趙天增，楊金華，劉向前，徐萌博

0 引言

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是一種死亡率較高的惡性腫瘤，占全部肺癌的85%，流行病學(xué)顯示患者的五年生存率低于16%[1]，由于很多肺癌患者就診時已屬中晚期，治療效果與預(yù)后不理想，目前，臨床上仍缺乏有效的早期診斷和治療的方法，主要采用放化療結(jié)合的手段。

miRNA是一類長約18～25個核苷酸的小分子非編碼單鏈RNA，廣泛存在于高等哺乳動物、植物及病毒中，參與不同的生物學(xué)過程，如細(xì)胞分化、增殖、代謝與凋亡等一系列細(xì)胞生命活動[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)miR-145在多種腫瘤組織中的表達(dá)明顯減少，如胃癌、食管癌、肝癌等[3-5]。有報道指出體外實(shí)驗(yàn)中miR-145在胃癌細(xì)胞中低表達(dá)，miR-145能夠抑制細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，并可能作為轉(zhuǎn)移抑制基因，體內(nèi)自發(fā)轉(zhuǎn)移試驗(yàn)分析進(jìn)一步證實(shí)了miR-145對細(xì)胞的侵襲具有抑制功能[6]。目前miR-145對非小細(xì)胞肺癌遷移與侵襲的作用及其相關(guān)機(jī)制的研究尚未完善，因此本實(shí)驗(yàn)就此展開，為研究以miR-145作為肺癌的靶點(diǎn)提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

40例非小細(xì)胞肺癌肺組織與癌旁正常肺組織（經(jīng)病理科驗(yàn)證）來自南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院病理科；非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；miR-145 mimic、miR-145 NC、NC siRNA和AP4 siRNA由廣州銳博技術(shù)有限公司合成；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司；Transwell小室購自美國Corning公司；mirVana miRNA分離試劑盒、 miRNeasy mini試劑盒、Omniscript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TRIzol試劑盒均購自美國Qiagen公司；AP4和α-tublin抗體購自美國Abcam公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將A 5 4 9 細(xì)胞株培養(yǎng)于含1 0%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2天換液一次，每6天按照1:3傳代。

1.3 miR-145 mimic轉(zhuǎn)染

取生長狀態(tài)良好的A549細(xì)胞融合至80%～90%左右時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按照LipofectamineTM2000試劑盒說明書操作，用移液槍吸取5 μl的LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑，加入100 μl無血清的OPTI-MEM培養(yǎng)基中，同時將調(diào)整好濃度為5 nmol/L的miR-145 mimic和miR陰性對照（miR-145 NC）加入無血清的OPTI-MEM培養(yǎng)基中，混勻，孵育5 min，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入培養(yǎng)基中，混勻，6 h后更換含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。

1.4 AP4 siRNA轉(zhuǎn)染

取生長狀態(tài)良好的A549細(xì)胞融合至80%～90%左右時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，LipofectamineTM2000試劑盒說明書操作，用移液槍吸取5 μl的LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑，加入100 μl無血清的DMEM培養(yǎng)基中，再取20 nmol/L的AP4 siRNA和陰性對照siRNA（NC-siRNA），分別加入無血清的DMEM培養(yǎng)基混勻，孵育5 min，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入培養(yǎng)基中，混勻，6 h后更換含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃孵箱培養(yǎng)48 h。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)

取各組生長良好的細(xì)胞，待細(xì)胞在板上孵育至密度約為90%時，用無菌槍頭輕輕劃細(xì)胞培養(yǎng)板，劃痕后漂浮的細(xì)胞用PBS輕輕洗滌，換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下觀察拍攝，并在24 h后于同一部位進(jìn)行拍攝，觀察細(xì)胞的移動情況。

1.6 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)

將Matrigel 1:8稀釋，包被Transwell小室底部膜的上室，37℃培養(yǎng)30 min；待細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，消化細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，重懸，調(diào)整密度為5×105個細(xì)胞每毫升，將細(xì)胞懸液加入Transwell小室，在下室加入600 μl含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)液，PBS洗滌，甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，輕輕擦去上層細(xì)胞，于顯微鏡下觀察，計數(shù)。

1.7 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)

