李俊雯，范文來(lái)，徐巖

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，釀造微生物與應(yīng)用酶學(xué)研究室，江蘇 無(wú)錫，214122)

鎮(zhèn)江香醋是中國(guó)四大名醋之一[1]，作為傳統(tǒng)酸性調(diào)味品在人們?nèi)粘ｏ嬍成钪邪l(fā)揮著重要作用[2]。酸味是食醋最重要的味覺(jué)特征，而羧酸是影響食醋味覺(jué)和口感的重要因素，其中不揮發(fā)性有機(jī)酸和氨基酸能夠調(diào)和揮發(fā)酸乙酸刺激的酸味，賦予食醋輕柔的口感[3]。

國(guó)內(nèi)外測(cè)定醋中不揮發(fā)羧酸的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[4]、離子色譜法[5]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)[6]法、核磁共振[7]等。目前應(yīng)用HPLC和攪拌棒吸附萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用(SBSE-GC-MS)等方法在鎮(zhèn)江香醋中檢測(cè)到的不揮發(fā)酸有：乳酸、焦谷氨酸、草酸、酒石酸、丙酮酸、α-酮戊二酸、檸檬酸、琥珀酸[4]、蘋(píng)果酸、富馬酸[8]、馬來(lái)酸[9]、苯甲酸、苯乙酸和3-甲硫基丙酸[10]等10余種，應(yīng)用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)得各類(lèi)氨基酸20余種[11]。與HPLC或LC-MS相比，氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)靈敏度和分辨率更高，檢測(cè)限更低[12]。當(dāng)然，在GC-MS分析前，不揮發(fā)化合物須經(jīng)衍生化處理，增強(qiáng)其揮發(fā)性。

在眾多衍生化方法中，硅烷衍生化是較為常用的一種手段，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于白酒[13]、煙草[12]、酒醅[14]等多種基質(zhì)和原料檢測(cè)中。常用的硅烷衍生化試劑有N-特丁基二甲基硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺(N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide, MTBSTFA)、N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(N,O-bis-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide, BSTFA)，對(duì)檢測(cè)沒(méi)有空間位阻的羧酸來(lái)說(shuō)，使用MTBSTFA作衍生化試劑效果更佳[15]。

本研究以市售恒順鎮(zhèn)江香醋為研究對(duì)象，采用MTBSTFA硅烷化衍生結(jié)合GC-MS檢測(cè)不揮發(fā)羧酸，并進(jìn)行定量分析，以期更深入地認(rèn)識(shí)鎮(zhèn)江香醋中不揮發(fā)羧酸的種類(lèi)組成和含量分布，為食醋的品質(zhì)提升和工藝改進(jìn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：江蘇省恒順醋業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的恒順金梅鎮(zhèn)江香醋成品(優(yōu)級(jí)，總酸≥5.50 g/100 mL)，于2018年9月購(gòu)買(mǎi)自當(dāng)?shù)爻小?/p>

試劑：表1和表2中所有全定量羧酸及同位素有機(jī)酸(十六烷酸-d31、十八烷酸-d35、琥珀酸-2,2,3,3-d4)、 MTBSTFA(99.5%)、乙醇、乙腈(色譜級(jí))，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；NaH2PO4、H3PO4(AR級(jí))，上海國(guó)藥公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Centrifuge 5418冷凍離心機(jī)，德國(guó)eppendorf公司；N-EVAP111氮吹儀，美國(guó)Organomation公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；GC6890M-MSD5975 GC-MS儀，美國(guó)Agilent公司；Waters UPLC H-Class超高相液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；Millipore-Q超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理與MTBSTFA衍生化

1.3.2 GC-MS分析條件

GC條件：色譜柱HP-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣為高純氦氣(流速1.0 mL/min)；不分流進(jìn)樣；升溫程序：65 ℃保持2 min， 以6 ℃/min升溫至320 ℃，保持10 min。進(jìn)樣量1.0 μL。

