曾少玲，羅建華，容世清，曾凱，吳章麗

（湛江市林業(yè)科學(xué)研究所，廣東湛江 524037）

馬大雜種相思（Acacia mangium×A.auriculifor-mis）屬含羞草科金合歡屬，是以馬占相思（Acacia mangium）為母本，大葉相思（A.auriculifor-mis）為父本選育而成[1］，既有大葉相思極強(qiáng)的抗瘠薄特性及樹桿通直，分枝細(xì)小的特點(diǎn)，又具備馬占相思的速生、根瘤因氮涵養(yǎng)水源的性能，二者已作為較好的改良樹種在我國南方大量種植[2］，具有相當(dāng)顯著的生態(tài)效益、經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。馬大相思作為目前營造短周期工業(yè)用材林的主要樹種，是工業(yè)造紙、家具裝飾的好材料。由于其優(yōu)質(zhì)、速生、適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)，既可作為用材林和水土保持林樹種進(jìn)行純林種植，亦可作為多功能混交林進(jìn)行推廣應(yīng)用?，F(xiàn)在很多地區(qū)還把馬大相思與木麻黃混交營造防護(hù)林，馬大相思與桉樹混交營造經(jīng)濟(jì)林，其生長和防風(fēng)效果也得到明顯改善，另外高速公路的景觀林帶建設(shè)，國防道路兩旁的綠化、防噪聲和吸塵也應(yīng)用該樹種。開展馬大相思的組培快繁關(guān)鍵技術(shù)研究，對促進(jìn)該樹種的發(fā)展和林木良種選育等方面具有重要意義。目前，對馬大雜種相思離體快繁技術(shù)研究已有報(bào)道，且有效增殖倍數(shù)低、芽苗質(zhì)量較差、增殖芽可用于生根誘導(dǎo)的數(shù)量極少[3］，移栽存活率僅80.4%[4］。試驗(yàn)通過篩選及引進(jìn)的8 個(gè)無性系號的優(yōu)良單株，分別取其當(dāng)年新生枝條的帶腋芽莖段為外植體進(jìn)行組培快繁的研究，從影響外植體誘導(dǎo)、增殖、瓶內(nèi)生根、馴化與移栽等因素入手，對8 個(gè)馬大雜種相思的組培快繁開展了系統(tǒng)的研究，制定了從增殖倍率、生根率及瓶內(nèi)生根生產(chǎn)能力的綜合評價(jià)體系，篩選認(rèn)定最佳的可形成瓶內(nèi)生根生產(chǎn)能力并規(guī)模工廠化生產(chǎn)苗木的品號，為馬大雜種相思的良種選育及推廣種植奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植株來源和試驗(yàn)材料

從湛江市林業(yè)科學(xué)研究所收集和引種的馬大相思基因庫中，選出8 個(gè)無性系號，其中2 個(gè)無性系是從中國林科院引進(jìn)的10＃、73＃，另外6 個(gè)無性系號LK1、LK2、LK3、SK1、SK2、SK3。其中，LK1、LK2、LK3是從中國林業(yè)科學(xué)院熱帶林業(yè)研究所馬大雜種相思試驗(yàn)林中選取干型通直的抗風(fēng)優(yōu)樹的當(dāng)年生枝條的腋芽進(jìn)行扦插所獲得的單株，SK1、SK2、SK3 是從湛江森科公司取得的優(yōu)良無性系單株。從8 個(gè)無性系的優(yōu)良單株中分別取其當(dāng)年新生枝條的帶腋芽莖段為外植體進(jìn)行組培快繁研究。

1.2 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室溫度為28℃，光照約2500Lx，光照時(shí)間約14h/d，外植體誘導(dǎo)的第一個(gè)星期采用暗培養(yǎng)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 外植體消毒試驗(yàn)

