李海珍，姚慧敏，胡彥武 ，越 皓

替尼泊苷（Teniposide，VM-26）又稱4 ′-去甲基表鬼臼毒素-BETA-D-噻吩亞甲基吡喃葡萄糖苷，是在鬼臼毒素的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上修飾得到的半合成衍生物.VM-26作為一種廣譜化療藥物，可用于如淋巴細(xì)胞性白血病和急性淋巴細(xì)胞性白血病等實驗性誘導(dǎo)白血病，嬰兒非霍奇金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、腹水腫瘤、惡性腦瘤、結(jié)腸直腸及難治性或復(fù)發(fā)性睪丸癌、小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌等多種癌癥的治療［1-5］.VM-26為一種細(xì)胞周期特異性細(xì)胞毒性藥物，通過抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶-II（DNA-topo-II）的活性穩(wěn)定DNA復(fù)制中的DNA-topo-II復(fù)合物，從而破壞DNA，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［6-8］.在臨床應(yīng)用中常與其他藥物如順鉑、磷替莫司汀和地塞米松等聯(lián)合使用而達(dá)到更好的治療效果，降低其毒副作用［9-15］.

油水分配系數(shù)（Partition coefficient，P）是藥物的一個基礎(chǔ)參數(shù)，并已被用作確定定量結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系（QSAR）的主要參數(shù)［1］.P的大小直接影響藥物的滲透性，從而影響藥物在體內(nèi)的吸收分布過程，因此與各種藥物的臨床療效密切相關(guān).目前還未發(fā)現(xiàn)VM-26P值測定的有關(guān)文獻(xiàn)報道.

本研究采用搖瓶法，建立HPLC法測定VM-26在正辛醇-水中的P值，并研究不同pH對其結(jié)果的影響，為開發(fā)和研制VM-26新劑型提供參考依據(jù).

1 實驗儀器與試劑

1.1 實驗儀器

Waters高效液相色譜儀:配有Alliance 2695型四元梯度輸液泵、Alliance 2695進(jìn)樣器、2489 PDA檢測器，KQ2200E型超聲波清洗儀；SOP電子天平；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器；TGL-16B高速離心機；KYC-100C空氣恒溫?fù)u床.

1.2 實驗試劑

試劑:替尼泊苷（批號:210790，長沙禎祥生物科技有限公司）；甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純.

2 實驗方法

2.1 樣品的制備

2.1.1 不同pH磷酸鹽緩沖液的制備

照《中國藥典》（2015年版四部）8004緩沖液的配制方法配制pH分別為5.0、5.8、6.5、7.4和8.0的磷酸鹽緩沖液（PBS）.

pH1.2鹽酸溶液配制:取濃鹽酸2mL加入200mL純水中，加鹽酸使pH至1.2，即得.

2.1.2 水飽和正辛醇溶液及正辛醇飽和水溶液的制備

分別精密量取正辛醇和水相（包括pH1.2鹽酸溶液和pH為5.0、5.8、6.5、7.4和8.0的PBS緩沖液）各200mL于500mL具塞錐形瓶中，于25℃下磁力攪拌24h后，靜置過夜，取上層作為水飽和正辛醇溶液，取下層作為正辛醇飽和水溶液.

2.1.3 對照品溶液的配制

精密稱取VM-26適量，加甲醇制備成0.2mg·mL-1的VM-26儲備液，加甲醇稀釋配制成10μg·mL-1的VM-26對照品溶液.

2.1.4 供試品溶液的制備

精密稱取VM-26 10mg于100mL容量瓶中，加水飽和正辛醇超聲30min溶解后定容，得到VM-26貯備液.精密取VM-26儲備液2mL，精密加入同體積的水相溶液（pH1.2鹽酸溶液與pH分別為5.0、5.8、6.5、7.4和8.0的 PBS緩沖液）于10mL具塞塑料管中，于25℃下在恒溫?fù)u床中振搖24h，使藥物平衡分布在油水兩相中4000r·min-1離心10min，取上層正辛醇溶液1mL于10mL容量瓶中，加甲醇稀釋并定容，即得VM-26供試品溶液.

2.2 檢測波長的確定

取VM-26適量，以甲醇為溶劑制備濃度為10μg·mL-1的VM-26溶液，以乙腈-0.1%磷酸緩沖液（50:50）為流動相，使用PDA檢測器于210～400nm進(jìn)行掃描，得到色譜圖如圖1，在230nm和280nm處各有一吸收峰值，參照國家藥品標(biāo)準(zhǔn)所用波長為280nm，因此選用280nm作為檢測波長.

圖1 VM-26溶液的色譜圖

2.3 色譜條件

色譜柱:WatersSymmetryC18柱（4.6×250mm，5μm），流動相:乙腈-0.1%磷酸緩沖液（50:50），流速:1mL·min-1，檢測波長:280nm，柱溫:30℃，進(jìn)樣量:10μL.理論塔板數(shù)按VM-26計應(yīng)不低于3000.

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 專屬性試驗

分別取VM-26對照品溶液、VM-26供試品溶液（水飽和正辛醇為溶劑）進(jìn)樣HPLC檢測，記錄色譜圖.

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密量取VM-26儲備液0.1mL、0.2mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL和5.0mL于10mL容量瓶中，加甲醇制備成濃度分別為2μg·mL-1、4μg·mL-1、10μg·mL-1、20μg·mL-1、40μg·mL-1、100μg·mL-1系列VM-26溶液進(jìn)樣分析，以VM-26濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），用最小二乘法進(jìn)行線性回歸.

2.4.3 精密度試驗

取VM-26對照品溶液進(jìn)樣HPLC檢測，日內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣5次，連續(xù)進(jìn)樣3天，記錄峰面積，計算日內(nèi)、日間RSD%.

