李軒，李利軍，程昊，馮軍，劉騰，徐婭娟

(1.廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545000；2.廣西科技大學(xué) 廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣西 柳州 545006；3.廣西蔗糖產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西 南寧 530004；4.廣西科技大學(xué) 廣西高校糖源加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 柳州 545006)

抗生素是20世紀(jì)最重要的醫(yī)學(xué)發(fā)明之一，在治療許多致命的傳染病方面具有較好的效果，但抗生素藥物的過(guò)度使用導(dǎo)致抗藥性細(xì)菌增多，從而影響一些疾病的治療[1-3]。苯唑西林(Oxacillin)作為抗生素，常被用來(lái)治療病菌感染類疾病，但在動(dòng)物的飼養(yǎng)過(guò)程中過(guò)量使用則會(huì)造成苯唑西林在動(dòng)物性食品中殘留[4-6]，因此，建立快速、準(zhǔn)確的苯唑西林檢測(cè)方法具有重要的意義。

目前，檢測(cè)苯唑西林的方法主要有高效液相色譜法[7]、液-質(zhì)聯(lián)用(HPLC-MS)[8]和高效液相色譜-紫外(HPLC-UV)[9]等方法，這些方法或比較繁瑣，或檢測(cè)周期長(zhǎng)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS) 利用光子作為分子探針，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)物質(zhì)的無(wú)損、快速檢測(cè)[10]。

本文以硅烷化試劑APTES為功能單體，苯唑西林為模板分子，TEOS為交聯(lián)劑，采用“一步法”制備核殼式Ag-MIP微球，以核殼式Ag-MIP微球?yàn)榛?，利用激光共聚焦拉曼光譜儀，在638 nm激發(fā)波長(zhǎng)處對(duì)苯唑西林溶液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，核殼式Ag-MIP基底對(duì)苯唑西林具有較強(qiáng)的SERS信號(hào)，苯唑西林濃度和特征峰強(qiáng)度具有較好的線性關(guān)系，R2為0.975，檢測(cè)極限達(dá)到10-15mol/L。對(duì)相同濃度的4-MBA、R6G和苯唑西林混合溶液，Ag-MIP對(duì)苯唑西林具有較高的選擇性，可較好的排除4-MBA、R6G對(duì)SERS光譜采集的干擾。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

硝酸銀、聚乙烯吡咯烷酮(PVP，MW=55 000)、抗壞血酸、苯唑西林、硅酸四乙酯(TEOS)、3-氨基三乙氧基硅烷(APTES)、氨水、無(wú)水乙醇、乙腈均為分析純。

Hitachi S-4800冷場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡；JEM 2100透射電子顯微鏡；Bruker D8A A25 X射線衍射儀；Frontier傅里葉紅外光譜儀；UV-2102PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；XploRAPLUS激光共聚焦拉曼光譜儀。

1.2 核殼式Ag-MIP微球制備

1.2.1 銀微球的制備[11]配制1 mol/L AgNO3溶液作為銀源，0.1 mol/L抗壞血酸溶液作為還原劑，1% PVP(聚乙烯吡咯烷酮)溶液作為分散劑。取0.2 mL AgNO3溶液與1 mL PVP溶液分散于10 mL去離子水中，磁力攪拌5 min。迅速滴加2 mL抗壞血酸溶液，反應(yīng)10 min。離心，分別用去離子水與無(wú)水乙醇洗滌3次，40 ℃真空干燥24 h。

1.2.2 Ag-MIP的制備 稱取50 mg苯唑西林超聲分散于10 mL乙醇-乙腈(1∶1)溶液中，加入450 mL APTES，磁力攪拌30 min。加入200 mL TEOS，超聲10 min。加入200 mg Ag微球，超聲5 min，待Ag微球分散均勻后，加入6%氨水1 mL，常溫下磁力攪拌24 h。離心，用乙酸-水(4∶1)洗滌，直至無(wú)苯唑西林檢出。最后，分別用去離子水與無(wú)水乙醇洗滌3次，40 ℃真空干燥24 h。

