邢旻琰，何美文，余佳澤，張超

0 引言

結(jié)腸癌早期特異性癥狀不明顯，而術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移影響了治療效果。當(dāng)前，闡明結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制對(duì)尋找新的分子靶點(diǎn)具有重要意義。miRNA是一類非編碼小分子RNA。通過與靶基因mRNA 3’-UTR完全或不完全互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，導(dǎo)致靶miRNA降解或翻譯抑制來調(diào)控靶基因的表達(dá)。研究證實(shí)，在結(jié)腸癌細(xì)胞中存在多個(gè)miRNA表達(dá)異常，且與結(jié)腸癌患者的分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等病理特征之間存在相關(guān)性，提示miRNA可能參與結(jié)腸癌的發(fā)生及發(fā)展[1-2]。SMURF1是HECT型E3泛素連接酶，參與多個(gè)生物學(xué)信號(hào)通路，近來研究發(fā)現(xiàn)，其在結(jié)腸癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，并協(xié)同泛素蛋白酶系統(tǒng)降解抑癌蛋白，表現(xiàn)出促癌功能[3]。miRNA-125a在多種腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[4]。本研究旨在分析miRNA-125a與結(jié)腸癌相關(guān)臨床指標(biāo)的相關(guān)性，并探尋其通過靶向調(diào)控SMURF1在結(jié)腸癌的病理過程中所發(fā)揮的作用，為結(jié)腸癌的診斷及治療尋找新靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2017年6月至2018年1月在我院收治的50例結(jié)腸癌患者，其中男21例、女29例，平均年齡（59.72±5.36）歲。所有患者無化療或放療史。

1.2 外周血采集

納入研究的結(jié)腸癌患者均于清晨空腹?fàn)顩r下進(jìn)行外周靜脈血抽取，具體操作如下：采用一次性血清分離膠管，抽取外周靜脈血約3 ml；待血清析出后以1 000g離心10 min，取上層血清保存至-80℃冰箱待檢測(cè)。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)外周血miRNA-125a和SMURF1的表達(dá)

取0.5 ml血清標(biāo)本，采用TRIzol法提取血清總RNA，實(shí)驗(yàn)步驟按照TRIzol試劑盒說明書進(jìn)行。將提取到的總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。按照qRT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)。miRNA-125a的測(cè)序PCR引物為：上游5’-TGTGTCTCTTTCACAGTGGATC-3’和下游5’-CCATCG TGTGGGTCTCAAG-3’。

1.4 SW480細(xì)胞培養(yǎng)

使用含10%胎牛血清、100 u/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)條件下培養(yǎng)SW480細(xì)胞。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

根據(jù)轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞的轉(zhuǎn)染物進(jìn)行分組：miR-NC組（轉(zhuǎn)染negative control miRNA mimics），miRNA-125a模擬物轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染miRNA-125a模擬物），miRNA-125a模擬物+SMURF1轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染miRNA-125a模擬物和SMURF1）。

1.6 熒光素酶報(bào)告基因法檢測(cè)miRNA-125a與靶基因SMURF1的結(jié)合

利用microRNA靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miRNA-125a與SMURF1可能的作用位點(diǎn)。構(gòu)建SMURF1野生型3’-UTR熒光素酶質(zhì)粒pMIR-WT和突變型質(zhì)粒pMIR-Mut：根據(jù)GenBank中登錄的human SMURF1基因序列，上游：5’-ACTCCTGGTACA GCGACTCCGAAATCCT-3’，下游：5’-GTCCCT GCACTGTTGTCCTTTGCTCATA-3’，采用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物，PCR擴(kuò)增目的基因片段，并連接入野生型載體，轉(zhuǎn)化及菌液PCR鑒定，送南京金斯瑞科技有限公司測(cè)序，測(cè)序鑒定正確的重組載體命名為pMIR-WT。突變載體的構(gòu)建步驟與雙熒光素酶載體的構(gòu)建基本一致 ，利用PCR突變法在野生型載體基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)突變引物，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。以野生型載體為模板進(jìn)行擴(kuò)增，鑒定正確的重組載體命名為pMIR-Mut。將pMIR-WT、pMIR-Mut與miR-125a模擬物和negative control miRNA mimics共轉(zhuǎn)染進(jìn)SW480細(xì)胞，熒光素酶檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組熒光素酶活性。

