安娟，潘元明，康倩，王昕，孫偉，晏宇鵬，鄭偉

0 引言

青海省胃癌發(fā)病率居全國(guó)首位，研究表明高海拔、高寒、缺氧、干燥的自然環(huán)境，以及高鹽、含亞硝胺類化合物的飲食習(xí)慣等因素導(dǎo)致青海省腫瘤發(fā)病率較高[1]。然而，目前對(duì)胃癌的早期診斷及治療方案的選擇均缺少有效的客觀指標(biāo)，從而導(dǎo)致胃癌的5年生存率并無(wú)明顯改善[1-2]。

前期工作獲得了胃癌基因差異表達(dá)譜和miRNA差異表達(dá)譜，通過(guò)生物信息學(xué)分析，建立了microRNA（miRNA）-mRNA分子間相互作用模式[3]。近年的研究表明miRNA可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和分化，促進(jìn)或抑制腫瘤的惡性表型[4]，相比正常組織來(lái)源的細(xì)胞，腫瘤組織中miRNA存在明顯異常表達(dá)，這些異常表達(dá)的miRNA在腫瘤形成中扮演重要角色，可作為腫瘤病因?qū)W、生物學(xué)特性、組織分型和臨床分級(jí)分期的分子標(biāo)志物[5]。由于miRNA較穩(wěn)定，可在石蠟組織以及血清或血漿中檢測(cè)到，因此，miRNA作為臨床輔助診斷和預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物具有良好的應(yīng)用前景[6]。本研究前期通過(guò)胃癌miRNA表達(dá)譜分析獲得關(guān)鍵基因miR-181d，結(jié)合胃癌基因差異表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)其潛在靶基因PDCD4，在胃癌組織中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-181d與PDCD4的表達(dá)具有一定的負(fù)相關(guān)[7]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步在青海地區(qū)胃癌患者血清中進(jìn)行miR-181d與PDCD4的檢測(cè)，并分析其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 細(xì)胞系 實(shí)驗(yàn)選用胃癌細(xì)胞系BGC823、AGS、N87、SGC7901和MGC803；1株永生化胃黏膜細(xì)胞系GES1。其中GES1、BGC823、N87、SGC7901和MGC803細(xì)胞系是國(guó)內(nèi)建系，均來(lái)自北京腫瘤防治研究所，AGS細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。

1.1.2 組織標(biāo)本及臨床病例資料 58例胃癌血清來(lái)源于2014—2016年青海大學(xué)附屬醫(yī)院術(shù)前未經(jīng)放化療患者，50例健康者血清標(biāo)本來(lái)自青海大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，并與患者簽訂知情同意書。

1.1.3 試劑藥品 胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；DMEM培養(yǎng)基和RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；miRNeasy Serum/Plasma Kit購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（EasyScript Firststrand cDNA Synthesis Supermix，AE301）購(gòu)自北京TransGen公司；引物和Oligo（dT）15購(gòu)自北京奧科生物公司；PDCD4抗體和β-action抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；ELISA試劑盒購(gòu)自廈門慧嘉生物科技有限公司；通用型鼠二步法（PV6001, Power VisionTM）試劑盒和DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)公司。ECL Plus檢測(cè)試劑盒購(gòu)自英國(guó)Amersham Biosciences公司, Dual-Luciferase E1910報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Promega公司；Lipofectamine RNAiMAX購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ELISA實(shí)驗(yàn) 用50 mmol/L的碳酸鹽包被緩沖液（pH=9.6）溶解抗原，使抗原濃度為10～20 μg/ml，加100微升每孔到 96 孔酶標(biāo)板，4℃放置過(guò)夜。第二天棄去包被液后，用PBST洗滌3次，每孔加入150 μl 1%BSA37℃封閉1 h。PBST洗滌3次后，每孔加入100 μl不同倍比稀釋度的血清，并加入對(duì)照樣品，37℃孵育2 h。PBST洗滌5次后，加入100 μl稀釋后的HRP標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 h。PBST洗滌5次，顯色劑顯色20 min后，酶標(biāo)儀上讀取A450吸光度值。

