馬利 ，熊兵紅，黃衛(wèi)，羅華友，王昆華

0 引言

結(jié)直腸癌（colorectal cancer, CRC）是常見惡性腫瘤之一。在中國大陸，其發(fā)病率每年增加[1]。當(dāng)前，每年全世界將會(huì)有12 500萬人診斷為CRC，60多萬人死于此病[2]。其發(fā)病原因和機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。研究顯示miRNAs與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，能作為一類潛在的癌基因或抑癌基因發(fā)生作用[3]。有關(guān)miRNAs的研究進(jìn)展為CRC的發(fā)生機(jī)制提供了新的見解和觀點(diǎn)[4]。大量研究顯示miRNAs的異常表達(dá)和腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡和組織發(fā)育密切相關(guān)，并參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5]，可能作為一種潛在的抗癌藥物的靶點(diǎn)。有研究表明miR-7（micro-ribonucleic acid-7）與腫瘤密切相關(guān)，但在CRC中其具體作用機(jī)制尚不清楚。我們擬上調(diào)CRC細(xì)胞中miR-7的表達(dá)，研究其對(duì)CRC細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。含10%小牛血清的RPMI1640、DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，CCK-8試劑購自上海Dojindo公司，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司，miR-7模擬物（mimics）及無義核苷酸序列由上海吉瑪公司合成，引物由上海生工生物工程公司合成。Annexin V-FITC/PI、凋亡檢測(cè)試劑盒購自美國Invitrogen公司，細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購自上海碧云天公司，相關(guān)蛋白抗體購自美國Santa Cruz公司、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）抗體及BCA法蛋白質(zhì)定量試劑盒購自上海碧云天公司。

1.2 細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)

HCT-116用含10%小牛血清、100 u/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組

將HCT-116細(xì)胞經(jīng)過0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT-116細(xì)胞2×105個(gè)每孔接種于6孔板，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miR-7模擬物（miR-7 mimics）及隨機(jī)序列（miR-Scramble），將細(xì)胞分成miR-7 mimics（Mimics）組、陰性對(duì)照（Scramble, negative control, NC）組和空白對(duì)照（blank control, MOCK）組。分別用無血清RPMI1640 250 μl稀釋LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑8 μl和miR-7 mimics/NC/PBS 12.5 μl，室溫靜置5 min，然后將轉(zhuǎn)染試劑分別與稀釋miR-7 mimics/NC/PBS混合，室溫下靜置20 min后，分別鋪到6孔板中的miR-7 mimics組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組（轉(zhuǎn)染HCT-116細(xì)胞用無血清DMEM），在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

取HCT-116細(xì)胞2×103個(gè)/孔接種于96孔板，分3組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，3組復(fù)孔分別加入miR-21 inhibitor/NC/PBS和轉(zhuǎn)染試劑，每孔的終體積為200 μl，測(cè)定0、24、48、72 h時(shí)各孔的吸光度值（absorbance, A）（各孔加入CCK-8試劑20 μl, 在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值），得到4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的吸光度值后繪制細(xì)胞增殖曲線。使用已知細(xì)胞數(shù)目的小孔校正，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、測(cè)得的吸光度值代表細(xì)胞相對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡

取HCT-116細(xì)胞2×105個(gè)/孔接種于6孔板，分為miR-7 mimics組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后分別加入轉(zhuǎn)染試劑與miR-7 mimics/NC/PBS，在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24、48、72 h后，離心收集細(xì)胞；采用Annexin-Ⅴ試劑盒，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞周期檢測(cè)用流式細(xì)胞儀分別計(jì)數(shù)G0/G1、S和G2/M期的細(xì)胞比例。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲

將Matrigel用無血清RPMI1640培養(yǎng)基按1:1比例配制成細(xì)胞外基質(zhì)膠，按30微升/室加入Transwell小室聚碳酸酯膜（直徑6.5 mm，孔徑8 μm）上面，包被細(xì)胞外基質(zhì)膠。轉(zhuǎn)染24 h后，用2.5%胰酶消化，懸浮于無血清RPMI1640培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/毫升。置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育14 h；每組設(shè)3個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。孵育結(jié)束后，擦除小室濾膜內(nèi)表面的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定、PBS輕洗、0.1%結(jié)晶紫染色，200倍顯微鏡下分別計(jì)數(shù)穿過膜的細(xì)胞并拍照，隨機(jī)選取3個(gè)視野，取其平均值。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR, RT-Fq-PCR）

