李海珍，姚慧敏，胡彥武 ，越 皓

替尼泊苷（Teniposide，VM-26）又稱4 ′-去甲基表鬼臼毒素-BETA-D-噻吩亞甲基吡喃葡萄糖苷，是在鬼臼毒素的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上修飾得到的半合成衍生物.VM-26作為一種廣譜化療藥物，可用于如淋巴細(xì)胞性白血病和急性淋巴細(xì)胞性白血病等實(shí)驗(yàn)性誘導(dǎo)白血病，嬰兒非霍奇金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、腹水腫瘤、惡性腦瘤、結(jié)腸直腸及難治性或復(fù)發(fā)性睪丸癌、小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌等多種癌癥的治療［1-5］.VM-26為一種細(xì)胞周期特異性細(xì)胞毒性藥物，通過抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶-II（DNA-topo-II）的活性穩(wěn)定DNA復(fù)制中的DNA-topo-II復(fù)合物，從而破壞DNA，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［6-8］.在臨床應(yīng)用中常與其他藥物如順鉑、磷替莫司汀和地塞米松等聯(lián)合使用而達(dá)到更好的治療效果，降低其毒副作用［9-15］.

油水分配系數(shù)（Partition coefficient，P）是藥物的一個(gè)基礎(chǔ)參數(shù)，并已被用作確定定量結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系（QSAR）的主要參數(shù)［1］.P的大小直接影響藥物的滲透性，從而影響藥物在體內(nèi)的吸收分布過程，因此與各種藥物的臨床療效密切相關(guān).目前還未發(fā)現(xiàn)VM-26P值測(cè)定的有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道.

本研究采用搖瓶法，建立HPLC法測(cè)定VM-26在正辛醇-水中的P值，并研究不同pH對(duì)其結(jié)果的影響，為開發(fā)和研制VM-26新劑型提供參考依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

Waters高效液相色譜儀:配有Alliance 2695型四元梯度輸液泵、Alliance 2695進(jìn)樣器、2489 PDA檢測(cè)器，KQ2200E型超聲波清洗儀；SOP電子天平；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器；TGL-16B高速離心機(jī)；KYC-100C空氣恒溫?fù)u床.

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

試劑:替尼泊苷（批號(hào):210790，長(zhǎng)沙禎祥生物科技有限公司）；甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品的制備

2.1.1 不同pH磷酸鹽緩沖液的制備

照《中國(guó)藥典》（2015年版四部）8004緩沖液的配制方法配制pH分別為5.0、5.8、6.5、7.4和8.0的磷酸鹽緩沖液（PBS）.

pH1.2鹽酸溶液配制:取濃鹽酸2mL加入200mL純水中，加鹽酸使pH至1.2，即得.

2.1.2 水飽和正辛醇溶液及正辛醇飽和水溶液的制備

分別精密量取正辛醇和水相（包括pH1.2鹽酸溶液和pH為5.0、5.8、6.5、7.4和8.0的PBS緩沖液）各200mL于500mL具塞錐形瓶中，于25℃下磁力攪拌24h后，靜置過夜，取上層作為水飽和正辛醇溶液，取下層作為正辛醇飽和水溶液.

2.1.3 對(duì)照品溶液的配制

精密稱取VM-26適量，加甲醇制備成0.2mg·mL-1的VM-26儲(chǔ)備液，加甲醇稀釋配制成10μg·mL-1的VM-26對(duì)照品溶液.

2.1.4 供試品溶液的制備

精密稱取VM-26 10mg于100mL容量瓶中，加水飽和正辛醇超聲30min溶解后定容，得到VM-26貯備液.精密取VM-26儲(chǔ)備液2mL，精密加入同體積的水相溶液（pH1.2鹽酸溶液與pH分別為5.0、5.8、6.5、7.4和8.0的 PBS緩沖液）于10mL具塞塑料管中，于25℃下在恒溫?fù)u床中振搖24h，使藥物平衡分布在油水兩相中4000r·min-1離心10min，取上層正辛醇溶液1mL于10mL容量瓶中，加甲醇稀釋并定容，即得VM-26供試品溶液.

