安娟，潘元明，康倩，王昕，孫偉，晏宇鵬，鄭偉

0 引言

青海省胃癌發(fā)病率居全國首位，研究表明高海拔、高寒、缺氧、干燥的自然環(huán)境，以及高鹽、含亞硝胺類化合物的飲食習(xí)慣等因素導(dǎo)致青海省腫瘤發(fā)病率較高[1]。然而，目前對胃癌的早期診斷及治療方案的選擇均缺少有效的客觀指標(biāo)，從而導(dǎo)致胃癌的5年生存率并無明顯改善[1-2]。

前期工作獲得了胃癌基因差異表達譜和miRNA差異表達譜，通過生物信息學(xué)分析，建立了microRNA（miRNA）-mRNA分子間相互作用模式[3]。近年的研究表明miRNA可通過調(diào)控細胞增殖、凋亡和分化，促進或抑制腫瘤的惡性表型[4]，相比正常組織來源的細胞，腫瘤組織中miRNA存在明顯異常表達，這些異常表達的miRNA在腫瘤形成中扮演重要角色，可作為腫瘤病因?qū)W、生物學(xué)特性、組織分型和臨床分級分期的分子標(biāo)志物[5]。由于miRNA較穩(wěn)定，可在石蠟組織以及血清或血漿中檢測到，因此，miRNA作為臨床輔助診斷和預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物具有良好的應(yīng)用前景[6]。本研究前期通過胃癌miRNA表達譜分析獲得關(guān)鍵基因miR-181d，結(jié)合胃癌基因差異表達譜分析發(fā)現(xiàn)其潛在靶基因PDCD4，在胃癌組織中檢測發(fā)現(xiàn)miR-181d與PDCD4的表達具有一定的負相關(guān)[7]。本實驗進一步在青海地區(qū)胃癌患者血清中進行miR-181d與PDCD4的檢測，并分析其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 細胞系 實驗選用胃癌細胞系BGC823、AGS、N87、SGC7901和MGC803；1株永生化胃黏膜細胞系GES1。其中GES1、BGC823、N87、SGC7901和MGC803細胞系是國內(nèi)建系，均來自北京腫瘤防治研究所，AGS細胞系購自美國ATCC公司。

1.1.2 組織標(biāo)本及臨床病例資料 58例胃癌血清來源于2014—2016年青海大學(xué)附屬醫(yī)院術(shù)前未經(jīng)放化療患者，50例健康者血清標(biāo)本來自青海大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科，并與患者簽訂知情同意書。

1.1.3 試劑藥品 胎牛血清購自美國Hyclone公司；DMEM培養(yǎng)基和RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司；miRNeasy Serum/Plasma Kit購自德國Qiagen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（EasyScript Firststrand cDNA Synthesis Supermix，AE301）購自北京TransGen公司；引物和Oligo（dT）15購自北京奧科生物公司；PDCD4抗體和β-action抗體購自美國Sigma公司；ELISA試劑盒購自廈門慧嘉生物科技有限公司；通用型鼠二步法（PV6001, Power VisionTM）試劑盒和DAB顯色試劑盒購自北京中杉生物技術(shù)公司。ECL Plus檢測試劑盒購自英國Amersham Biosciences公司, Dual-Luciferase E1910報告基因檢測系統(tǒng)購自美國Promega公司；Lipofectamine RNAiMAX購自美國Invitrogen公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 ELISA實驗 用50 mmol/L的碳酸鹽包被緩沖液（pH=9.6）溶解抗原，使抗原濃度為10～20 μg/ml，加100微升每孔到 96 孔酶標(biāo)板，4℃放置過夜。第二天棄去包被液后，用PBST洗滌3次，每孔加入150 μl 1%BSA37℃封閉1 h。PBST洗滌3次后，每孔加入100 μl不同倍比稀釋度的血清，并加入對照樣品，37℃孵育2 h。PBST洗滌5次后，加入100 μl稀釋后的HRP標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 h。PBST洗滌5次，顯色劑顯色20 min后，酶標(biāo)儀上讀取A450吸光度值。