MS條件：EI電離源；電子能量70 eV；發(fā)射電流25 μA；離子源溫度230 ℃；質(zhì)量掃描范圍35～650 amu。

1.3.3 化合物定性和定量

化合物鑒定：定性結(jié)果通過(guò)與NIST05a.L數(shù)據(jù)庫(kù)(Agilent Technologies Inc.)中標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖比對(duì)，并與羧酸標(biāo)準(zhǔn)品衍生后的質(zhì)譜圖和保留時(shí)間對(duì)比確定。通過(guò)對(duì)C5～C30正構(gòu)烷烴混合標(biāo)樣進(jìn)行相同條件GC-MS 分析計(jì)算保留指數(shù)[17]。

化合物定量：配制一定質(zhì)量濃度羧酸標(biāo)準(zhǔn)品母液，進(jìn)行梯度稀釋后經(jīng)過(guò)與樣品一致的衍生化處理，采用選擇離子模式(SIM)定量，以標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度(100.0 mg/L)之比為縱坐標(biāo)，峰面積之比為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)將樣品中化合物與內(nèi)標(biāo)的SIM模式下積分峰面積比代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品中化合物含量。

1.3.4 去蛋白和衍生化方法回收率測(cè)定

在去蛋白之前，分別于100 μL原醋樣中加入終質(zhì)量濃度為57.32、80.25、97.44 mg/L的琥珀酸-2,2,3,3-d4；然后按方法1.3.1去蛋白后，取上清液分別加入終質(zhì)量濃度為20.33、50.05、79.77 mg/L的十八烷酸-d35，氮吹干后加內(nèi)標(biāo)十六烷酸-d31(終質(zhì)量濃度100.0 mg/L)， MTBSTFA衍生化，接著GC-MS分析。方法回收率的計(jì)算見(jiàn)公式(1)：

(1)

式中：p表示方法回收率;c1為樣品中檢測(cè)出的同位素有機(jī)酸的濃度;c0為樣品中加入的同位素有機(jī)酸的濃度。

1.3.5 超高相液相色譜法(UPLC)定量乳酸

參照文獻(xiàn)[18]，用超純水將鎮(zhèn)江香醋稀釋50倍，取1.0 mL過(guò)0.22 μm針頭式有機(jī)濾頭后進(jìn)行UPLC分析。

色譜條件：色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3 (i.d 2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm)；流動(dòng)相：20 mmol/L NaH2PO4溶液(磷酸調(diào)節(jié)pH至2.7)；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm； 柱溫：30 ℃，流速：0.25 mL/min，進(jìn)樣1.0 μL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：用超純水配制初始質(zhì)量濃度為5.40 g/L的乳酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，并進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)匀樗岱迕娣e為橫坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

鎮(zhèn)江香醋經(jīng)衍生化后，共鑒定出含乳酸在內(nèi)的61種不揮發(fā)羧酸，其中氨基酸17種、芳香酸13種、羥基酸11種、長(zhǎng)鏈脂肪酸8種、二元及多元酸7種(不含羥基)、含硫有機(jī)酸1種、雜環(huán)酸2種、酮酸1種和1種不揮發(fā)酸酯，其中羥基酸含量最高，達(dá)16.01 g/L，其次是雜環(huán)酸和氨基酸，總含量在500 mg/L以上，二元及多元酸、芳香酸、酮酸，長(zhǎng)鏈脂肪酸總含量次之，在100～ 400 mg/L，含硫有機(jī)酸及酯含量最低，小于25 mg/L。

與鎮(zhèn)江香醋早期研究結(jié)果[2-4, 8-11]相比，新檢測(cè)到的化合物有2-糠酸、乙醇酸、3-羥基丙酸、2-羥基-3-甲基丁酸、2-羥基-4-甲基戊酸、2-羥基己酸、2-甲基丁二酸、戊二酸、甘油酸、扁桃酸、2-羥基-3-苯丙酸、對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯乙酸、棕櫚油酸、丙三酸、2,6-二羥基苯甲酸、原兒茶酸、dl-對(duì)羥基苯乳酸、3-羥基-3-甲基戊二酸、阿魏酸、檸檬酸、芥子酸、沒(méi)食子酸、咖啡酸等24種。