2.4.4 穩(wěn)定性試驗

取“2.1.4”項下的供試品溶液，分別在磁力攪拌0h、2h、4h、6h、8h、12h、24h后取樣，進(jìn)HPLC檢測，計算RSD%.

2.4.5 回收率試驗

分別精密稱定VM-26 8mg、10mg和12mg VM-26于100mL容量瓶中，加水飽和正辛醇溶液稀釋并定容，取上述溶液加甲醇稀釋得到濃度為 8μg·mL-1、10μg·mL-1和 12μg·mL-1供試品溶液，每個濃度平行3份樣品.進(jìn)HPLC檢測，記錄峰面積，計算得到平均回收率及RSD%.

2.3 VM-26油水分配系數(shù)的測定

2.3.1 不同正辛醇-水比例VM-26P值的測定

本試驗設(shè)計3個正辛醇/水的比例進(jìn)行P值的測定.取VM-26儲備液2mL 3份，分別加入1mL、2mL和4mL正辛醇飽和水溶液，按照“2.1.4”項下方法制備VM-26溶液，進(jìn)HPLC檢測，計算正辛醇中VM-26平衡濃度.同時取VM-26儲備液1mL于10mL容量瓶中，加甲醇定容后進(jìn)HPLC檢測，記錄峰面積并計算正辛醇中含藥量濃度.并采用下列公式計算P值，結(jié)果見表1，正辛醇與水例為2∶1與2∶4時P值相差不大，因此選擇油水比例為2∶2.

式中:P為VM-26的油水分配系數(shù)；Cn-o為正辛醇中VM-26平衡濃度；Cn正辛醇中初始含藥量濃度.

2.3.2 不同pH條件下P值的測定

取“2.1.4”項下的VM-26儲備液2mL 6份，分別加入正辛醇飽和pH1.2鹽酸溶液、pH5.0、pH5.8、pH6.5、pH7.4及pH8.0的PBS緩沖溶液，照“2.2.2”項下方法測定，記錄峰面積，計算正辛醇中含藥量濃度并計算P值.

3 實驗結(jié)果

3.1 方法學(xué)驗證結(jié)果

3.1.1 專屬性試驗

VM-26對照品溶液、VM-26供試品溶液色譜圖見圖2，結(jié)果理論塔板數(shù)不低于3000，分離度大于1.5.

圖2 VM-26對照品溶液與供試品溶液色譜圖

3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以VM-26濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），得出回歸方程y=6001.4x-5669.6（R=0.9993），結(jié)果表明VM-26質(zhì)量濃度在2～100μg·mL-1內(nèi)線性關(guān)系良好.

3.1.3 精密度試驗

VM-26對照品溶液在日內(nèi)、日間RSD%分別為0.43%、1.02%，結(jié)果表明該方法精密度良好.

3.1.4 穩(wěn)定性試驗

供試品溶液攪拌24h內(nèi)樣品RSD%為1.67，結(jié)果表明VM-26供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定.

3.1.5 回收率試驗

VM-26高、中、低三個濃度的平均回收率為100.84%，RSD%為1.79%，表明該方法準(zhǔn)確度良好.

3.2 VM-26油水分配系數(shù)的測定

3.2.1 不同正辛醇-水比例VM-26P值的測定

在不同正辛醇-水比例條件下VM-26P值的測定結(jié)果見表1，正辛醇與水例為2∶1與2∶4時P值相差不大，因此選擇油水比例為2∶2.

表1 不同正辛醇-水比例VM-26P值的測定

3.2.2 不同pH條件下P值的測定

在不同pH條件下VM-26P值的測定結(jié)果見表2及圖3，pH=7.4時lgP值最大，pH=6.5lgP值最小，所有水相中的lgP值均大于2且無明顯差異.

表2 不同pH條件下P值的測定結(jié)果

圖3 不同PH條件下P值的測定結(jié)果

4 討論

P值測定的方法主要有搖瓶法、反相高效液相色譜法和產(chǎn)生柱法，其中，反相高效液相色譜法需建立已知P值對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，成本較高；而產(chǎn)生柱法測定步驟較多，平衡時間長.亦有文獻(xiàn)采用硅膜平衡器法和固相微萃取法［16］，該方法操作復(fù)雜，成本較高.因此選用搖瓶法進(jìn)行P值測定，此法成本較低、易于操作.選擇油相應(yīng)與水相互不相溶，目前文獻(xiàn)多以正辛醇作為油相［17-18］，主要是由于正辛醇與水互不相溶，且極性與生物膜相似［19］，因此本試驗選擇正辛醇-水作為分配體系.

VM-26水溶性差，水中的VM-26濃度太低無法檢出，故本試驗將VM-26溶于油相中，通過測定平衡前水飽和正辛醇的含藥量和平衡后正辛醇含藥量之差來計算水相中含藥量，進(jìn)一步計算VM-26P值.正辛醇-水分配體系中彼此會有少許溶解，因此在實驗前應(yīng)先預(yù)飽和正辛醇與水，以免在實驗過程中水與正辛醇之前相互分配平衡，影響實驗結(jié)果［17］.

藥物的P值與藥物在體內(nèi)吸收、分布和轉(zhuǎn)運密切相關(guān)，P值越大則生物膜的滲透性越高，有利于藥物在體內(nèi)的吸收［20-21］.而藥物最佳的P值分布范圍是-1

結(jié)果顯示，VM-26在pH5.0～8.0時，其lgP值均大于2，表明藥物脂溶性好，在體內(nèi)滲透性高；隨著pH變化無明顯差異，VM-26在緩沖溶液中以非解離型藥物形式存在，不發(fā)生電離.上述結(jié)論為研究開發(fā)更加有效、安全的各種VM-26制劑提供一定參考價值.