1.2.2 Real-time PCR RNA的提取 血清和血漿中的總RNA提取使用miRNeasy Serum/Plasma Kit試劑盒完成，操作步驟及注意事項按照miRNeasy Serum/Plasma Kit說明書進行。cDNA制備：采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，過程如下：取5.0 μg總RNA，加入0.5 μl Oligo（dT）或加入0.5 μl miR-181d反轉(zhuǎn)錄引物，2×ES反應(yīng)混合物10 μl，EasyScriptRT/RI酶混合物1 μl，補Rnase-free H2O至20 μl，42℃孵育30 min。85℃加熱5 min失活EasyScript RT。分裝后-20°C保存?zhèn)溆?。miR-181d成熟體Real-time PCR：根據(jù)miRNA序列設(shè)計特異性反轉(zhuǎn)錄引物，所使用的反轉(zhuǎn)錄及PCR引物見表1。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件設(shè)置為：16℃ 30 min；37℃ 30 min；72℃ 10 min。熒光實時定量PCR反應(yīng)采用SYBR green-based Real-time PCR （Applied Biosystems AB）系統(tǒng)。反應(yīng)程序設(shè)置為：95℃ 5 min，預(yù)變性；95℃ 30 s，40個循環(huán)；57℃ 30 s，延伸。以miR-16作為內(nèi)參[8]，采用2-ΔΔCT相對定量計算方法檢測miRNA差異表達水平，見表1。

1.2.3 Western blot分析 在直徑100 mm平皿中生長良好密度90%的貼壁培養(yǎng)細胞中加入200～300 μl 85℃的1×SDS凝膠加樣緩沖液裂解細胞；裂解樣品經(jīng)煮沸、超聲、離心后，取上清液，UV定量，-20℃分裝保存。將50 μg樣品加入2×SDS凝膠加樣緩沖液，100℃變性10 min，順序加樣，行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，經(jīng)濕式電轉(zhuǎn)儀（Bio-Rad）恒壓冰浴轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶4℃封閉過夜；孵育一抗PDCD4、β-actin，4℃過夜。加入相應(yīng)種屬二抗孵育1 h，化學(xué)發(fā)光、顯影、定影、觀察雜交信號。

表1 引物序列列表Table1 Primer sequence list

1.2.4 胃癌細胞系的瞬時轉(zhuǎn)染 使用Lipofectamine RNAiMAX將60 nmol/L miR-181d mimics或AntimiR-181d轉(zhuǎn)染到AGS和BGC823細胞培養(yǎng)皿中；37℃孵育48 h后進行Real-time PCR、Western blot和雙熒光報告素酶檢測。

1.2.5 雙熒光報告素酶檢測 PDCD4基因的3’-UTR熒光素酶報告PCR引物從以下人類cDNA擴增：PDCD4正向引物，5’-GCGAGCTC CTGGTTCTA GAAGAATGTA CAC-3’；PDCD4反向引物，5′-GCAAGCTTCA GGTA ATATTTTCTC ATACATTAGG-3’。變異的miR-181d的結(jié)合位點，在PDCD4 3’-UTR互補序列（GAATGT）所取代GTTAGA。對PCR產(chǎn)物進行酶切用SacⅠ和HindⅢ和插入表達載體。HEK-293細胞接種于24孔板，轉(zhuǎn)染野生型或突變型細胞3’-UTR報告-質(zhì)粒pRLTK，或轉(zhuǎn)染miR-NC和miR-181d。進行熒光素酶檢測24 h使用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)轉(zhuǎn)染后。采用Dual-Luciferase E1910報告基因檢測系統(tǒng)，獲得miRNA是否對靶基因3'-UTR產(chǎn)生調(diào)控作用。LARⅡ：用Luciferase Assay BufferⅡ溶解凍干粉Luciferase Assay Substrate。將50×Stop & Glo?Substrate加入到所需要量的Stop & Glo Buffer中，使終濃度成為1倍濃度。通過監(jiān)測熒光素酶的活性變化，即可獲得miRNA是否對靶基因3'-UTR產(chǎn)生調(diào)控作用，當(dāng)miRNA與3'-UTR靶標(biāo)區(qū)域互補配對時，熒光素酶活力將顯著降低；反之，當(dāng)miRNA與報告基因（包含靶標(biāo)區(qū)域突變）無法形成有效的互補配對時，熒光素酶活力將與對照無顯著區(qū)別。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS23.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。miR-181d和PDCD4在胃癌血清和健康對照血清基因表達差異分析采用卡方檢驗，其他結(jié)果采用studentt-test檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman分析，臨床病理資料分析采用Cox多因素生存分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-181d和PDCD4基因在胃癌細胞系及配對胃癌組織中的表達

Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-181d在胃癌細胞系BGC823、SGC7901、MGC803、AGS、N87中存在顯著的差異表達，在永生化胃黏膜上皮細胞系GES1中表達量較低；而在胃癌細胞系BGC823、MGC803、SGC7901中表達較GES1顯著增加，在AGS和N87中表達水平較高于GES1細胞中的表達，見圖1A。相反，預(yù)測的下游靶基因PDCD4在mRNA和蛋白水平均顯示胃癌細胞系中的表達低于GES1，見圖1B。為了檢測PDCD4蛋白是否在胃癌細胞中分泌，我們首先將胃癌細胞系BGC823、SGC7901、MGC803、AGS、N87和GES1通過雙無血清培養(yǎng)48 h，然后分別提取上清蛋白并進行Western blot實驗發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)在細胞上清蛋白上樣濃度一致性的前提下，PDCD4在AGS、SGC7901、N87和永生化胃黏膜上皮細胞系GES1細胞上清液中均有表達，見圖1C～D。

2.2 miR-181d及PDCD4在胃癌患者及健康者血清中的表達

結(jié)果顯示miR-181d在胃癌患者血清中的表達高于健康體檢者血清（P＜0.001），而PDCD4蛋白在胃癌患者血清中的表達低于健康者血清（P＜0.05）, 通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)胃癌患者和健康者血清miR-181d與PDCD4蛋白表達呈負相關(guān)（R2=-0.44,R2=-0.426），以上結(jié)果提示血清miR-181d與PDCD4蛋白的表達呈負相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01） ，見圖2。

2.3 特征基因miR-181d及PDCD4的特異性和敏感度分析

ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清miR-181d的曲線下面積為0.818，敏感度為0.879，特異性為0.939，假陽性率為6.1%，假陰性率為12.1%（P＜0.001）；PDCD4基因的曲線下面積為0.939，敏感度為0.939，特異性為1.0，假陽性率為0，假陰性率為6.1%（P＜0.001）。提示二者用于體外診斷區(qū)分腫瘤和健康人群具有良好的特異性和敏感度，見圖3、表2。

圖1 miR-181d與PDCD4在GES1和胃癌細胞系中的表達Figure1 Expression of miR-181d and PDCD4 in GES1 and gastric cancer cell lines

圖2 miR-181d和PDCD4在胃癌患者及健康者血清中的表達Figure2 Expression of miR-181d and PDCD4 in serum of gastric cancer and normal group