2.1 香醋衍生化定量方法

醋中添加琥珀酸-2,2,3,3-d4的回收率為80.44%，表明去蛋白和衍生化方法的總回收率不是太高，但相較于傳統(tǒng)添加沉降劑K4Fe(CN)6·3H2O和ZnSO4·H2O 去蛋白方法的回收率(41.30%)已經(jīng)有了較大的提升[10]；在氮吹衍生化前加入十八烷酸-d35的回收率為94.06%，說(shuō)明衍生化方法的回收率高。2個(gè)回收率比較后發(fā)現(xiàn)去蛋白過(guò)程有機(jī)酸損失率較大，推測(cè)可能是由于去蛋白時(shí)某些有機(jī)酸被包裹于蛋白中或有機(jī)酸與蛋白質(zhì)結(jié)合形成了結(jié)合態(tài)有機(jī)酸。

除乳酸含量過(guò)高采用UPLC方法定量外，其他化合物均采用衍生化的方法繪制標(biāo)曲并定量。各羧酸標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，線性相關(guān)系數(shù)R2均在0.983 8～0.999 9，回收率在82%～118%(表1和表2)，這些化合物回收率在十八烷酸-d35的回收率上下波動(dòng)，說(shuō)明衍生化方法適用于醋中羧酸的檢測(cè)。

2.2 不揮發(fā)羧酸鑒定和定量

在所有檢測(cè)到的化合物(表1和表2)中，乳酸(15.86 g/L)含量最高，其次是焦谷氨酸(580.9 mg/L)，含量排第三位的是琥珀酸(273.3 mg/L)，后兩種酸是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T18623—2011[19]中鎮(zhèn)江香醋的特征有機(jī)酸。

質(zhì)量濃度高于50 mg/L的酸有：精氨酸(187.1 mg/L)、草酰乙酸(150.2 mg/L)、2-羥基-3-苯丙酸(122.3 mg/L)、草酸(97.46 mg/L)、纈氨酸(68.53 mg/L)、半胱氨酸(61.33 mg/L)、絲氨酸(57.76 mg/L)、脯氨酸(56.86 mg/L)。其余酸含量均低于35 mg/L，2,6-二 羥基苯甲酸、芥子酸、咖啡酸含量最低，為20～308 μg/L，棕櫚油酸和沒(méi)食子酸含量低于定量限。

2.3 羥基酸類(lèi)化合物

如表1所示，在鎮(zhèn)江香醋中共檢測(cè)到羥基酸11種，包括首次檢測(cè)到的乙醇酸、3-羥基丙酸、2-羥基-3-甲基丁酸、2-羥基-4-甲基戊酸、2-羥基己酸、3-羥基-3-甲基戊二酸(共6種)。羥基酸總質(zhì)量濃度達(dá)16.01 g/L，其中乳酸質(zhì)量濃度最高為15.86 g/L(文獻(xiàn)報(bào)道乳酸含量為9.53～34.28 g/L[4, 8])，3-羥基-3-甲基戊二酸(33.68 mg/L)和乙醇酸(31.48 mg/L)含量次之。

乳酸來(lái)源于產(chǎn)酸菌分解葡萄糖[20]，沒(méi)有香氣但呈柔和酸味，可以減輕揮發(fā)性醋酸的刺激性氣味和口感[21]。新發(fā)現(xiàn)的化合物乙醇酸、3-羥基丙酸、2-羥基-3-甲基丁酸呈酸味，2-羥基-4-甲基戊酸除了呈酸味外還呈甜味[13]。