8 個(gè)無性系的萌芽枝條由專人精心管理，采集萌芽前的2 周內(nèi)對萌芽條噴灑2 次2g/L 的多菌靈溶液。分別剪取8 個(gè)號的萌芽條，貼上標(biāo)簽，再用濕沙布包扎好拿回室內(nèi)，分頂端幼嫩枝段（含第1～2個(gè)腋芽）和中段（含3～5 個(gè)腋芽）及下段（6～7）三類型進(jìn)行外植體消毒[5]。用軟毛刷沾清水混合少量洗衣粉消毒芽條，清洗大部分的粉塵，再用自來水反復(fù)沖洗，然后把芽條按幼嫩部分、中段和下段部分分類放入裝有無菌水的培養(yǎng)瓶中。于無菌工作臺上，采用3 種方法對三類枝條分類處理消毒。方法1：先用70%酒精浸泡15s 后，用無菌水沖洗3～4 次，后0.1%升汞浸5～6min 后，用無菌水沖洗3～4 次。方法2：先用2%次氯酸鈉消毒2min，無菌水沖洗3～4次，再用0.1%升汞5～6min，無菌水沖洗3～4 次。方法三：0.1%升汞5～6min，無菌水沖洗3～4 次。

1.3.2 外植體誘導(dǎo)

以MS 為基本培養(yǎng)基，加入6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L，添加3%白糖、0.6%瓊脂，pH 值為5.8。外植體接種一次后即進(jìn)入增殖培養(yǎng)。將消毒后的外植體接種在MS 培養(yǎng)基上，每個(gè)處理接種50 瓶，每瓶接種1 株芽，重復(fù)3 次，15d 后統(tǒng)計(jì)存活率和出芽率。

1.3.3 增殖試驗(yàn)比較

外植體接種約20d 左右，沒有褐變和污染的外植體會從節(jié)間萌發(fā)出小芽，將誘導(dǎo)出的芽轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中開始擴(kuò)繁，轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)階段。增殖培養(yǎng)階段對馬大相思的8 個(gè)號的叢芽增殖的效果進(jìn)行如下的觀察和比較。

（1) 分裂素對增殖的影響

對初期表現(xiàn)較好的無性系號，以MS 為基本培養(yǎng) 基，分 別 添 加0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/L 的6-BA，附加NAA 0.1mg/L，探討細(xì)胞分裂素對增殖的影響。

（2）同一無性系號對不同基本培養(yǎng)基的影響

對初期表現(xiàn)較好的無性系號，以6-BA0.4mg/L+NAA0.1mg/L，分別搭配MS、B5、WPM、1/2MS4 種不同大量元素，觀察對分化的影響。

（3）相同培養(yǎng)基不同系號的增殖生長比較

采用基本培養(yǎng)基MS+6-BA0.4mg/L+NAA0.1mg/L，添加3%白糖、0.6%瓊脂，pH 值為5.8。觀察8 個(gè)無性系號每個(gè)月的有效芽數(shù)及計(jì)算增殖倍數(shù)，記錄生長表現(xiàn)。

1.3.4 生根配方的篩選及各個(gè)號生根率比較

以1/2MS 為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的IBA（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5、1.8、2.0）mg/L、NAA（0.2）mg/L 及NAA（0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0）mg/L、IBA（0.2）mg/L，設(shè)計(jì)16 種生根培養(yǎng)基，當(dāng)增殖材料達(dá)到50 瓶后，取1.5cm 長頂芽莖段接入生根培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接種20 個(gè)莖段，重復(fù)3 次，25d 后調(diào)查生根苗的生長情況并統(tǒng)計(jì)生根率。計(jì)算每個(gè)號的生根百分率。觀察瓶內(nèi)生根表現(xiàn)，作出綜合評價(jià)。

1.3.5 生根瓶苗的馴化和移栽

生根瓶苗在培養(yǎng)室15d 出根后，移到煉苗棚進(jìn)行10～15d 煉苗，洗凈根部的培養(yǎng)基后移栽到8cm×12cm 的經(jīng)消毒過的營養(yǎng)袋中，移栽基質(zhì)選擇黃心土：河沙按一定比例。移栽前淋透水，移栽后每周期用1.25g/L 的甲基托布津溶液消毒，兩周后轉(zhuǎn)入苗圃常規(guī)管理，移栽時(shí)對8 個(gè)號作好標(biāo)記，30d 后比較各個(gè)號的成活率和生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體消毒對初代培養(yǎng)的影響