圖3 miR-181d與PDCD4的ROC曲線分析Figure3 ROC analysis of miR-181d and PDCD4 curves

2.4 miR-181d與PDCD4血清水平的表達及與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

結(jié)合58例胃癌患者的臨床病理資料分析發(fā)現(xiàn)，血清miR-181d的表達分別與吸煙喝酒史呈正相關(guān)（P=0.015,P=0.034），與腫瘤發(fā)生部位呈正相關(guān)（胃底賁門：P＜0.001，胃體：P=0.017），與年齡、性別、民族、胃癌腫瘤的分化程度、胃癌患者臨床分期等無關(guān)（P＞0.05），見表3。而PDCD4的表達與飲酒史呈正相關(guān)（P＜0.001），與年齡、性別、民族、胃癌腫瘤的分化程度、胃癌患者臨床分期等無關(guān)（P＞0.05），見表4。

2.5 胃癌細胞系干擾/過表達miR-181d對PDCD4表達的影響

Real-time PCR和Western blot實驗發(fā)現(xiàn)，miR-181d mimics瞬間轉(zhuǎn)染AGS細胞后PDCD4的表達下降。而BGC823細胞瞬時轉(zhuǎn)染反義miR-181d 48 h后PDCD4的表達水平增加。進一步實驗發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-181d mimics后PDCD4在AGS細胞上清中的表達下降，而在BGC823細胞上清中的表達水平增加，見圖4。

圖4 在胃癌細胞中PDCD4的表達受miR-181d影響Figure4 miR-181d may affect PDCD4 expression in gastric cancer cell lines

2.6 熒光素酶報告基因分析

將miR-181d mimics或miR-NC一同轉(zhuǎn)染AGS細胞36 h，通過雙熒光報告系統(tǒng)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾miR-181d后，AGS細胞中的PDCD4熒光報告活性比miR-NC組高，而過表達miR-181d mimics可以降低BGC823細胞中PDCD4的熒光報告活性，提示miR-181d可以結(jié)合PDCD4的3′-UTR區(qū)，見圖5。進一步，PDCD4基因3′-UTR熒光素酶報告PCR引物從以下人類cDNA擴增：PDCD4的3′-UTR正向引物：5′-GCGAGCTC CTGGTTCTA GAAGAATGTA CAC-3′；PDCD4的3′-UTR反向引物：5′-GCAAGCTTCA GGTAATATTTTCTC ATACATTAGG-3′。將PDCD4 3′-UTR與miR-181d結(jié)合的3′-UTR的結(jié)合位點進行引物突變，以PDCD4 3′-UTR互補序列（GAATGT）取代GTTAGA。對PCR產(chǎn)物進行酶切用SacⅠ和HindⅢ，插入表達載體。HEK-293細胞接種于24孔板，轉(zhuǎn)染野生型或突變型PDCD4的3′-UTR報告質(zhì)粒體系pRL-TK、miR-NC和miR-181d。轉(zhuǎn)染后24 h使用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生型組熒光素酶活性低于突變型組，提示miR-181d可以結(jié)合并抑制PDCD4 3′-UTR區(qū)的熒光活性，見圖5。

表2 miR-181d及PDCD4表達在胃癌血清中表達的ROC曲線分析Table2 ROC curve analysis of miR-181d and PDCD4 expression in GC serum and normal groups

表3 血清miR-181d表達與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系Table3 Relationship between miR-181d expression in serum and clinicopathological characteristics

表4 血清PDCD4表達與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系Table4 Relationship between PDCD4 expression in serum and clinicopathological characteristics