2.4 芳香酸類(lèi)化合物

芳香酸是鎮(zhèn)江香醋中除氨基酸外種類(lèi)最多的一類(lèi)化合物，共檢測(cè)到13種(其中酚酸9種)，總含量193.4 mg/L。除苯甲酸、苯乙酸外，其余芳香酸均是首次檢測(cè)到。鑒定出的酚酸主要為對(duì)羥基苯甲酸類(lèi)(如對(duì)羥基苯甲酸、沒(méi)食子酸、原兒茶酸)和對(duì)羥基肉桂酸類(lèi)(如咖啡酸)，以及酚醚類(lèi)酸阿魏酸、芥子酸等。這些酚酸和酚醚類(lèi)化合物是呈澀味的化合物，多具有抗氧化活性，主要通過(guò)苯丙酸途徑產(chǎn)生[17, 22]。

在芳香酸中，2-羥基-3-苯丙酸(俗稱(chēng)苯乳酸)含量最高，達(dá)122.3 mg/L，占芳香酸總含量的63.58%，是以前研究中沒(méi)有關(guān)注的芳香酸。該酸在白酒中曾檢測(cè)到，呈酸味和澀味，在水中味覺(jué)閾值為1 360 μmol/L[13]。

2.5 二元及多元酸

在鎮(zhèn)江香醋中檢測(cè)到的二元酸主要有草酸、馬來(lái)酸、琥珀酸、富馬酸、戊二酸和2-甲基丁二酸；多元酸是丙三酸。戊二酸、2-甲基丁二酸、丙三酸為首次檢測(cè)到。該類(lèi)酸中，琥珀酸(273.3 mg/L)含量是最高的。琥珀酸是三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，其酸味閾值1 074 μmol/L，澀味閾值84.58 μmol/L[13]。

表1 鎮(zhèn)江香醋中不揮發(fā)有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線及含量Table 1 Standard curves and concentrations of nonvolatile organic acids in Zhenjiang aromatic vinegar

續(xù)表1

序號(hào)RI化合物m/z斜率截距R2n回收率/%有機(jī)酸質(zhì)量濃度a/(mg·L-1)二元及多元酸131 567草酸(oxalic acid)-2TBDMS2611.387 70.432 40.998 3119197.46±0.05211 744馬來(lái)酸(maleic acid)-2TBDMS2874.512 3-0.005 50.998 271141.747±0.09221 757琥珀酸(succinic acid)-2TBDMS2891.666 8-0.005 50.999 81195273.3±3.60241 7662-甲基丁二酸(2-methylsuccinic acid)-2TBDMS3036.348 5-0.036 80.993 8111156.004±0.03251 786富馬酸(fumaric acid)-2TBDMS2872.717 70.000 80.999 2111184.545±0.15261 854戊二酸(glutaric acid)-2TBDMS3030.972 5-0.004 10.996 811940.939 1±0.06442 374丙三酸(tricarballylic acid)-3TBDMS4611.049 80.006 90.995 58951.019±0.13芳香酸41 453苯甲酸(benzoic acid)-TBDMS1792.788 9-0.023 90.983 888816.48±0.0191 526苯乙酸(phenylacetic acid)-TBDMS1931.806 7-0.000 20.999 3119911.66±0.02281 894扁桃酸(mandelic acid)-2TBDMS2212.256 80.007 90.996 911852.158±0.00332 0372-羥基-3-苯丙酸(2-hydroxy-3-phenylpropionic acid)-2TBDMS3371.679 20.002 00.999 711110123.0±6.51362 102對(duì)羥基苯乙酸(4-hydroxyphenylacetic acid)-2TBDMS3230.822 80.001 80.996 711896.539±0.02382 112對(duì)羥基苯甲酸(4-hydroxybenzoic acid)-2TBDMS3090.711 40.002 20.997 7118919.12±0.52462 4002,6-二羥基苯甲酸(2,6-dihydroxybenzoic acid b)-3TBDMSc4390.277 9-0.003 30.992710621.37±5.33512 530原兒茶酸(3,4-dihydroxybenzoic acid)-3TBDMS4390.645 0-0.000 20.993 57840.926 2±0.02542 595dl-對(duì)羥基-苯基乳酸(dl-p-hydroxy-phenyl lactic acid)-3TBDMS1471.796 80.010 70.996 711859.458±0.05562 611阿魏酸(ferulic acid)-2TBDMS3651.537 8-0.015 90.991 071103.757±0.09582 760芥子酸(mustard acid)-2TBDMSc3952.497 2-0.000 30.999 08104308.8±5.58592 819沒(méi)食子酸(gallic acid)-4TBDMS5690.557 9-0.008 60.992 97-