2.1.1 不同無性系號的不同枝段外植體誘導(dǎo)效果比較

由表1 可知，外植體的消毒成功率與木質(zhì)化程度有關(guān)[6]，木質(zhì)化程度越高，污染率越高，新生頂芽內(nèi)生菌含量少。但枝條幼嫩，容易被消毒劑殺死。對8 個(gè)無性系的三種類型的枝段的消毒成功率進(jìn)行分析，中枝節(jié)段平均消毒成功率為26.5%、嫩枝節(jié)段平均消毒成功率為22.0%、老枝節(jié)段的消毒成功率為16.3%。三種枝段的平均腋芽分化率有一定的差異，其中中枝節(jié)段為53.8%、嫩枝節(jié)段為50%，老枝節(jié)段為47.2%。由此可總結(jié)出：枝條中上部半木質(zhì)化的莖段出芽率高[7]，且污染率低[8]，因而當(dāng)年生枝條第3～5 個(gè)腋芽莖段是馬大相思理想的外植體材料。

由表2 可知，不同無性系之間的外植體消毒成功率和腋芽分化率有一定差異，8 個(gè)馬大相思無性系的消毒成功率從高到低依次是SK1（30%）、10＃（27.3%）、SK2（25.3%）、73＃（22.7%）、LK1（19.3%）、LK2（16.7%）、LK3（16.0%）、SK3（15.3%），差異較大，最大的SK1（30%）比最小的SK3（15.3%）高14.7%。8 個(gè)馬大相思無性系的腋芽分化率有差異，從高到低依次是SK1（66.7%）、10＃（63.4%）、73＃（61.7%）、SK3（56.5%）、LK3（45.8%）、LK1（41.4%）、LK2（40.0%）、SK2（39.5%），超過60%的前3 個(gè)是SK1（66.7%）、10＃（63.4%）、73＃（61.7%），最高的SK1（66.7%）比最低的SK2（39.5%）高27.2%。

表1 不同無性系號不同枝段外植體的消毒及腋芽分化情況Table 1 Disinfection and axillary Bud differentiation of branches and segments of different asexual lines

2.1.2 不同消毒劑及組合對芽消毒效果的影響

選擇SK1 開展不同消毒劑消毒試驗(yàn)。由表3 可知，方法1 和方法2 的效果區(qū)別不大，而僅用0.1%升汞的成功率為15.0%。在使用兩種消毒劑時(shí)務(wù)必掌握好消毒時(shí)間，否則芽枝容易因過分消毒而被殺死。

2.1.3 外植體消毒時(shí)間對初代培養(yǎng)的影響

該試驗(yàn)以10＃ 無性系的中枝節(jié)段為外植體，以70%酒精+0.1%升汞的消毒方法，先用70%酒精浸泡15s,無菌水沖洗3 次后，再用0.1%升汞消毒。消毒時(shí)間分別設(shè)置為4、6、8、10min，各用無菌水沖洗5 次。從表4 可知，升汞消毒時(shí)間對外植體的污染率和褐變率影響非常明顯，消毒時(shí)間低于4min污染率達(dá)100%，消毒時(shí)間超過10min 后，成功率僅為12.9%。而消毒時(shí)間為6min 時(shí)，誘導(dǎo)成功率最高，誘導(dǎo)率達(dá)58.2%。所以外植體消毒以0.1%升汞為最理想的。