1.2.2 Real-time PCR RNA的提取 血清和血漿中的總RNA提取使用miRNeasy Serum/Plasma Kit試劑盒完成，操作步驟及注意事項(xiàng)按照miRNeasy Serum/Plasma Kit說(shuō)明書進(jìn)行。cDNA制備：采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，過(guò)程如下：取5.0 μg總RNA，加入0.5 μl Oligo（dT）或加入0.5 μl miR-181d反轉(zhuǎn)錄引物，2×ES反應(yīng)混合物10 μl，EasyScriptRT/RI酶混合物1 μl，補(bǔ)Rnase-free H2O至20 μl，42℃孵育30 min。85℃加熱5 min失活EasyScript RT。分裝后-20°C保存?zhèn)溆?。miR-181d成熟體Real-time PCR：根據(jù)miRNA序列設(shè)計(jì)特異性反轉(zhuǎn)錄引物，所使用的反轉(zhuǎn)錄及PCR引物見(jiàn)表1。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件設(shè)置為：16℃ 30 min；37℃ 30 min；72℃ 10 min。熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)采用SYBR green-based Real-time PCR （Applied Biosystems AB）系統(tǒng)。反應(yīng)程序設(shè)置為：95℃ 5 min，預(yù)變性；95℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；57℃ 30 s，延伸。以miR-16作為內(nèi)參[8]，采用2-ΔΔCT相對(duì)定量計(jì)算方法檢測(cè)miRNA差異表達(dá)水平，見(jiàn)表1。

1.2.3 Western blot分析 在直徑100 mm平皿中生長(zhǎng)良好密度90%的貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中加入200～300 μl 85℃的1×SDS凝膠加樣緩沖液裂解細(xì)胞；裂解樣品經(jīng)煮沸、超聲、離心后，取上清液，UV定量，-20℃分裝保存。將50 μg樣品加入2×SDS凝膠加樣緩沖液，100℃變性10 min，順序加樣，行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，經(jīng)濕式電轉(zhuǎn)儀（Bio-Rad）恒壓冰浴轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶4℃封閉過(guò)夜；孵育一抗PDCD4、β-actin，4℃過(guò)夜。加入相應(yīng)種屬二抗孵育1 h，化學(xué)發(fā)光、顯影、定影、觀察雜交信號(hào)。

表1 引物序列列表Table1 Primer sequence list

1.2.4 胃癌細(xì)胞系的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 使用Lipofectamine RNAiMAX將60 nmol/L miR-181d mimics或AntimiR-181d轉(zhuǎn)染到AGS和BGC823細(xì)胞培養(yǎng)皿中；37℃孵育48 h后進(jìn)行Real-time PCR、Western blot和雙熒光報(bào)告素酶檢測(cè)。

1.2.5 雙熒光報(bào)告素酶檢測(cè) PDCD4基因的3’-UTR熒光素酶報(bào)告PCR引物從以下人類cDNA擴(kuò)增：PDCD4正向引物，5’-GCGAGCTC CTGGTTCTA GAAGAATGTA CAC-3’；PDCD4反向引物，5′-GCAAGCTTCA GGTA ATATTTTCTC ATACATTAGG-3’。變異的miR-181d的結(jié)合位點(diǎn)，在PDCD4 3’-UTR互補(bǔ)序列（GAATGT）所取代GTTAGA。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切用SacⅠ和HindⅢ和插入表達(dá)載體。HEK-293細(xì)胞接種于24孔板，轉(zhuǎn)染野生型或突變型細(xì)胞3’-UTR報(bào)告-質(zhì)粒pRLTK，或轉(zhuǎn)染miR-NC和miR-181d。進(jìn)行熒光素酶檢測(cè)24 h使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)轉(zhuǎn)染后。采用Dual-Luciferase E1910報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)，獲得miRNA是否對(duì)靶基因3'-UTR產(chǎn)生調(diào)控作用。LARⅡ：用Luciferase Assay BufferⅡ溶解凍干粉Luciferase Assay Substrate。將50×Stop & Glo?Substrate加入到所需要量的Stop & Glo Buffer中，使終濃度成為1倍濃度。通過(guò)監(jiān)測(cè)熒光素酶的活性變化，即可獲得miRNA是否對(duì)靶基因3'-UTR產(chǎn)生調(diào)控作用，當(dāng)miRNA與3'-UTR靶標(biāo)區(qū)域互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，熒光素酶活力將顯著降低；反之，當(dāng)miRNA與報(bào)告基因（包含靶標(biāo)區(qū)域突變）無(wú)法形成有效的互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，熒光素酶活力將與對(duì)照無(wú)顯著區(qū)別。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。miR-181d和PDCD4在胃癌血清和健康對(duì)照血清基因表達(dá)差異分析采用卡方檢驗(yàn)，其他結(jié)果采用studentt-test檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman分析，臨床病理資料分析采用Cox多因素生存分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-181d和PDCD4基因在胃癌細(xì)胞系及配對(duì)胃癌組織中的表達(dá)