1.7 Western blot檢測(cè)SMURF1蛋白表達(dá)

將miRNA-125a模擬物和negative control miRNA mimics分別轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞中，36 h后用IP裂解液收集細(xì)胞。按照Western blot操作流程檢測(cè)SMURF1蛋白的表達(dá)水平。

1.8 HE染色

將腫瘤組織經(jīng)固定液固定，石蠟包埋，3～4 μm厚切片，45℃恒溫箱中烘干后進(jìn)行HE染色。

1.9 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖

參照CCK-8試劑盒說明書步驟進(jìn)行，各組轉(zhuǎn)染24 h后，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加10 μl CCK-8，37℃培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀上480 nm波長(zhǎng)處測(cè)定A值。

1.10 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移

各組轉(zhuǎn)染48 h后，細(xì)胞經(jīng)胰酶消化吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液，接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，恒溫培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞長(zhǎng)成單層（鋪滿培養(yǎng)板底部）棄去培養(yǎng)液，在每孔中央劃出一個(gè)劃痕，洗去死亡細(xì)胞，顯微鏡下拍照。利用軟件測(cè)量并計(jì)算24 h細(xì)胞遷移距離。

1.11 流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞周期

懸浮并收集不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞，0.9%氯化鈉溶液沖洗細(xì)胞兩遍，70%乙醇固定。加入碘化丙啶DNA熒光染色（PI:50 mg/L, 1% Triton X-100），4℃冰箱避光染色30 min，銅網(wǎng)過濾，取合格的單細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.12 構(gòu)建結(jié)腸癌腫瘤異種移植小鼠模型

取分別轉(zhuǎn)染miRNA-125a模擬物和negative control miRNA mimics的結(jié)腸癌SW480細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至2×108個(gè)/毫升。取0.1 ml細(xì)胞懸液注射于每只裸鼠左前肢腋窩皮下，將裸鼠隨機(jī)分為兩組，分別注射轉(zhuǎn)染了miRNA-125a模擬物和轉(zhuǎn)染了negative control miRNA mimics的SW480細(xì)胞。每日觀察裸鼠皮下腫瘤生長(zhǎng)情況，21天后將腫瘤從裸鼠身上分離，PCNA染色分析細(xì)胞增殖情況。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用（±s）表示，兩組樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-125a在結(jié)腸癌和癌旁正常組織的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示，相比癌旁正常組織，結(jié)腸癌組織中miRNA-125a的表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖1A。同時(shí)，miRNA-125a在發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移腫瘤組織中的表達(dá)水平顯著低于未轉(zhuǎn)移腫瘤組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖1B。提示miRNA-125a可能與結(jié)腸癌的發(fā)生及發(fā)展有關(guān)。

圖1 miRNA-125a在結(jié)腸癌和癌旁正常組織中的表達(dá)Figure1 miRNA-125a expression in colon cancer and adjacent normal tissues

2.2 miRNA-125a與結(jié)腸癌患者臨床指標(biāo)的相關(guān)性

分析結(jié)果表明，miRNA-125a的表達(dá)水平與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤(rùn)深度和腫瘤直徑相關(guān)（均P＜0.01），與性別和年齡無關(guān)，見表1。

表1 miRNA-125a與結(jié)腸癌患者臨床指標(biāo)的關(guān)系Table1 Relationship between miRNA-125a and clinical indicators of patients with colon cancer

2.3 miRNA-125a通過結(jié)合SMURF1的3'-UTR來抑制SMURF1的表達(dá)