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

取VM-26適量，以甲醇為溶劑制備濃度為10μg·mL-1的VM-26溶液，以乙腈-0.1%磷酸緩沖液（50:50）為流動(dòng)相，使用PDA檢測(cè)器于210～400nm進(jìn)行掃描，得到色譜圖如圖1，在230nm和280nm處各有一吸收峰值，參照國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)所用波長(zhǎng)為280nm，因此選用280nm作為檢測(cè)波長(zhǎng).

圖1 VM-26溶液的色譜圖

2.3 色譜條件

色譜柱:WatersSymmetryC18柱（4.6×250mm，5μm），流動(dòng)相:乙腈-0.1%磷酸緩沖液（50:50），流速:1mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng):280nm，柱溫:30℃，進(jìn)樣量:10μL.理論塔板數(shù)按VM-26計(jì)應(yīng)不低于3000.

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 專屬性試驗(yàn)

分別取VM-26對(duì)照品溶液、VM-26供試品溶液（水飽和正辛醇為溶劑）進(jìn)樣HPLC檢測(cè)，記錄色譜圖.

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密量取VM-26儲(chǔ)備液0.1mL、0.2mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL和5.0mL于10mL容量瓶中，加甲醇制備成濃度分別為2μg·mL-1、4μg·mL-1、10μg·mL-1、20μg·mL-1、40μg·mL-1、100μg·mL-1系列VM-26溶液進(jìn)樣分析，以VM-26濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），用最小二乘法進(jìn)行線性回歸.

2.4.3 精密度試驗(yàn)

取VM-26對(duì)照品溶液進(jìn)樣HPLC檢測(cè)，日內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣5次，連續(xù)進(jìn)樣3天，記錄峰面積，計(jì)算日內(nèi)、日間RSD%.

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.1.4”項(xiàng)下的供試品溶液，分別在磁力攪拌0h、2h、4h、6h、8h、12h、24h后取樣，進(jìn)HPLC檢測(cè)，計(jì)算RSD%.

2.4.5 回收率試驗(yàn)

分別精密稱定VM-26 8mg、10mg和12mg VM-26于100mL容量瓶中，加水飽和正辛醇溶液稀釋并定容，取上述溶液加甲醇稀釋得到濃度為 8μg·mL-1、10μg·mL-1和 12μg·mL-1供試品溶液，每個(gè)濃度平行3份樣品.進(jìn)HPLC檢測(cè)，記錄峰面積，計(jì)算得到平均回收率及RSD%.

2.3 VM-26油水分配系數(shù)的測(cè)定

2.3.1 不同正辛醇-水比例VM-26P值的測(cè)定

本試驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)正辛醇/水的比例進(jìn)行P值的測(cè)定.取VM-26儲(chǔ)備液2mL 3份，分別加入1mL、2mL和4mL正辛醇飽和水溶液，按照“2.1.4”項(xiàng)下方法制備VM-26溶液，進(jìn)HPLC檢測(cè)，計(jì)算正辛醇中VM-26平衡濃度.同時(shí)取VM-26儲(chǔ)備液1mL于10mL容量瓶中，加甲醇定容后進(jìn)HPLC檢測(cè)，記錄峰面積并計(jì)算正辛醇中含藥量濃度.并采用下列公式計(jì)算P值，結(jié)果見表1，正辛醇與水例為2∶1與2∶4時(shí)P值相差不大，因此選擇油水比例為2∶2.

式中:P為VM-26的油水分配系數(shù)；Cn-o為正辛醇中VM-26平衡濃度；Cn正辛醇中初始含藥量濃度.

2.3.2 不同pH條件下P值的測(cè)定

取“2.1.4”項(xiàng)下的VM-26儲(chǔ)備液2mL 6份，分別加入正辛醇飽和pH1.2鹽酸溶液、pH5.0、pH5.8、pH6.5、pH7.4及pH8.0的PBS緩沖溶液，照“2.2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算正辛醇中含藥量濃度并計(jì)算P值.