2.2 叢生芽誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)基的篩選

2.2.1 激素對增殖的影響

該試驗(yàn)以10＃無性系作為試驗(yàn)觀察。由表5 可知，固定NAA 為0.1mg·L-1，當(dāng)6-BA 為0.2mg/L 時(shí)，芽叢分化少，高生長明顯，參差不齊，芽數(shù)少；當(dāng)6-BA 為0.4mg/L 時(shí)，芽數(shù)多且粗，活力好，易操作；當(dāng)6-BA 為0.6mg/L 時(shí)，芽數(shù)較多，節(jié)間短，較難操作；當(dāng)6-BA 為0.8mg/L 時(shí)，芽數(shù)多且幼細(xì)，少量玻璃化，難操作；當(dāng)6-BA 為1.0mg/L 時(shí)，芽數(shù)多且幼細(xì)，玻璃化，質(zhì)量差，難操作。所以6-BA 最佳濃度以0.4mg/L 和0.6mg/L 為較適范圍。

2.2.2 同一無性系號對不同培養(yǎng)基的影響

選用10＃開展無性系供試驗(yàn)。由表6 可知，三種培養(yǎng)基對芽的增殖倍率有明顯的差異，其中MS 培養(yǎng)基對促進(jìn)芽分化效果最顯著，培養(yǎng)4 個(gè)月時(shí)已進(jìn)入旺盛增殖期，倍率為2.95，6 個(gè)月為3.87；其次是B5，6 個(gè)月時(shí)為1.61；最差為WPM，6 個(gè)月才1.24。用MS 作為大量元素適合分化。

2.2.3 相同培養(yǎng)基不同系號的增殖生長比較

由表7 可知，8 個(gè)號的繼代增殖倍率有區(qū)別，其中6 個(gè)月時(shí)增殖倍率從高到低依次是：SK1（3.99）、10＃（3.87）、73＃（3.53）、LK1（2.48）、LK2（2.37）、LK3（2.35）、LK3（2.34）、SK2（2.32）。所以從增殖倍率看，以SK1、10＃、73＃3 個(gè)號的增殖效果較好。

表3 同一無性系號不同消毒劑消毒效果比較Table 3 Comparison of disinfection effect of different disinfectants with the same asexual number

表4 外植體消毒時(shí)間對初代培養(yǎng)的影響Table 4 Effect of time of exfoliation on primary culture

表2 同一無性系號枝段外植體的消毒及腋芽總體分化情況Table 2 Disinfection and general differentiation of axillary buds of the same asexual branch)

表5 不同6-BA 對芽增殖的影響Table 5 Effect of different 6-BA on Bud proliferation

表6 同一無性系不同大量元素增殖效果比較Table 6 Comparison of proliferative effects of the same asexual lines and different quantities of elements

2.3 不同激素水平對瓶內(nèi)生根的影響

選用SK1 無性系供試驗(yàn)。馬大相思的組培瓶芽擴(kuò)繁到一定的數(shù)量后，就開始轉(zhuǎn)入生根試驗(yàn)。將長度為1～1.5cm 的芽接種于生根培養(yǎng)基中，30d 后觀察根數(shù)及生長情況。由表8 可以看出：馬大相思的生根激素水平以IBA0.6-1.2+NAA0.2 或NAA 0.6-1.2+IBA0.2 的范圍比較合適。激素濃度太底，生根時(shí)間很慢，生出的根幼細(xì)。隨著激素濃度的升高，生根時(shí)間會減慢，會促進(jìn)根部愈傷組織的產(chǎn)生，容易出現(xiàn)畸形苗，苗木生長不正常，甚至?xí)Ｖ股L。NAA 和IBA 對馬大相思的生根效果相差不大，只是使用濃度的高低對生根影響較大。通過比較，接種20d 時(shí)，生根培養(yǎng)基以V6：1/2MS+IBA1.2mg/L+NAA0.2mg/L和V13：1/2MS+NAA1.2mg/L+IBA0.2mg/L 的生根效果最好，生根率都達(dá)96%，生根數(shù)平均達(dá)3.6 條以上。

2.4 生根瓶苗的馴化和移栽試驗(yàn)

