(CM/AS) 和GT-Blot全自動(dòng)雜交儀(二者均由德國(guó)Hain Lifescience公司提供)進(jìn)行NTM菌種鑒定[3-4]；而膠體金法檢測(cè)陽(yáng)性和PNB陰性的菌株先進(jìn)行分子耐藥檢測(cè)[PCR擴(kuò)增儀, 由伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司提供]，檢測(cè)結(jié)果顯示為NTM的標(biāo)本則進(jìn)行上述菌種鑒定。

結(jié) 果

2.不同性別、年齡NTM患者的分布特征：366株NTM菌株中，男性NTM患者的檢出率[3.77%(222/5893)]明顯低于女性[4.87%(144/2957)](χ2=6.038，P=0.014)。男、女性NTM患者的分布均為25～34歲年齡組最多，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.213，P=0.271)。NTM感染患者主要年齡段集中在55歲以下的青壯年勞動(dòng)力人群中(84.15%，308/366)，具體見(jiàn)表2。

表2 2013—2017年深圳市各年齡組NTM患者在不同性別中的分布情況

注表中括號(hào)外數(shù)值為“患者例數(shù)”，括號(hào)內(nèi)數(shù)值為“構(gòu)成比(%)”

3.不同類型肺結(jié)核疑似患者中NTM患者的檢出率分布特征：初治NTM患者的檢出率[2.31%(187/8104)]明顯低于復(fù)治NTM患者[23.99%(179/746)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=810.400，P=0.000)。746例復(fù)治患者不同類型的NTM患者的檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=45.896，P=0.000)，具體見(jiàn)表3。

表3 746例不同類型復(fù)治疑似肺結(jié)核患者中NTM的檢出情況

注其他復(fù)治指返回患者、慢性患者以及初復(fù)治失敗以外的患者

4.不同地區(qū)來(lái)源及戶籍人口NTM患者的分布特征：來(lái)自市中心患者的NTM檢出率[8.87%(261/2941)]明顯高于來(lái)自郊區(qū)的NTM患者[1.77%(105/5909)](χ2=249.512，P=0.000)。城區(qū)流動(dòng)人口的NTM檢出率[8.77%(235/2681)]明顯高于郊區(qū)流動(dòng)人口的NTM患者[1.61%(91/5663)(χ2=248.418，P=0.000)。流動(dòng)人口的NTM檢出率[3.89%(324/8323)]明顯低于戶籍人口的NTM患者[7.97%(42/527)](χ2=20.778，P=0.000)。

5.NTM菌種分布情況：366株初步鑒定為NTM的菌株通過(guò)HAIN基因分型技術(shù)分離得到293株不同NTM菌種的菌株，分離率為80.05%。因鑒定方法的局限，73株超過(guò)其鑒定范圍未能鑒定到種。293株成功鑒定至種的菌株中，構(gòu)成比以膿腫分枝桿菌最高[41.64%(122/293)]，其次為鳥(niǎo)-胞內(nèi)分枝桿菌[22.18%(65/293)]、堪薩斯分枝桿菌[16.04%(47/293)]、戈登分枝桿菌[8.87%(26/293)]、偶然分枝桿菌[6.48%(19/293)]、龜分枝桿菌[1.37%(4/293))、瘰疬分枝桿菌[1.03%(3/293)]，另外還有7例為混合感染類型[2.39%(7/293)]。具體見(jiàn)表4。

討 論

NTM廣泛存在于自然界中，屬于條件致病菌，人與動(dòng)物皆可感染，氣候和地域可影響其感染情況和菌種分布[5]。由于無(wú)強(qiáng)制上報(bào)NTM感染者的政策，加上很多醫(yī)務(wù)人員對(duì)該病認(rèn)識(shí)不足，以及實(shí)驗(yàn)室鑒別NTM病存在一定技術(shù)困難，導(dǎo)致其報(bào)告感染率一直偏低。然而近年來(lái)隨著實(shí)驗(yàn)室技術(shù)的改進(jìn)、人們對(duì)NTM病認(rèn)識(shí)的提高，以及免疫抑制人群的增加，NTM的檢出率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[6]。然而NTM肺病的臨床體征、癥狀及影像學(xué)表現(xiàn)與肺結(jié)核相似，鑒別困難，極易誤診誤治，且兩病治療方案明顯不同，且多數(shù)NTM感染患者對(duì)多種藥物耐藥[7]，導(dǎo)致該病患者的病情遷延不愈，易誤診為耐藥結(jié)核病而得不到有效治療。另外，不同NTM菌種間的臨床表現(xiàn)也極其相似，進(jìn)一步導(dǎo)致臨床上誤診誤治。因此，NTM病在臨床上日益引起重視，要達(dá)到有效的診斷和治療，分枝桿菌的菌種鑒定顯得尤為重要。