Real-time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-181d在胃癌細(xì)胞系BGC823、SGC7901、MGC803、AGS、N87中存在顯著的差異表達(dá)，在永生化胃黏膜上皮細(xì)胞系GES1中表達(dá)量較低；而在胃癌細(xì)胞系BGC823、MGC803、SGC7901中表達(dá)較GES1顯著增加，在AGS和N87中表達(dá)水平較高于GES1細(xì)胞中的表達(dá)，見(jiàn)圖1A。相反，預(yù)測(cè)的下游靶基因PDCD4在mRNA和蛋白水平均顯示胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)低于GES1，見(jiàn)圖1B。為了檢測(cè)PDCD4蛋白是否在胃癌細(xì)胞中分泌，我們首先將胃癌細(xì)胞系BGC823、SGC7901、MGC803、AGS、N87和GES1通過(guò)雙無(wú)血清培養(yǎng)48 h，然后分別提取上清蛋白并進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞上清蛋白上樣濃度一致性的前提下，PDCD4在AGS、SGC7901、N87和永生化胃黏膜上皮細(xì)胞系GES1細(xì)胞上清液中均有表達(dá)，見(jiàn)圖1C～D。

2.2 miR-181d及PDCD4在胃癌患者及健康者血清中的表達(dá)

結(jié)果顯示miR-181d在胃癌患者血清中的表達(dá)高于健康體檢者血清（P＜0.001），而PDCD4蛋白在胃癌患者血清中的表達(dá)低于健康者血清（P＜0.05）, 通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)胃癌患者和健康者血清miR-181d與PDCD4蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（R2=-0.44,R2=-0.426），以上結(jié)果提示血清miR-181d與PDCD4蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01） ，見(jiàn)圖2。

2.3 特征基因miR-181d及PDCD4的特異性和敏感度分析

ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清miR-181d的曲線下面積為0.818，敏感度為0.879，特異性為0.939，假陽(yáng)性率為6.1%，假陰性率為12.1%（P＜0.001）；PDCD4基因的曲線下面積為0.939，敏感度為0.939，特異性為1.0，假陽(yáng)性率為0，假陰性率為6.1%（P＜0.001）。提示二者用于體外診斷區(qū)分腫瘤和健康人群具有良好的特異性和敏感度，見(jiàn)圖3、表2。

圖1 miR-181d與PDCD4在GES1和胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)Figure1 Expression of miR-181d and PDCD4 in GES1 and gastric cancer cell lines

圖2 miR-181d和PDCD4在胃癌患者及健康者血清中的表達(dá)Figure2 Expression of miR-181d and PDCD4 in serum of gastric cancer and normal group

圖3 miR-181d與PDCD4的ROC曲線分析Figure3 ROC analysis of miR-181d and PDCD4 curves

2.4 miR-181d與PDCD4血清水平的表達(dá)及與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