馬大相思的生根瓶苗在培養(yǎng)室15d 出根后，在煉苗棚的自然光下進(jìn)行煉苗10～15d，注意控制光照強(qiáng)度，以免光線太強(qiáng)灼傷組培苗。當(dāng)馴化10～15d時(shí)，葉片呈深綠色、羽葉開展時(shí)，苗木比較健壯時(shí)從培養(yǎng)瓶中取出小苗洗干凈基部培養(yǎng)基；之后移栽到8cm×12cm 的經(jīng)消毒過的營養(yǎng)袋中，移栽基質(zhì)選擇黃心土，移栽前淋透水，移栽后每周用1.25g/L 的甲基托布津溶液消毒，兩周后轉(zhuǎn)入苗圃常規(guī)管理，移栽時(shí)對8 個(gè)號作好標(biāo)記，30d 后比較各個(gè)號的成活率和生長情況。移栽后注意保濕遮蔭，注意水肥和病蟲害的控制。由表9 可知：各個(gè)號的平均成活率有一定的差異，超過80%是10＃（87.3%）、73＃（83.5%）、SK1（87.8%），其它號為75%左右。

由表10 可知：將組培苗移入已設(shè)定的4 種基質(zhì)中，分別是黃心土：沙（1：0、1：1、2：1、3：1），一個(gè)月后調(diào)查成活率，將各個(gè)基質(zhì)的成活率取平均值，其中以1：1 的成活率最高，達(dá)88.4%；其次是2：1（84.4%）；最低的為1：0（68.2%）。所以基質(zhì)選擇以黃心土：沙為1：1 效果是最合適的。

表8 不同激素水平對馬大相思瓶內(nèi)生根的影響Table 8 Effects of Different Hormone Levels on Roots in Acacia Ma Bottle

表9 8 個(gè)無性系號移栽成活率比較Table 9 Comparison of the survival rate of 8 asexual transplanting numbers

表10 8 個(gè)號的各種基質(zhì)比例的平均成活率統(tǒng)計(jì)Table 10 Statistics on the average survival rate of various matrix ratios for 8 numbers

表7 同一培養(yǎng)基、不同無性系號的增殖效果比較Table 7 Comparison of proliferative effects of the same medium and different asexual lines

2.5 8 個(gè)馬大相思無性系號試管內(nèi)的綜合評價(jià)

2.5.1 8 個(gè)無性系號7 個(gè)月時(shí)的增殖比較

由表11 可知，8 個(gè)號的繼代增殖倍率有區(qū)別，其中6 個(gè)月時(shí)增殖倍率從高到低依次是：SK1（3.99）、10＃（3.87）、73＃（3.53）、LK1（2.48）、LK2（2.37）、SK3（2.35）、LK3（2.34）、SK2（2.32）。由表8可知：外植體增殖到7 個(gè)月時(shí)的繼代瓶數(shù)由高到低依次是：SK1（463 瓶）、10＃（418 瓶）、73＃（286 瓶），SK3（26 瓶）、LK1（20 瓶）、SK2（18 瓶）、LK2（16 瓶）、LK3（10 瓶）、所以從增殖倍率看，以SK1、10＃、73＃3個(gè)號的增殖效果較好。

表11 同一培養(yǎng)基、不同無性系號的增殖效果比較Table 11 Comparison of proliferative effects of the same medium and different asexual lines

2.5.2 8 個(gè)無性系號瓶內(nèi)生根生產(chǎn)能力比較

由表12 可知，將8 個(gè)無性系號的芽苗接入生根培養(yǎng)基V6：1/2MS+IBA1.2mg/L+NAA0.2mg/L，每個(gè)號取5 瓶增殖芽接入生根培養(yǎng)基，每瓶可取芽枝接入生根的株數(shù)最多的3 個(gè)號是SK1（67 株）、10＃（60株）、73＃（46 株），折合生根瓶數(shù)依次是SK1（3.4瓶）、10 ＃（3.0 瓶）、73＃（2.3 瓶），且3 個(gè)號的生根率都達(dá)90%以上。