對于miR-145 qRT-PCR檢測，按照 mirVana miRNA分離試劑盒說明書提取細(xì)胞或者組織中總RNA，按照miRNeasy mini kit說明書采用QuantiTect SYBR Green PCR system進(jìn)行qRTPCR，U6為內(nèi)參。對于AP4 qRT-PCR檢測，按照TRIzol試劑盒說明書操作，提取各組組織或者已處理細(xì)胞的總RNA，Omniscript反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成為cDNA，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物采用QuantiTect SYBR Green PCR system進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)條件：95℃變性 2 min；94 1 min℃，60℃ 30 s，72℃ 1 min，共35個循環(huán)；72℃ 10 min。按2-ΔΔCt法分析各組基因相對表達(dá)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次，取平均值。其中上述利用的引物序列為：miR-145引物：上游：5’-GTCCAGTTTTCCCAGGAAT-3’，下游：5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’；U6引物：上游：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；AP4上游：5’-AACAGGGGCAGAGTGAGTTG-3’，下游：5’-GGGAAGTGCCTTCGACAGTG-3’；α-tublin上游：5’-TTCCTGGGCATGGAGTCCT-3’，下游：5’-AGGAGGAGCAATGATCTTGATC-3’。

1.8 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)

收集各組A549細(xì)胞，加入適量蛋白裂解液裂解RIPA，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，進(jìn)行SDS-PAGE電泳 ，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，TBST液洗膜2次，將PVDF膜轉(zhuǎn)移至5%脫脂奶粉中，封閉2 h，TBST液洗膜三次，加入一抗，4℃搖床孵育過夜，TBST液洗膜三次，加入相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，TBST液洗滌三次，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，暗室曝光，以α-tublin為內(nèi)參，成像掃描分析系統(tǒng)保存圖像。

1.9 雙熒光素酶報告基因檢測

靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫miRanda顯示miRNA-145與AP4存在靶向結(jié)合序列。進(jìn)一步構(gòu)建AP4野生型WT-3’UTR-熒光素酶表達(dá)載體和突變型Mutant-3’UTR-熒光素酶表達(dá)載體，并將其和miR-145 mimic轉(zhuǎn)入細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，按照雙熒光素酶報告基因說明書進(jìn)行操作，使用熒光素酶報告基因檢測儀進(jìn)行雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值來進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，三組數(shù)據(jù)的兩兩比較比較采用方差分析后再接受Bonferroni-t修正，組間比較以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-145和AP4在非小細(xì)胞肺癌組織的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示，與癌旁正常組織相比，非小細(xì)胞肺癌組織中miR-145表達(dá)顯著降低（t=10.235,P=0.000），AP4 mRNA明顯增高（t=8.367,P=0.000），同時Western blot檢測顯示AP4在非小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá)（t=6.415,P=0.000）。進(jìn)一步通過相關(guān)性分析顯示，AP4蛋白表達(dá)與miR-145呈負(fù)相關(guān)（t=3.551,P=0.000），見圖1。

2.2 轉(zhuǎn)染miR-145 mimic后A549細(xì)胞侵襲和遷移能力變化

qRT-PCR實(shí)驗(yàn)顯示，與對照組相比，A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-145 mimic后，miR-145表達(dá)明顯增加（F=39.452,t=5.412,P=0.000），見圖2A；同時Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-145 mimic后A549細(xì)胞的侵襲能力顯著下降（F=123.162,t=8.543,P=0.000），見圖2B～C；劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-145 mimic后A549細(xì)胞的遷移能力顯著下降（F=89.745,t=6.384,P=0.000），見圖2D～E。

2.3 AP4是miR-145直接靶基因

qRT-PCR實(shí)驗(yàn)顯示，與對照組相比，A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-145 mimic后，AP4 mRNA表達(dá)明顯降低（F=56.383,t=7.256,P=0.000），見圖3A；同時Western blot結(jié)果顯示，A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-145 mimic后，AP4蛋白表達(dá)明顯降低（F=42.195,t=4.679,P=0.000），見圖3B～C；進(jìn)一步，靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫miRanda顯示miR-145與AP4 3'UTR存在靶向結(jié)合片段，見圖3D，雙熒光素酶報告基因驗(yàn)證AP4是miR-145的靶基因，見圖3E。