1.2.3 Ag-NIP的制備 方法和上述完全相同，只是不加模板分子苯唑西林。

1.3 Ag-MIP吸附性能考察

配制不同濃度的苯唑西林標(biāo)準(zhǔn)溶液，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別取2 mL苯唑西林標(biāo)準(zhǔn)溶液與10 mg的Ag-MIP和Ag-NIP在25 ℃振蕩24 h，離心，取上清液，檢測(cè)其紫外吸光度。

1.4 拉曼光譜采集及參數(shù)

分別取2 mL不同濃度的苯唑西林標(biāo)準(zhǔn)溶液和苯唑西林、R6G、4-MBA混合溶液，分別與10 mg Ag和Ag-MIP混合，在25 ℃振蕩4 h。滴到石英玻璃片上，晾干，采集拉曼光譜。光譜的參數(shù)為：波長(zhǎng)638 nm，積分時(shí)間10 s，平均次數(shù)為1次。

2 結(jié)果與討論

2.1 Ag-MIP的表征

2.1.1 Ag、Ag-MIP的SEM和TEM表征 圖1分別為Ag和Ag-MIP的SEM和TEM圖。

圖1 Ag和Ag-MIP的SEM和TEM圖Fig.1 SEM and TEM diagrams of Ag and Ag-MIPa.Ag SEM圖；b.Ag-MIP SEM圖；c.Ag TEM圖；d.Ag-MIP TEM圖

由圖1可知，銀微球是由棍棒組成，且表面非常粗糙，Ag-MIP中的Ag微球表面粗糙度降低，且觀察不到凸起的棍棒。Ag微球表面包覆了一層透光度較高的薄膜。綜上，可以初步確定銀微球表面覆蓋有聚合物層。

2.1.2 Ag-MIPs的EDS表征 圖2為Ag-MIPs 的EDS圖。其中的Ag元素譜峰來(lái)自于Ag微粒，Si來(lái)自于APTES或TEOS，C元素可能來(lái)自于APTES、TEOS或PVP。N、S元素來(lái)自于模板分子苯唑西林，由此可以進(jìn)一步證明銀微球表面的聚合物為苯唑西林分子印跡聚合物。

圖2 Ag-MIP的EDSFig.2 EDS images of Ag-MIP

2.1.3 Ag、Ag-MIPs的XRD表征 圖3為Ag、Ag-MIP的XRD譜圖。

圖3 Ag-MIP(a)和Ag(b)的XRD譜圖Fig.3 XRD spectra of Ag-MIP (a) and Ag (b)

由圖3可知，在2θ=38.175，4.413，64.630，77.606°處出現(xiàn)了明顯的衍射峰，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)PDF卡片(87-0720)對(duì)比，這些吸收峰分別為Ag晶體的(111)、(200)、(220)和(311)晶面，Ag-MIP的特征峰位與Ag微球位置完全重合，說(shuō)明Ag微球表面包覆一層聚合物后，并未導(dǎo)致銀微球晶型發(fā)生改變，但峰強(qiáng)度變小，其中(111)對(duì)應(yīng)晶面峰的強(qiáng)度降低最大。

2.1.4 Ag、Ag-MIP的IR表征 圖4是Ag-MIPs和Ag的FTIR譜圖。

圖4 Ag-MIP(a)和Ag(b)的FTIR譜圖Fig.4 FTIR spectra of Ag-MIP (a) and Ag (b)

由圖4可知，Ag微球表面并無(wú)其它雜質(zhì)；從Ag-MIP FTIR可看出，846，1 047 cm-1是來(lái)自交聯(lián)劑TEOS中的Si—O鍵的特征峰，1 400，1 470，1 470 cm-1是由苯唑西林中的苯環(huán)骨架振動(dòng)引起的，1 550 cm-1是由苯唑西林中C—N鍵伸縮振動(dòng)引起的，1 595，1 652 cm-1是由苯唑西林中的酰胺基中的羰基伸縮振動(dòng)引起的。這些特征峰的出現(xiàn)，進(jìn)一步證明Ag-MIP制備成功。