注：a：數(shù)值為3次測(cè)量的平均值(即n=3)；b：采用UPLC法定量，濃度單位為g/L；c：濃度單位為μg/L；

2.6 長(zhǎng)鏈脂肪酸

鎮(zhèn)江香醋中首次檢測(cè)到長(zhǎng)鏈脂肪酸8種，包括5種飽和脂肪酸和3種不飽和脂肪酸，總含量105.0 mg/L，其中十六烷酸、十八烷酸和亞油酸含量較高。這些長(zhǎng)鏈脂肪酸多呈油脂口感[23]，可能來(lái)源于釀造過(guò)程中脂肪的分解。

2.7 其他酸

醋中檢測(cè)出2種雜環(huán)酸，一種是常見(jiàn)的焦谷氨酸(580.9 mg/L)，另一種為首次檢測(cè)到的2-糠酸(16.38 mg/L)。 焦谷氨酸呈酸味，閾值30 mg/L[4]，含量遠(yuǎn)高于閾值，說(shuō)明其對(duì)鎮(zhèn)江香醋的酸味有一定的貢獻(xiàn)。

另發(fā)現(xiàn)一種含硫有機(jī)酸，3-甲硫基丙酸(7.569 mg/L)，該物質(zhì)曾通過(guò)SBSE-GC-MS方法檢測(cè)到過(guò)[10]。

新檢測(cè)到一種酮酸即草酰乙酸(150.2 mg/L)，為三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物，可通過(guò)轉(zhuǎn)氨基作用偶聯(lián)尿素循環(huán)轉(zhuǎn)化為天冬氨酸、丙酮酸和丙氨酸[24]。

2.8 氨基酸

在鎮(zhèn)江香醋中共鑒定出17種氨基酸(如表2)，總含量達(dá)546.5 mg/L，8種人體必需氨基酸除色氨酸未檢測(cè)到以外，其余7種都能通過(guò)MTBSTFA衍生化方法檢測(cè)到，總含量119.1 mg/L，占整個(gè)氨基酸含量的21.80%。

表2 鎮(zhèn)江香醋中氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線及含量Table 2 Standard curves and concentations of amino acids in Zhenjiang aromatic vinegar

3 結(jié)論

在鎮(zhèn)江香醋中檢測(cè)到61種不揮發(fā)化合物，包括17種氨基酸、13種芳香酸、11種羥基酸、8種長(zhǎng)鏈脂肪酸、7種二元及多元酸(不含羥基)、1種含硫有機(jī)酸、1種酮酸，2種雜環(huán)酸，還有1種不揮發(fā)酸酯，其中新檢測(cè)到如2-糠酸、乙醇酸、3-羥基丙酸、甘油酸、扁桃酸、對(duì)羥基苯乙酸、2,6-二羥基苯甲酸、原兒茶酸、阿魏酸、檸檬酸、芥子酸、沒(méi)食子酸、咖啡酸等24種不揮發(fā)性有機(jī)酸。采用MTBSTFA衍生化定量方法的回收率82%～118%，符合定量要求。研究發(fā)現(xiàn)羥基酸含量最高，其次是雜環(huán)酸和氨基酸。單個(gè)酸中，含量從高到低依次為乳酸、焦谷氨酸、琥珀酸、精氨酸、草酰乙酸和2-羥基-3-苯丙酸(含量大于100 mg/L)。豐富的有機(jī)酸和氨基酸構(gòu)成了鎮(zhèn)江香醋的獨(dú)特風(fēng)格，后續(xù)應(yīng)側(cè)重單個(gè)以及群體羧基酸對(duì)鎮(zhèn)江香醋口感貢獻(xiàn)的研究，為香醋品質(zhì)提升奠定基礎(chǔ)。