2.4 轉(zhuǎn)染AP4 siRNA抑制A549細(xì)胞侵襲和遷移

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染AP4 siRNA后，AP4蛋白表達(dá)明顯降低（F=114.192,t=13.725,P=0.000），見圖4A；同時Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染AP4 siRNA后A549細(xì)胞的侵襲數(shù)顯著下降（t=9.675,P=0.000），見圖4B；劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染AP4 siRNA后A549細(xì)胞的遷移能力顯著下降（t=8.347;P=0.000），見圖4C～D。

3 討論

miRNA-145是近年來發(fā)現(xiàn)的具有抑制腫瘤細(xì)胞作用的mircoRNA，國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)miR-145不但抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7和結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116的增殖，還能抑制其侵襲能力[7]。王寰昱等[8]研究發(fā)現(xiàn)miR-145通過改變腫瘤細(xì)胞表面黏附因子的表達(dá)從而抑制肝癌細(xì)胞的遷移與侵襲，但miR-145對非小細(xì)胞肺癌的研究尚不完善。本研究結(jié)果顯示，miR-145在非小細(xì)胞肺癌組織中低表達(dá)。進(jìn)一步對A549細(xì)胞采用過表達(dá)miR-145后，A549細(xì)胞的遷移與侵襲能力明顯下降，隨后，我們進(jìn)行了其可能機(jī)制的研究。

圖1 miR-145在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及其與AP4表達(dá)的相關(guān)性 (n=40)Figure1 miR-145 was widely down-regulated in NSCLC tissues and negatively correlated with AP4 expression (n=40)

圖2 miR-145過表達(dá)抑制A549細(xì)胞侵襲與遷移 (n=3)Figure2 miR-145 overexpression inhibited migration and invasion of A549 cells (n=3)

圖3 AP4是miR-145直接靶基因 (n=3)Figure3 AP4 was a direct target gene of miR-145 (n=3)

激活增強(qiáng)子結(jié)合蛋白4（activating enhancer binding protein 4, AP4）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種核轉(zhuǎn)錄因子，堿性螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，主要與轉(zhuǎn)錄因子AP1協(xié)同調(diào)控脊椎動物的生長發(fā)育、細(xì)胞增殖和凋亡的過程，病理狀態(tài)下參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程[9-10]。大量研究證實(shí)，轉(zhuǎn)錄因子AP4在多種腫瘤組織中呈高表達(dá)，如肺癌、肝癌、胃癌等[11-13]。研究發(fā)現(xiàn)AP4在侵襲性甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞株和組織中顯示高表達(dá)，提示AP4在侵襲性甲狀腺乳頭狀癌轉(zhuǎn)移的過程中具有重要的作用[14]。已有報道證實(shí)當(dāng)沉默子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的AP4因子后，增加細(xì)胞凋亡率，并抑制細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[15]。而關(guān)于AP4抑制腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲的機(jī)制，已有報道多與p53通路以及EMT改變相關(guān)[16-17]，比如報道AP4通過激活p53依賴性通路促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生EMT[16]；上調(diào)AP4直接結(jié)合上皮型鈣黏附素（E-cadherin）啟動子CACCTG序列，降低E-cadherin，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT，進(jìn)一步發(fā)生侵襲和遷移。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AP4在非小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá)；AP4 siRNA轉(zhuǎn)染后，非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的遷移與侵襲能力明顯下降；另外，過表達(dá)miR-145后，非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中AP4因子的表達(dá)顯著下降，提示過表達(dá)miR-145可能是通過下調(diào)靶基因AP4表達(dá)來抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移與侵襲。而關(guān)于AP4是通過何種機(jī)制影響非細(xì)胞肺癌侵襲與遷移，將是我們下一步研究的重點(diǎn)。

綜上所述，上調(diào)miR-145的表達(dá)能明顯抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的遷移與侵襲能力，可能是通過抑制靶基因AP4的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。本研究為miR-145作為非小細(xì)胞肺癌治療靶標(biāo)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

圖4 AP4 siRNA抑制A549細(xì)胞侵襲和遷移 (n=3)Figure4 AP4 siRNA inhibited migration and invasion of A549 cells (n=3)