2.2 Ag-MIP的吸附等溫線

Ag-MIP和Ag-NIP的吸附等溫線見(jiàn)圖5。

圖5 Ag-MIP(a)和Ag-NIP(b)對(duì)苯唑西林的吸附等溫線Fig.5 Adsorption isotherm of Ag-MIP (a) andAg-NIP (b) for OXA

由圖5可知，在10～60 μg/mL的苯唑西林濃度區(qū)間內(nèi)，Ag-MIP與Ag-NIP的吸附量均隨著濃度的增大而上升，但Ag-MIP吸附量遠(yuǎn)高于Ag-NIP，表明Ag-MIP對(duì)苯唑西林具有更好的吸附性能，且吸附飽和量為23.6 μg/mg。這是因?yàn)锳g-MIP聚合物具有和苯唑西林分子結(jié)構(gòu)相匹配的印跡空穴，從而導(dǎo)致了Ag-MIP對(duì)苯唑西林的吸附具有富集效果。

2.3 Ag-MIP的吸附動(dòng)力學(xué)曲線

圖6為Ag-MIP和Ag-NIPs的動(dòng)力學(xué)吸附曲線。

圖6 Ag-MIP(a)和Ag-NIP(b)的吸附量-時(shí)間曲線Fig.6 Adsorption quantity-time curve ofAg-MIP (a) and Ag-NIP (b)

由圖6可知，在60 min內(nèi)隨時(shí)間增加，Ag-MIP和Ag-NIPs對(duì)苯唑西林的吸附速率增大，120 min后開始減緩，360 min時(shí)吸附達(dá)到飽和。在任何時(shí)間段內(nèi)，Ag-MIP相對(duì)于Ag-NIP都具有較大的吸附速率。這是由于Ag-MIP聚合物中具有和苯唑西林分子結(jié)構(gòu)相匹配的印跡空穴，所以Ag-MIP相對(duì)于Ag-NIP 表現(xiàn)出較高的吸附速率。

2.4 Ag-MIP的競(jìng)爭(zhēng)吸附

圖7為Ag-MIP和Ag-NIP分別對(duì)OXA、4-MBA、R6G分子的吸附效率。

圖7 Ag-MIP和Ag-NIP對(duì)不同分子的競(jìng)爭(zhēng)吸附研究Fig.7 Competitive adsorption of different moleculesby Ag-MIP and Ag-NIP

由圖7可知，在相同的條件下，Ag-MIP對(duì)苯唑西林的吸附效率為83.5%，明顯高于Ag-NIP的37.5%。Ag-MIP對(duì)4-MBA與R6G的吸附效率分別為50.6%，42.5%。表明Ag-MIP對(duì)苯唑西林吸附具有選擇性。這是因?yàn)锳g-MIP洗脫苯唑西林后，在Ag-MIP表面留下了與苯唑西林分子結(jié)構(gòu)相匹配的空穴，空穴中有與苯唑西林相結(jié)合的官能團(tuán)，從而導(dǎo)致了Ag-MIP對(duì)苯唑西林的吸附具有選擇性和富集效果。Ag-NIP對(duì)4-MBA與R6G的吸附效率分別為42.9%，25.9%，吸附效率相差較大。這是因?yàn)锳g-NIP表面的空穴是無(wú)規(guī)律排列的，沒(méi)有特殊結(jié)構(gòu)的普通空穴，但4-MBA分子結(jié)構(gòu)相對(duì)R6G較小，所以更容易被吸附。

2.5 Ag與Ag-MIP的SERS性能研究

圖8(a)、8(b)分別為苯唑西林(10-3mol/L)在Ag-MIP和Ag微球基底上的SERS譜圖，8(c)為苯唑西林標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼光譜圖。

圖8 拉曼光譜圖Fig.8 Raman spectraa.苯唑西林(10-3mol/L)在Ag-MIP基底上的SERS；b.苯唑西林(10-3mol/L)在Ag微球基底上的SERS；c.苯唑西林標(biāo)準(zhǔn)品的SERS