按TRIzol說明書抽提總RNA。分別測(cè)定RNA在分光光度計(jì)280 nm、260 nm和230 nm的吸光度值，計(jì)算濃度并評(píng)估純度。按照試劑盒說明書測(cè)定miR-7水平，以U6snRNA為內(nèi)參照計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取其平均值。

1.8 蛋白印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)

轉(zhuǎn)染后72 h分別進(jìn)行細(xì)胞裂解收集蛋白，行SDS-PAGE電泳分離蛋白，并轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，常規(guī)抗體雜交，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑顯色。用Bio-Rad凝膠成像儀顯色，行發(fā)光檢測(cè)，Quantity One軟件顯色凝膠圖像的光密度值。以GAPDH蛋白為內(nèi)參照，以各蛋白條帶與GAPDH條帶吸光度值的比值表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，求其均值與標(biāo)準(zhǔn)差。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS l7.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以（±s）表示。兩個(gè)樣本均數(shù)比較采用Independent-Sample T test進(jìn)行檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用One-way ANOVA分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-7在HCT-116細(xì)胞中的表達(dá)

轉(zhuǎn)染miR-7 mimics后，RT-Fq-PCR測(cè)定miR-7在HCT-116中的相對(duì)表達(dá)量為（3.95±0.25），明顯高于MOCK組（0.96±0.08）和NC組（0.94±0.07），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001），見圖1。

圖1 上調(diào)miR-7對(duì)結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞miR-7表達(dá)的影響Figure1 Effect of miR-7 mimics on miR-7 expression in HCT-116 cells

2.2 過表達(dá)miR-7抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖

應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)抑制miR-7表達(dá)對(duì)HCT-116細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示miR-7 mimics組與兩對(duì)照組之間的細(xì)胞增殖在72 h比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.01），對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。

圖2 轉(zhuǎn)染miR-7 mimics后對(duì)細(xì)胞增殖的影響Figure2 Effect of miR-7 mimics on HCT-116 cells proliferation

2.3 上調(diào)miR-7對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞周期分析顯示，轉(zhuǎn)染miR-7 mimics的HCT-116細(xì)胞48 h后處于G0/G1期的細(xì)胞百分比為（73.5±0.8）%，與MOCK組（55.13±0.9）%和NC組（57.5±0.8）%相比明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001），見圖3。

轉(zhuǎn)染miR-7 mimics后，S期細(xì)胞數(shù)百分比為（18.30±0.5）% ，與MOCK組（36.43±0.6）%和NC組（33.90±0.5）%相比明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002），見圖3。

圖3 上調(diào)miR-7對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞周期的影響Figure3 Effect of miR-7 mimics on cell cycle distribution of HCT-116 cells

圖4 上調(diào)miR-7對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響Figure4 Effect of miR-7 mimics on HCT-116 cell apoptosis

2 .4 上調(diào)miR-7促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡

轉(zhuǎn)染miR-7 mimics的HCT-116細(xì)胞凋亡率為（23.56±3.50）%，與MOCK（2.12±3.17）%和NC組（2.32±3.21）%相比明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001），見圖4。

2.5 上調(diào)miR-7抑制結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲

侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：miR-7 mimics組穿過細(xì)胞數(shù)與MOCK組和NC組相比，明顯減少（P=0.01），見圖5。提示上調(diào)miR-7的表達(dá)顯著降低細(xì)胞的侵襲能力。

圖5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)上調(diào)miR-7對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲的影響Figure5 Effect of miR-7 mimics on HCT-116 cell invasion detected byTranswell assay

2.6 上調(diào)miR-7表達(dá)對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白的影響

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，p-A k t 在MOCK、NC和Mimics組的相對(duì)表達(dá)量分別為（0.42±0.01）、（0.43±0.01）和（0.15±0.01），在Mimics組中明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.01）。PI3K在MOCK、NC和Mimics組的相對(duì)表達(dá)量分別為（0.32±0.01）、（0.33±0.01）和（0.12±0.01），PI3K在Mimics組中明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.01）。p-mTOR在MOCK、NC和Mimics組的相對(duì)表達(dá)量分別為（0.29±0.01）、（0.30±0.01）和（0.10±0.01），p-mTOR在Mimics組中明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.02），見圖6。