結(jié)合58例胃癌患者的臨床病理資料分析發(fā)現(xiàn)，血清miR-181d的表達(dá)分別與吸煙喝酒史呈正相關(guān)（P=0.015,P=0.034），與腫瘤發(fā)生部位呈正相關(guān)（胃底賁門：P＜0.001，胃體：P=0.017），與年齡、性別、民族、胃癌腫瘤的分化程度、胃癌患者臨床分期等無(wú)關(guān)（P＞0.05），見(jiàn)表3。而PDCD4的表達(dá)與飲酒史呈正相關(guān)（P＜0.001），與年齡、性別、民族、胃癌腫瘤的分化程度、胃癌患者臨床分期等無(wú)關(guān)（P＞0.05），見(jiàn)表4。

2.5 胃癌細(xì)胞系干擾/過(guò)表達(dá)miR-181d對(duì)PDCD4表達(dá)的影響

Real-time PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-181d mimics瞬間轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞后PDCD4的表達(dá)下降。而BGC823細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染反義miR-181d 48 h后PDCD4的表達(dá)水平增加。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-181d mimics后PDCD4在AGS細(xì)胞上清中的表達(dá)下降，而在BGC823細(xì)胞上清中的表達(dá)水平增加，見(jiàn)圖4。

圖4 在胃癌細(xì)胞中PDCD4的表達(dá)受miR-181d影響Figure4 miR-181d may affect PDCD4 expression in gastric cancer cell lines

2.6 熒光素酶報(bào)告基因分析

將miR-181d mimics或miR-NC一同轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞36 h，通過(guò)雙熒光報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾miR-181d后，AGS細(xì)胞中的PDCD4熒光報(bào)告活性比miR-NC組高，而過(guò)表達(dá)miR-181d mimics可以降低BGC823細(xì)胞中PDCD4的熒光報(bào)告活性，提示miR-181d可以結(jié)合PDCD4的3′-UTR區(qū)，見(jiàn)圖5。進(jìn)一步，PDCD4基因3′-UTR熒光素酶報(bào)告PCR引物從以下人類cDNA擴(kuò)增：PDCD4的3′-UTR正向引物：5′-GCGAGCTC CTGGTTCTA GAAGAATGTA CAC-3′；PDCD4的3′-UTR反向引物：5′-GCAAGCTTCA GGTAATATTTTCTC ATACATTAGG-3′。將PDCD4 3′-UTR與miR-181d結(jié)合的3′-UTR的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行引物突變，以PDCD4 3′-UTR互補(bǔ)序列（GAATGT）取代GTTAGA。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切用SacⅠ和HindⅢ，插入表達(dá)載體。HEK-293細(xì)胞接種于24孔板，轉(zhuǎn)染野生型或突變型PDCD4的3′-UTR報(bào)告質(zhì)粒體系pRL-TK、miR-NC和miR-181d。轉(zhuǎn)染后24 h使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生型組熒光素酶活性低于突變型組，提示miR-181d可以結(jié)合并抑制PDCD4 3′-UTR區(qū)的熒光活性，見(jiàn)圖5。

表2 miR-181d及PDCD4表達(dá)在胃癌血清中表達(dá)的ROC曲線分析Table2 ROC curve analysis of miR-181d and PDCD4 expression in GC serum and normal groups

表3 血清miR-181d表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系Table3 Relationship between miR-181d expression in serum and clinicopathological characteristics

表4 血清PDCD4表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系Table4 Relationship between PDCD4 expression in serum and clinicopathological characteristics