表4 293株NTM菌株的菌種鑒定結(jié)果

本研究顯示，深圳市2013—2017年NTM菌株的檢出率為4.14%，低于2010年全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查(22.9%)[1]，以及廣州市(24%)[8]、紹興(11.2%)[9]和溫州地區(qū)(7.3%)[10]，而與2013年北京的調(diào)查結(jié)果(4.6%)[7]相近。2010年全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查[1]的結(jié)果顯示，NTM的檢出率呈逐年上升態(tài)勢(shì)，與湖南省的研究結(jié)果相似(從2012年的2.92%上升到2017年的11.14%)[11]；但也有地區(qū)的研究呈現(xiàn)相反的變化趨勢(shì)，如湖北省的NTM檢測(cè)率從2009年4.32%下降到2014年的1.73%[12]。而本研究結(jié)果顯示，2013—2017年深圳市NTM患者各年度檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與云南省[13]的研究結(jié)果相類似。提示不同地區(qū)和不同時(shí)間段NTM的檢出率趨勢(shì)是存在差異的，建議不同地區(qū)間的防控策略需要根據(jù)本地區(qū)疫情做出相應(yīng)的對(duì)策。

相關(guān)NTM檢出率地區(qū)差異的研究指出，男性患者的NTM檢出率高于女性患者[7,11]，可能與男性患者的基數(shù)較大、男性感染后受重視程度較高有關(guān)[7]。本研究中男性患者的基數(shù)也高于女性，但研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道卻不同：本研究中，女性患者的NTM檢出率高于男性患者，可能與本地女性患者對(duì)自身健康狀況更重視、經(jīng)濟(jì)更獨(dú)立，以及擔(dān)心傳染給子女，能夠積極早期診斷有關(guān)，但具體原因仍需進(jìn)一步流行病學(xué)調(diào)查。有研究顯示，NTM感染者主要集中在45歲以上，峰值在55～64歲，且男女性患者感染的年齡峰值各不相同[7,11,13]，而本研究中NTM感染者的年齡主要分布在54歲以下人群，且男女性患者分布峰值均在在25～34歲，可能與NTM感染除了與人口老齡化密切相關(guān)外，還與環(huán)境暴露、人口結(jié)構(gòu)有關(guān)。深圳地區(qū)屬于新發(fā)展勞動(dòng)密集型移民城市，人口構(gòu)成相對(duì)年輕化，以年輕勞動(dòng)力為主，老年人的基數(shù)相對(duì)較低，導(dǎo)致年長(zhǎng)者的NTM檢測(cè)率相應(yīng)降低；另外，年輕人由于活動(dòng)空間廣泛、接觸人員大量且復(fù)雜、密集場(chǎng)所時(shí)有光顧，環(huán)境暴露機(jī)會(huì)增加，可能是年輕NTM患者檢出率增加的原因。提示深圳地區(qū)應(yīng)密切關(guān)注青壯年NTM易感者，特別是女性易感者，以避免NTM感染年輕化對(duì)社會(huì)勞動(dòng)力產(chǎn)生重要影響，建議每年監(jiān)測(cè)深圳地區(qū)NTM流行趨勢(shì)，以掌握NTM重點(diǎn)易感人群的變化，積極做好相應(yīng)措施。

復(fù)治患者的NTM檢出率(23.99%)遠(yuǎn)高于初治患者(2.31%)，與楊成鳳等[12]的研究結(jié)果相似，可能與患者的就醫(yī)經(jīng)歷相關(guān)，由于NTM肺病與肺結(jié)核的臨床癥狀體征相似，誤診后抗結(jié)核藥物治療效果差，患者反復(fù)就醫(yī)而被登記為復(fù)治患者。提示應(yīng)將復(fù)治患者作為重點(diǎn)人群進(jìn)行NTM篩查，特別是耐藥肺結(jié)核患者。另外，本研究中復(fù)治患者中復(fù)發(fā)和初治失敗比例最高，進(jìn)一步說(shuō)明NTM患者的治療效果并不理想，存在較大的危害性。因此，對(duì)重點(diǎn)人群早期行菌種篩查、早期診斷及治療，可降低危害性，提高治療效果。