表12 8 個(gè)無性系的生根能力比較Table 12 Comparison of rooting capacity of eight asexual lines

一個(gè)樹種的組培快繁能否在瓶內(nèi)形成生產(chǎn)能力，要看增殖倍率25d 一個(gè)周期要達(dá)2.5 倍以上，每瓶可取用于生根的株數(shù)達(dá)40 株以上，同時(shí)生根率達(dá)90%以上。達(dá)到這3 個(gè)指標(biāo)，才算在試管內(nèi)可形成生產(chǎn)能力。8 個(gè)馬大相思無性系號從增殖倍率、生根率及瓶內(nèi)生根生產(chǎn)能力綜合評價(jià)，只有SK1、10＃、73＃3 個(gè)號可形成瓶內(nèi)生根能力，可在試管內(nèi)規(guī)模工廠化生產(chǎn)苗木。

3 結(jié)論與討論

(1)外植體的消毒成功率與芽條木質(zhì)化程度有關(guān)，枝條中上部半木質(zhì)化的莖段出芽率高，且污染率低，馬大相思理想的外植體材料是當(dāng)年生枝條第3～5 個(gè)腋芽莖段。兩種消毒方法（70%酒精+0.1%升汞）和（2%次氯酸鈉+0.1%升汞）對消毒效果沒多大區(qū)別，成功率都達(dá)30%以上，而僅用0.1%升汞的成功率只有15.0%。在使用兩種消毒劑時(shí)務(wù)必掌握好消毒時(shí)間，低于4min 污染率達(dá)100%；超過10min 后，枝條容易消毒過度，成功率僅為12.9%；而6min 是最合適的，誘導(dǎo)率達(dá)58.2%。馬大相思不同無性系之間的外植體消毒成功率和腋芽分化率有一定差異，消毒成功率最好的三個(gè)是SK1 （30%）、10 ＃（27.0%）、SK2（25.4%），腋芽分化率最高的三個(gè)是SK1（66.7%）、10＃（63.4%）、73＃（61.7%）。

（2）增殖效果與6-BA 濃度有關(guān)，固定NAA 為0.1mg/L，6-BA 最佳濃度以0.4mg/L 和0.6mg/L 為較適范圍。過低，芽叢分化少，高生長明顯，參差不齊；濃度過高，芽數(shù)多且幼細(xì)，玻璃化，質(zhì)量差，難操作。同時(shí)與基本培養(yǎng)基有關(guān)，通過三種基本培養(yǎng)基MS、B5、WPM 的分化試驗(yàn)，其中MS 培養(yǎng)基對促進(jìn)芽分化效果最顯著，培養(yǎng)4 個(gè)月時(shí)已進(jìn)入旺盛增殖期，6個(gè)月的倍率為3.87；其次是B5，6 個(gè)月倍率為1.61；最差為WPM，6 個(gè)月倍率是1.24。選用MS 作為大量元素最適合分化基本培養(yǎng)基。通過試驗(yàn)選擇8 個(gè)號的繼代增殖倍率以SK1、10＃、73＃3 個(gè)號的增殖效果較好。

(3)瓶內(nèi)生根培養(yǎng)以V6：1/2MS+IBA1.2mg/L+NAA0.2mg/L 和V13：1/2MS+NAA1.2mg/L+IBA0.2mg/L的生根效果最好，生根率都達(dá)96%，生根數(shù)平均達(dá)3.6 條以上。

(4)對8 個(gè)號的移栽的平均成活率有一定的差異，超過80%是10＃（87.3%）、73＃（83.5%）、SK1（87.8%），其它號為75%左右。移栽基質(zhì)選擇以黃心土：沙為1：1 效果最合適的。

(5)8 個(gè)馬大相思無性系號從增殖倍率、生根率及瓶內(nèi)生根生產(chǎn)能力綜合評價(jià)，只有SK1、10＃、73＃3 個(gè)號可形成瓶內(nèi)生根能力，可在試管內(nèi)規(guī)模工廠化生產(chǎn)苗木。