3 討論

miRNA可參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的各個(gè)階段，并且不同類型的腫瘤具有特異性的miRNA表達(dá)譜，這些表達(dá)譜可有效反映腫瘤組織的發(fā)展與分化狀態(tài)[5]。同時(shí), 血清miRNA較穩(wěn)定，可以抵抗核糖核酸酶、加熱、pH變化，并能長(zhǎng)期保存和重復(fù)冷凍、解凍，作為腫瘤的生物標(biāo)志物，創(chuàng)造性地提供了一種非損傷性的腫瘤診斷手段[9-10]。在前期工作中通過(guò)結(jié)合胃癌基因差異表達(dá)譜和miRNA差異表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)特征基因miR-181d在胃癌中表達(dá)高于正常組織，且與預(yù)測(cè)的靶基因PDCD4的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[7]。本研究結(jié)果進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，miR-181d在胃癌患者血清中的表達(dá)高于正常對(duì)照組，而PDCD4蛋白在胃癌患者血清中的表達(dá)低于正常對(duì)照組，且二者的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。通過(guò)ROC曲線分析顯示，miR-181d與PDCD4對(duì)區(qū)分胃癌組織和正常組織具有良好的特異性和敏感度。目前miRNA與胃癌的研究報(bào)道認(rèn)為，miRNAs可以促進(jìn)或抑制胃癌的惡性表型，在胃癌進(jìn)程中發(fā)揮癌基因或抑癌基因樣作用，可作為胃癌早診和預(yù)后的標(biāo)志物。近年來(lái)，研究者利用小鼠模型發(fā)現(xiàn)彌漫型胃癌早期診斷的血清miRNA可作為生物標(biāo)志物[11]。我國(guó)研究者以山東省臨朐縣胃癌高發(fā)現(xiàn)場(chǎng)胃癌患者為研究對(duì)象，通過(guò)miRNA芯片技術(shù)結(jié)合病例-對(duì)照和回顧前瞻性研究，確定血清中的miR-221、miR-744和miR-376c可作為一種新型的非侵入性的胃癌生物標(biāo)志物[12]。

圖5 miR-181d可結(jié)合在PDCD4的3'-UTR區(qū)發(fā)揮作用Figure5 miR-181d could bind to 3’-UTR region of PDCD4

miRNA可與下游潛在靶基因mRNA的3’-UTR通過(guò)不完全配對(duì)結(jié)合降低mRNA穩(wěn)定性或抑制靶基因的翻譯，從而參與調(diào)控基因表達(dá)[4-5]。本研究在AGS細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-181d后PDCD4的表達(dá)下降。而在BGC823細(xì)胞中轉(zhuǎn)染反義miR-181d后PDCD4的表達(dá)水平增加。雙熒光報(bào)告系統(tǒng)提示miR-181d可以結(jié)合到PDCD4的3'-UTR區(qū)。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-181c和miR-181d位于同一個(gè)基因簇，在肝癌、胰腺癌、胃癌中表達(dá)均增高[13-14]，并且miR-181d在小細(xì)胞肺癌化療敏感度中起一定作用[15]，在H69AR及對(duì)化療耐藥患者中呈低表達(dá)，同時(shí)伴隨著BCL2高表達(dá)。上調(diào)miR-181d能降低BCL2表達(dá)水平，增加H69AR細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感度，miR-181d的表達(dá)與腫瘤的分期、化療敏感度及生存時(shí)間相關(guān)。miR-181d在食管鱗癌中作為抑癌基因負(fù)調(diào)節(jié)Derlin-1的表達(dá)[16]。在乳腺導(dǎo)管癌中miR-181a和miR-181d的過(guò)表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期，致使細(xì)胞增殖，同時(shí)在乳腺導(dǎo)管癌中miR-181a和miR-181d通過(guò)調(diào)控共同目標(biāo)PHLPP2和INPP4B磷酸酶升高調(diào)節(jié)Akt信號(hào)通路[17]。miR-181d/MALT1通過(guò)NF-κB通路調(diào)節(jié)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤軸衰減間質(zhì)表型[18]。miR-181d在胰腺癌中高表達(dá)，下調(diào)miR-181d可負(fù)向調(diào)控KNAIN2抑制胰腺癌的惡性增殖[19]。本研究在胃癌患者的血清中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-181d的表達(dá)水平較健康者高，而PDCD4的表達(dá)水平明顯降低，二者的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-181d可能是通過(guò)作用于PDCD4的3'-UTR發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用。綜上所述，在胃癌患者血清中聯(lián)合檢測(cè)miR-181d和PDCD4的表達(dá)將為胃癌血清分子診斷提供一定的理論依據(jù)。

（致謝：感謝青海大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤外科馬曉明醫(yī)師和檢驗(yàn)科楊啟英醫(yī)師為本課題研究提供胃癌患者及健康體驗(yàn)者血液標(biāo)本。）