圖6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)上調(diào)miR-7對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白的影響Figure6 Effect of miR-7 mimics on proteins of PI3K/AKT signal pathway detected by Western blot

3 討論

微RNA-7（miR-7）是23個(gè)核苷酸長(zhǎng)的非編碼小分子RNA，miR-7在多種腫瘤中低表達(dá)，被認(rèn)為是抑癌基因，與腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。miR-7可能通過靶向EGFR[6]、FAK[7]、p21-activated kinase 1[8]、PAK1[9]、XRCC2[10]、XIAP[11]、BCL-2[12]、胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體（insulin-like growth factor 1 receptor, IGF1R）[13]、PAX6[14]等發(fā)揮作用，從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。此外，miR-7還能提高腫瘤對(duì)化療的敏感度，并抑制腫瘤血管生成。

本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-7 mimics后，miR-7表達(dá)水平明顯上調(diào)。與NC組和MOCK組相比，Mimics組細(xì)胞增殖抑制率升高，侵襲能力降低，G0/G1期的細(xì)胞比例增高，S期細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞凋亡率明顯增加。這表明miR-7在CRC中作為一種抑癌基因，可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-7 mimics后，PI3K、p-Akt及p-mTOR的蛋白水明顯降低。在體外，miR-7過表達(dá)通過調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路參與細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞遷移。Fang等[15]研究表明，miR-7可通過參與PI3K/AKT/mTOR途徑以及調(diào)控靶向基因磷脂酰肌醇-3激酶催化亞基δ（phosphatidylinositol 3-kinasecatalytic subunit δ,PIK3CD）的表達(dá)來抑制腫瘤的生長(zhǎng)和肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，從而充當(dāng)腫瘤抑制劑。其中PI3K/AKT/mTOR是與細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡關(guān)系最密切的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化可以通過調(diào)控多個(gè)與細(xì)胞凋亡有關(guān)的家族而抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞的生存和增殖，同時(shí)參與血管形成，因此在腫瘤的形成中扮演重要角色，并參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。

徐瑤等[16]發(fā)現(xiàn)Hep-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-7 mimics后miR-7表達(dá)水平明顯上調(diào)，與NC組和MOCK組相比，miR-7組Hep-2細(xì)胞的增殖抑制率升高，遷移能力降低，且PI3K、Akt及p-Akt的mRNA和蛋白水平均降低。研究顯示上調(diào)喉鱗癌Hep-2細(xì)胞中miR-7表達(dá)能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與遷移，其機(jī)制可能與抑制PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)。劉曉智等[17]發(fā)現(xiàn)miR-7基因轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中miR-7水平明顯高于對(duì)照組和無義序列組；蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組U251細(xì)胞中EGFR、PI3K和Akt2蛋白的水平較對(duì)照組均明顯降低；U251細(xì)胞增殖速度減慢，處于S期的細(xì)胞所占比例減少，細(xì)胞遷移及軟瓊脂克隆形成能力均明顯降低。所以轉(zhuǎn)染miR-7可有效沉默膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中EGFR/PI3K通路主要成員蛋白的表達(dá)，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)其惡性表型，有望成為一種新的膠質(zhì)瘤基因治療方法。劉亮洪等[18]發(fā)現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤組織中miR-7表達(dá)減少，與EGFR/PI3K通路成員表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-7后EGFR、PI3K和AKT表達(dá)降低。他們推測(cè)EGFR/PI3K通路可能是miR-7調(diào)控膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一。

miR-7一般認(rèn)為是抑癌基因，但是少數(shù)研究卻報(bào)道m(xù)iR-7在腎癌[19]中表達(dá)升高，可能是癌基因，這可能與腫瘤組織特異性有關(guān)，其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-7表達(dá)可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，可減少PI3K、p-Akt的表達(dá)，miR-7可能通過抑制PI3K/AKT通路抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，但可能還存在多個(gè)信號(hào)通路與結(jié)直腸癌進(jìn)展有關(guān)。miR-7本身也受細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜機(jī)制的調(diào)控，其表達(dá)量變化及其對(duì)腫瘤的調(diào)控機(jī)制可為腫瘤的診治提供新思路，具有良好的臨床應(yīng)用前景。miR-7可能是CRC診斷治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。