針對(duì)NTM患者來(lái)源地區(qū)的結(jié)果顯示，市中心區(qū)域患者的NTM檢出率要高于郊區(qū)及總體檢出率，而郊區(qū)患者的檢出率遠(yuǎn)低于總體水平，可能的原因如下：一是確實(shí)存在市中心的NTM感染率要高于郊區(qū)；二是地區(qū)間檢測(cè)技術(shù)水平的差異，特別是郊區(qū)實(shí)驗(yàn)室人員流動(dòng)相對(duì)頻繁，檢測(cè)水平無(wú)法穩(wěn)定；三是郊區(qū)醫(yī)療機(jī)構(gòu)存在漏檢漏報(bào)的情況。建議在制定全市防控策略時(shí)應(yīng)充分考慮郊區(qū)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力，加強(qiáng)技術(shù)督導(dǎo)和醫(yī)療合作。另外，本研究發(fā)現(xiàn)戶籍人口的NTM檢出率(7.79%)要高于流動(dòng)人口檢出率(3.89%)，郊區(qū)流動(dòng)人口患者較市中心流動(dòng)人口要高出1倍，但NTM的檢出率(1.61%)卻遠(yuǎn)低于城區(qū)流動(dòng)人口的檢出率(8.77%)，可能與市中心居住的流動(dòng)人口相對(duì)穩(wěn)定，且醫(yī)療條件較好、就醫(yī)更為方便有關(guān)；但也提示可能存在對(duì)流動(dòng)人口，特別是郊區(qū)流動(dòng)人口的監(jiān)測(cè)力度不足的情況，需要在將來(lái)的工作中投入更多的資源用于監(jiān)測(cè)郊區(qū)流動(dòng)人口的動(dòng)態(tài)。

NTM在不同地區(qū)的主要菌種分布存在差異，日本以鳥(niǎo)-胞內(nèi)分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌為主[14]，韓國(guó)以鳥(niǎo)-胞內(nèi)分枝桿菌和膿腫分枝桿菌為主[15]，英格蘭和威爾士以堪薩斯分枝桿菌為主[16]；國(guó)內(nèi)北京地區(qū)以鳥(niǎo)-胞內(nèi)分枝桿菌、戈登分枝桿菌和龜-偶然分枝桿菌為主[7]，上海地區(qū)以膿腫分枝桿菌、海分枝桿菌和鳥(niǎo)-胞內(nèi)分枝桿菌為主[17]，廣州地區(qū)則是以龜-膿腫分枝桿菌和鳥(niǎo)-胞內(nèi)分枝桿菌為主[8]。而本研究經(jīng)鑒定得到10種不同的NTM菌種中，構(gòu)成比占前3位者分別為膿腫分枝桿菌、鳥(niǎo)-胞內(nèi)分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌，與同處于華南地區(qū)的廣州市的結(jié)果相類似。因此，臨床上對(duì)疑似NTM患者應(yīng)盡早進(jìn)行菌種鑒定，以避免患者接受不恰當(dāng)?shù)呐R床治療。

本研究還發(fā)現(xiàn)，73株NTM菌株未能鑒定出菌種類型，可能由于技術(shù)限制所致。菌種鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)為測(cè)序技術(shù)[18]，但該技術(shù)較為復(fù)雜，成本昂貴，無(wú)法常規(guī)使用于臨床實(shí)驗(yàn)室。目前，可供臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)的商業(yè)化試劑盒主要有線性探針技術(shù)(如HAIN技術(shù))、DNA芯片技術(shù)和基因探針技術(shù)；上述技術(shù)相對(duì)于測(cè)序技術(shù)，具有使用方便、成本低的特點(diǎn)，但僅能鑒定出常見(jiàn)的16種NTM菌種類型[19-21]。程麗平等[22]學(xué)者采用PCR-反向斑點(diǎn)雜交法對(duì)NTM病的診斷價(jià)值進(jìn)行研究，該方法檢測(cè)NTM的敏感度為82.57%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為98.36%，并且該方法將菌種鑒定的類型增加到23種，提高了臨床診斷具體菌種的能力。因此，繼續(xù)開(kāi)發(fā)更全面的適用于臨床常規(guī)使用的鑒定技術(shù)是未來(lái)菌種鑒定發(fā)展的重要方向。

綜上所述，深圳市NTM的檢出率處于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，菌種分布以膿腫分枝桿菌、鳥(niǎo)-胞內(nèi)分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌為主，應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注女性、25～34歲易感染患者，開(kāi)展必要性的常規(guī)分枝桿菌菌種鑒定工作。