根據(jù)microRNA靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)潛在的miRNA-125a靶基因?yàn)镾MURF1，見圖2A。將miRNA-125a模擬物、negative control miRNA mimics（miR-NC）以及構(gòu)建的pMIR-WT和pMIR-Mut質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入SW480細(xì)胞，36 h后檢測(cè)熒光素酶活性。結(jié)果顯示，相比miR-NC組，miRNA-125a模擬物轉(zhuǎn)染組pMIR-WT質(zhì)粒熒光素酶活性顯著降低（P＜0.01），而pMIR-Mut質(zhì)粒熒光素酶活性無明顯變化，見圖2B。結(jié)果顯示miRNA-125a可以通過結(jié)合SMURF1的3’-UTR進(jìn)而抑制SMURF1的表達(dá)。

圖2 miRNA-125a結(jié)合SMURF1的3’-UTR抑制熒光素酶活性Figure2 miRNA-125a binded 3'-UTR of SMURF1 to inhibit luciferase activity

2.4 miRNA-125a抑制SMURF1 mRNA翻譯及蛋白水平

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示miRNA-125a模擬物轉(zhuǎn)染組中SMURF1 mRNA表達(dá)水平明顯低于miRNC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖3A。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，相比miR-NC組，miRNA-125a模擬物轉(zhuǎn)染組中SMURF1蛋白表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖3B。

圖3 miRNA-125a抑制SMURF1 mRNA和蛋白表達(dá)Figure3 miRNA-125a inhibited mRNA and protein expression of SMURF1

2.5 SMURF1與結(jié)腸癌患者臨床指標(biāo)的相關(guān)性

統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，SMURF1的表達(dá)水平與腫瘤分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤(rùn)深度和腫瘤直徑呈正相關(guān)（P＜0.01），與性別和年齡無關(guān)，見表2。

表2 SMURF1與結(jié)腸癌患者臨床指標(biāo)的關(guān)系Table2 Relationship between SMURF1 and clinical indicators of patients with colon cancer

2.6 SMURF1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)

HE染色結(jié)果顯示，相比癌旁正常組織，結(jié)腸癌組織中SMURF1表達(dá)水平明顯升高，見圖4A。而結(jié)腸癌患者血清中miRNA-125a表達(dá)水平與SMURF1表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)性，見圖4B。

2.7 miRNA-125a和SMURF1與細(xì)胞增殖、遷移及周期的相關(guān)性

CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，miRNA-125a模擬物轉(zhuǎn)染組A值明顯低于miR-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.029）。而miRNA-125a模擬物+SMURF1轉(zhuǎn)染組A值明顯高于miRNA-125a模擬物轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.006），見圖5A。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，miRNA-125a模擬物轉(zhuǎn)染組的S期細(xì)胞比值明顯低于miR-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.048），而miRNA-125a模擬物+SMURF1轉(zhuǎn)染組的S期細(xì)胞比值明顯高于miRNA-125a模擬物轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.004），見圖5B。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，miRNA-125a模擬物轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞遷移距離明顯低于miR-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.031），而miRNA-125a模擬物+SMURF1轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞遷移距離明顯高于miRNA-125a模擬物轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002），見圖5C。

2.8 miRNA-125a抑制小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)

采用SW480細(xì)胞構(gòu)建結(jié)腸癌腫瘤異種移植小鼠模型，將negative control miRNA mimics（miRNC），miRNA-125a模擬物轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞并注射到裸鼠皮下21 d后，切除腫瘤并稱重，miRNA-125a模擬物轉(zhuǎn)染組腫瘤重量明顯低于miR-NC對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003），見圖6A。PCNA染色結(jié)果顯示, 相比miR-NC對(duì)照組，miRNA-125a模擬物轉(zhuǎn)染組的SW480細(xì)胞中SMURF1陽性信號(hào)明顯減少，且細(xì)胞增殖明顯降低，見圖6B。

圖4 SMURF1在腫瘤組織中的表達(dá)Figure4 Expression of SMURF1 in colon cancer tissues

圖5 miRNA-125a和SMURF1對(duì)細(xì)胞增殖、遷移及周期的影響Figure5 Effects of miRNA-125a and SMURF1 on cell proliferation, migration and cell cycle of colon cancer

圖6 miRNA-125a抑制小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)Figure6 miRNA-125a inhibited tumor growth in mice