3 討論

miRNA可參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的各個階段，并且不同類型的腫瘤具有特異性的miRNA表達譜，這些表達譜可有效反映腫瘤組織的發(fā)展與分化狀態(tài)[5]。同時, 血清miRNA較穩(wěn)定，可以抵抗核糖核酸酶、加熱、pH變化，并能長期保存和重復(fù)冷凍、解凍，作為腫瘤的生物標(biāo)志物，創(chuàng)造性地提供了一種非損傷性的腫瘤診斷手段[9-10]。在前期工作中通過結(jié)合胃癌基因差異表達譜和miRNA差異表達譜，發(fā)現(xiàn)特征基因miR-181d在胃癌中表達高于正常組織，且與預(yù)測的靶基因PDCD4的表達呈負相關(guān)[7]。本研究結(jié)果進一步發(fā)現(xiàn)，miR-181d在胃癌患者血清中的表達高于正常對照組，而PDCD4蛋白在胃癌患者血清中的表達低于正常對照組，且二者的表達呈負相關(guān)。通過ROC曲線分析顯示，miR-181d與PDCD4對區(qū)分胃癌組織和正常組織具有良好的特異性和敏感度。目前miRNA與胃癌的研究報道認(rèn)為，miRNAs可以促進或抑制胃癌的惡性表型，在胃癌進程中發(fā)揮癌基因或抑癌基因樣作用，可作為胃癌早診和預(yù)后的標(biāo)志物。近年來，研究者利用小鼠模型發(fā)現(xiàn)彌漫型胃癌早期診斷的血清miRNA可作為生物標(biāo)志物[11]。我國研究者以山東省臨朐縣胃癌高發(fā)現(xiàn)場胃癌患者為研究對象，通過miRNA芯片技術(shù)結(jié)合病例-對照和回顧前瞻性研究，確定血清中的miR-221、miR-744和miR-376c可作為一種新型的非侵入性的胃癌生物標(biāo)志物[12]。

圖5 miR-181d可結(jié)合在PDCD4的3'-UTR區(qū)發(fā)揮作用Figure5 miR-181d could bind to 3’-UTR region of PDCD4

miRNA可與下游潛在靶基因mRNA的3’-UTR通過不完全配對結(jié)合降低mRNA穩(wěn)定性或抑制靶基因的翻譯，從而參與調(diào)控基因表達[4-5]。本研究在AGS細胞中過表達miR-181d后PDCD4的表達下降。而在BGC823細胞中轉(zhuǎn)染反義miR-181d后PDCD4的表達水平增加。雙熒光報告系統(tǒng)提示miR-181d可以結(jié)合到PDCD4的3'-UTR區(qū)。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-181c和miR-181d位于同一個基因簇，在肝癌、胰腺癌、胃癌中表達均增高[13-14]，并且miR-181d在小細胞肺癌化療敏感度中起一定作用[15]，在H69AR及對化療耐藥患者中呈低表達，同時伴隨著BCL2高表達。上調(diào)miR-181d能降低BCL2表達水平，增加H69AR細胞對化療藥物的敏感度，miR-181d的表達與腫瘤的分期、化療敏感度及生存時間相關(guān)。miR-181d在食管鱗癌中作為抑癌基因負調(diào)節(jié)Derlin-1的表達[16]。在乳腺導(dǎo)管癌中miR-181a和miR-181d的過表達促進細胞進入S期，致使細胞增殖，同時在乳腺導(dǎo)管癌中miR-181a和miR-181d通過調(diào)控共同目標(biāo)PHLPP2和INPP4B磷酸酶升高調(diào)節(jié)Akt信號通路[17]。miR-181d/MALT1通過NF-κB通路調(diào)節(jié)膠質(zhì)母細胞瘤軸衰減間質(zhì)表型[18]。miR-181d在胰腺癌中高表達，下調(diào)miR-181d可負向調(diào)控KNAIN2抑制胰腺癌的惡性增殖[19]。本研究在胃癌患者的血清中檢測發(fā)現(xiàn)miR-181d的表達水平較健康者高，而PDCD4的表達水平明顯降低，二者的表達呈負相關(guān)，進一步實驗發(fā)現(xiàn)miR-181d可能是通過作用于PDCD4的3'-UTR發(fā)揮負向調(diào)控作用。綜上所述，在胃癌患者血清中聯(lián)合檢測miR-181d和PDCD4的表達將為胃癌血清分子診斷提供一定的理論依據(jù)。

（致謝：感謝青海大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤外科馬曉明醫(yī)師和檢驗科楊啟英醫(yī)師為本課題研究提供胃癌患者及健康體驗者血液標(biāo)本。）