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

3.1.1 專屬性試驗(yàn)

VM-26對(duì)照品溶液、VM-26供試品溶液色譜圖見圖2，結(jié)果理論塔板數(shù)不低于3000，分離度大于1.5.

圖2 VM-26對(duì)照品溶液與供試品溶液色譜圖

3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以VM-26濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），得出回歸方程y=6001.4x-5669.6（R=0.9993），結(jié)果表明VM-26質(zhì)量濃度在2～100μg·mL-1內(nèi)線性關(guān)系良好.

3.1.3 精密度試驗(yàn)

VM-26對(duì)照品溶液在日內(nèi)、日間RSD%分別為0.43%、1.02%，結(jié)果表明該方法精密度良好.

3.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

供試品溶液攪拌24h內(nèi)樣品RSD%為1.67，結(jié)果表明VM-26供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定.

3.1.5 回收率試驗(yàn)

VM-26高、中、低三個(gè)濃度的平均回收率為100.84%，RSD%為1.79%，表明該方法準(zhǔn)確度良好.

3.2 VM-26油水分配系數(shù)的測(cè)定

3.2.1 不同正辛醇-水比例VM-26P值的測(cè)定

在不同正辛醇-水比例條件下VM-26P值的測(cè)定結(jié)果見表1，正辛醇與水例為2∶1與2∶4時(shí)P值相差不大，因此選擇油水比例為2∶2.

表1 不同正辛醇-水比例VM-26P值的測(cè)定

3.2.2 不同pH條件下P值的測(cè)定

在不同pH條件下VM-26P值的測(cè)定結(jié)果見表2及圖3，pH=7.4時(shí)lgP值最大，pH=6.5lgP值最小，所有水相中的lgP值均大于2且無明顯差異.

表2 不同pH條件下P值的測(cè)定結(jié)果

圖3 不同PH條件下P值的測(cè)定結(jié)果

4 討論

P值測(cè)定的方法主要有搖瓶法、反相高效液相色譜法和產(chǎn)生柱法，其中，反相高效液相色譜法需建立已知P值對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，成本較高；而產(chǎn)生柱法測(cè)定步驟較多，平衡時(shí)間長(zhǎng).亦有文獻(xiàn)采用硅膜平衡器法和固相微萃取法［16］，該方法操作復(fù)雜，成本較高.因此選用搖瓶法進(jìn)行P值測(cè)定，此法成本較低、易于操作.選擇油相應(yīng)與水相互不相溶，目前文獻(xiàn)多以正辛醇作為油相［17-18］，主要是由于正辛醇與水互不相溶，且極性與生物膜相似［19］，因此本試驗(yàn)選擇正辛醇-水作為分配體系.

VM-26水溶性差，水中的VM-26濃度太低無法檢出，故本試驗(yàn)將VM-26溶于油相中，通過測(cè)定平衡前水飽和正辛醇的含藥量和平衡后正辛醇含藥量之差來計(jì)算水相中含藥量，進(jìn)一步計(jì)算VM-26P值.正辛醇-水分配體系中彼此會(huì)有少許溶解，因此在實(shí)驗(yàn)前應(yīng)先預(yù)飽和正辛醇與水，以免在實(shí)驗(yàn)過程中水與正辛醇之前相互分配平衡，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果［17］.

藥物的P值與藥物在體內(nèi)吸收、分布和轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)，P值越大則生物膜的滲透性越高，有利于藥物在體內(nèi)的吸收［20-21］.而藥物最佳的P值分布范圍是-1

結(jié)果顯示，VM-26在pH5.0～8.0時(shí)，其lgP值均大于2，表明藥物脂溶性好，在體內(nèi)滲透性高；隨著pH變化無明顯差異，VM-26在緩沖溶液中以非解離型藥物形式存在，不發(fā)生電離.上述結(jié)論為研究開發(fā)更加有效、安全的各種VM-26制劑提供一定參考價(jià)值.