3 討論

結(jié)腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，具有疾病隱匿、癥狀不典型且易轉(zhuǎn)移的生物學(xué)行為特征。目前雖然大量研究證實(shí)TGF-β/Smad[5]、RhoA[6]、PI3K/AKT[7]、Wnt[8]等信號(hào)通路的異?；罨蚴Щ钆c結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但對(duì)結(jié)腸癌的臨床治療仍未有較為突出的貢獻(xiàn)。因此，從新的生物學(xué)層面挖掘其發(fā)展機(jī)制具有重要意義。miRNA是一類長(zhǎng)度為22～28個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，與許多惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)系，它參與調(diào)控細(xì)胞凋亡、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物學(xué)事件，起著癌基因或抑癌基因的作用。有報(bào)道證實(shí)miR-143、miR-145及miR-101在結(jié)腸癌中低表達(dá)[9-10]，可能是潛在的抑癌因子。miR-106a、miR-181b、miR-203[11-13]等在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，提示miRNA在結(jié)腸癌的發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

Lyu等[14]發(fā)現(xiàn)miRNA-125a可通過抑制ERBB2和ERBB3的表達(dá)來抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移；miRNA-125a表達(dá)受EGFR調(diào)節(jié)，抑制肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移；此外，miRNA-125a可以抑制ARID3B來負(fù)性調(diào)節(jié)卵巢癌EMT，從而抑制卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。然而，miRNA-125a在結(jié)腸癌中的作用尚未有相關(guān)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)miRNA-125a表達(dá)量隨結(jié)腸癌發(fā)展程度的加深呈降低趨勢(shì)，提示miRNA-125a與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

SMURF1屬于HECT型E3泛素連接酶，參與TGF-β/Smad、Wnt、BMP、MAPK等多種生物學(xué)信號(hào)通路的調(diào)控。SMURF1高表達(dá)可以影響腫瘤組織的侵襲、轉(zhuǎn)移，與腫瘤預(yù)后關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn)SMURF1促進(jìn)抑癌蛋白的快速降解，是促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要因子[15]。本研究檢測(cè)到結(jié)腸癌患者腫瘤組織中miRNA-125a的表達(dá)水平顯著降低，且結(jié)腸癌患者血清中SMURF1表達(dá)水平隨結(jié)腸癌發(fā)展程度（腫瘤分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤(rùn)深度和腫瘤直徑）加深而呈升高趨勢(shì)，而miRNA-125a表達(dá)水平與SMURF1表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)性。進(jìn)一步HE染色發(fā)現(xiàn)，SMURF1在結(jié)腸癌組織中表達(dá)水平明顯升高，提示SMURF1在結(jié)腸癌中發(fā)揮促癌作用，與以往研究結(jié)果相似[16]。本研究采用microRNA靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)獲得SMURF1為miRNA-125a潛在靶基因，并驗(yàn)證了miRNA-125a可以通過結(jié)合SMURF1的3’-UTR進(jìn)而抑制SMURF1的表達(dá)，同樣miRNA-125a能夠抑制SMURF1的mRNA翻譯和SMURF1蛋白水平表達(dá)。這些結(jié)果提示miRNA-125a可能通過對(duì)SMURF1的靶向調(diào)控參與到結(jié)腸癌的病理過程中。本研究還發(fā)現(xiàn)miRNA-125a可通過抑制SMURF1的表達(dá)水平從而抑制結(jié)腸癌的發(fā)展。在本研究中，我們將miRNA-125a模擬物轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞注射到裸鼠皮下，觀察到miRNA-125a能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)及SMURF1的表達(dá)。這進(jìn)一步驗(yàn)證了miRNA-125a對(duì)結(jié)腸癌發(fā)揮抑癌作用。

綜上所述，mi RNA-125 a 通過結(jié)合靶基因SMURF1的3’-UTR，抑制結(jié)腸癌促癌因子SMURF1的表達(dá)，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和S期細(xì)胞的聚集，在結(jié)腸癌的發(fā)展過程中發(fā)揮抑制作用。因此，miRNA-125a可能為結(jié)腸癌的診斷及治療提供新的研究方向。