由圖8(c)可知，Ag微球與Ag-MIP在1 092 cm-1(羧基C—O鍵伸縮振動(dòng)引起)、1 195 cm-1(苯環(huán)C—H鍵彎曲振動(dòng)引起)、1 600 cm-1(苯環(huán)C—C鍵伸縮振動(dòng)引起)處拉曼峰顯著增強(qiáng)[12-13]，因此，可分別作為Ag微球與Ag-MIP基底上苯唑西林的特征峰。在相同濃度的苯唑西林溶液中，Ag-MIP的特征峰強(qiáng)度顯著高于Ag微球。這是因?yàn)锳g-MIP對(duì)苯唑西林的選擇性吸附，使Ag-MIP上的苯唑西林分子數(shù)量增大，所以具有較強(qiáng)的SERS信號(hào)。

2.6 Ag-MIP的SERS檢測(cè)極限

圖9是不同濃度苯唑西林溶液的SERS譜圖。

圖9 Ag-MIP吸附不同濃度苯唑西林溶液的SERS譜圖Fig.9 SERS spectra record for Ag-MIP in differentconcentration of OXA solution

由圖9可知，隨著苯唑西林濃度的降低，對(duì)應(yīng)的峰強(qiáng)度也相應(yīng)減弱。當(dāng)苯唑西林溶液的濃度為10-15mol/L時(shí)，吸收峰強(qiáng)度極弱。這是由于隨著苯唑西林溶液濃度的降低，Ag-MIP吸附的苯唑西林分子減少，激光照到單位面積的苯唑西林分子也隨之逐漸減少，從而導(dǎo)致拉曼光譜的信號(hào)逐漸減弱。因此，可將10-15mol/L視為Ag-MIP的檢測(cè)極限。

為了考察不同濃度的苯唑西林與其SERS的線性相關(guān)性，以圖8中1 092 cm-1處的特征峰為參照，logc為橫坐標(biāo)，特征峰強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，在濃度10-3～10-13mol/L 范圍內(nèi)作線性擬合，見(jiàn)圖10。線性回歸方程為y=893.74x+12 221，R2=0.975。

由圖10可知，苯唑西林濃度與SERS信號(hào)峰強(qiáng)度之間存在較好的線性關(guān)系，說(shuō)明可以通過(guò)測(cè)量特征峰強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)對(duì)苯唑西林的定量分析。

圖10 濃度與峰強(qiáng)度的線性關(guān)系圖Fig.10 The liner relationship betweenconcentration and peak intensity

2.7 Ag-MIP的SERS競(jìng)爭(zhēng)吸附

圖11分別是Ag和Ag-MIP吸附苯唑西林、4-MBA和R6G混合溶液后的SERS譜圖。

圖11 SERS譜圖Fig.11 SERS spectraa.苯唑西林、4-MBA和R6G混合溶液在Ag-MIP基底上SERS；b.苯唑西林、4-MBA和R6G混合溶液在Ag基底上的SERS

由圖11可知，在600～1 800 cm-1范圍內(nèi)，以Ag-MIP作為基底時(shí)，苯唑西林的特征峰較為明顯，4-MBA和R6G的特征峰較低，基本被苯唑西林的特征峰覆蓋。而以Ag作為基底時(shí)，苯唑西林、4-MBA和R6G的特征峰都較為明顯。這是因?yàn)锳g-MIP聚合物中具有和苯唑西林分子結(jié)構(gòu)相匹配的結(jié)合位點(diǎn)，可以選擇性吸附苯唑西林分子。對(duì)比圖8(a)，可知，苯唑西林的特征峰藍(lán)移，且相對(duì)強(qiáng)度也有所變化，這可能是少量的4-MBA和R6G吸附導(dǎo)致。

3 結(jié)論

采用“一步法”制備出核殼式Ag-MIP微球，粒徑均一，分散性好。以核殼式Ag-MIP微球作基底，對(duì)苯唑西林的拉曼光譜具有顯著的增強(qiáng)效應(yīng)，同時(shí)對(duì)苯唑西林具有優(yōu)異選擇吸附性，因此，可用于苯唑西林的高靈敏度、高選擇性的SERS檢測(cè)。