黃昌林，陳典剛，朱虹帆，湯金梁，王東林，李光輝

0 引言

腦膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，WHO分型將其分為Ⅰ～Ⅳ級(jí)，其中WHOⅣ級(jí)腦膠質(zhì)瘤又稱腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，惡性程度最高，預(yù)后最差，患者的中位生存時(shí)間僅14月左右[1-2]。目前手術(shù)聯(lián)合放、化療是人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的主要治療方法，但腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤高度浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的生物學(xué)特性及對(duì)放化療的抗拒性，使復(fù)發(fā)成為絕大多數(shù)腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者最終難以避免的臨床結(jié)局。隨著近年對(duì)腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤基因?qū)用娴纳钊胩剿?，為腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的分子靶向、基因及免疫治療等帶來(lái)了新的策略[3]。

LITAF基因作為一個(gè)多功能的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛分布于人體的不同組織[4]。近年來(lái)有報(bào)道指出，LITAF可能是一個(gè)潛在的抑癌基因，其表達(dá)水平的降低可能與前列腺癌[5]、胰腺癌[6]、B細(xì)胞淋巴瘤[7]、急性白血病[8]等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和放化療敏感度相關(guān)。關(guān)于腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中LITAF基因的表達(dá)水平及其功能尚不清楚。本文通過(guò)分析LITAF基因在人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)，抑制人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞（以下簡(jiǎn)稱U251細(xì)胞）中LITAF基因表達(dá)，觀察其對(duì)U251細(xì)胞增殖、凋亡以及放療敏感度的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）試劑盒（日本，TaKaRa公司）；熒光定量PCR儀（美國(guó)，貝克曼庫(kù)爾特有限公司）；LITAF基因PCR上游引物：5′-ATGTCGGTTCCAGGACCTTAC-3′,下游引物：5′-TACGAAGGAGGATTCATGCCC-3′（美國(guó)，賽默飛世爾科技有限公司）；β肌動(dòng)蛋白（β-actin）基因PCR上游引物：5′-GAGCTACGAGCTGC CTGACG-3′，下游引物：5′-GTAGTTTCGTGGATGCCACAG-3′（美國(guó)，賽默飛世爾科技有限公司）；LITAF基因干擾病毒Target序列：5′-CCAUUUUCUGUAAUCAAAUGA-3′（中國(guó)上海，吉?jiǎng)P基因科技有限公司）；Western blot凝膠試劑盒（中國(guó)上海，碧云天生物技術(shù)有限公司）；LITAF-單抗（中國(guó)武漢，三鷹生物技術(shù)有限公司）；鼠和兔二抗（中國(guó)武漢，博士德生物工程有限公司）；聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）（瑞士，羅氏公司）；濕轉(zhuǎn)儀（美國(guó)，BioRad公司）；5-乙炔基-2脫氧尿嘧啶核苷（EDU）試劑盒（美國(guó)，GeneCopoeia公司）；PE-7AAD凋亡試劑盒（美國(guó)，BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析 利用UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu/）網(wǎng)站分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中腦膠質(zhì)瘤組織的LITAF mRNA表達(dá)情況。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) U251細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，加入含1%雙抗和10%胎牛血清的Gibco DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.3 LITAF基因干擾載體反轉(zhuǎn)錄病毒感染U251細(xì)胞 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U251細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，接種至25 cm2培養(yǎng)瓶中。按病毒感染比率值10:1取對(duì)照病毒和LITAF基因干擾病毒分別感染靶細(xì)胞，觀察細(xì)胞綠色熒光產(chǎn)生。感染72 h后，去除含病毒載體的培養(yǎng)液，洗滌后加入含6 μg/ml嘌呤毒素的新鮮培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞篩選，2～3天更換一次培養(yǎng)液，篩選7～10天獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞分別用qPCR和Western blot檢測(cè)干擾結(jié)果。

1.2.4 qPCR測(cè)定U251細(xì)胞LITAF mRNA表達(dá) 按照TRIzol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄，重復(fù)2次；將3次實(shí)驗(yàn)獲得的各組cDNA進(jìn)行qPCR檢測(cè)；PCR引物見(jiàn)前述，采用SYBR Premix PCR試劑盒，于熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀測(cè)定LITAF基因的mRNA水平。

1.2.5 Western blot檢測(cè)U251細(xì)胞LITAF蛋白表達(dá) 蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，測(cè)定濃度后按常規(guī)方法進(jìn)行凝膠電泳，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，小兔抗LITAF單抗標(biāo)記，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯影，以β-actin為參照。

1.2.6 干擾組、陰性對(duì)照組和空白組U251細(xì)胞增殖測(cè)定 干擾組為L(zhǎng)ITAF抑制病毒感染后的U251細(xì)胞，陰性對(duì)照組為轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照病毒的U251細(xì)胞，空白組為未轉(zhuǎn)染病毒的U251細(xì)胞。每組按照3個(gè)孔重復(fù)。EDU檢測(cè)：各組細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度，按照1.5×105個(gè)/孔接種于6孔板內(nèi)，加培養(yǎng)液，37℃孵育過(guò)夜后，每孔分別加入2 ml混合培養(yǎng)液，37℃孵育6 h，按照EDU檢測(cè)試劑盒說(shuō)明處理細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞增殖比例。

1.2.7 細(xì)胞照射 分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后按2×105個(gè)/瓶接種至25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入10 ml含1%雙抗和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，細(xì)胞貼壁，封口膜封住培養(yǎng)瓶瓶蓋及透氣孔，75%酒精擦拭培養(yǎng)瓶， 6 MeV-電子線照射細(xì)胞后，75%酒精再次擦拭培養(yǎng)瓶消毒并撕去封口膜，放入37℃含5%CO2培養(yǎng)箱孵育。每組細(xì)胞設(shè)置3個(gè)重復(fù)。照射設(shè)備：美國(guó)Varian直線加速器；照射條件：28℃室溫，照射前治療室紫外線空氣消毒30 min，6 MeV-電子線照射細(xì)胞，劑量率為300 Mu/min，源皮距100 cm，照射野限光筒為25 cm×25 cm。培養(yǎng)液深度5 mm，培養(yǎng)瓶下方墊1 cm厚組織等效補(bǔ)償塊，照射劑量計(jì)劃由物理師在Eclipse放療計(jì)劃系統(tǒng)計(jì)算得出。

1.2.8 流式細(xì)胞凋亡分析 放療前細(xì)胞凋亡檢測(cè)：分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期干擾組、陰性對(duì)照組和空白組U251細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后按2×105個(gè)/瓶接種至25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入4 ml含1%雙抗和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)箱孵育24 h，收集培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)所有細(xì)胞，PE-7AAD凋亡試劑盒染色，流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞比例。放療后細(xì)胞凋亡檢測(cè)：干擾組和陰性對(duì)照組U251細(xì)胞給予單次13 Gy（6MeV-電子線）照射后，37℃含5%CO2培養(yǎng)箱孵育72 h，收集培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)懸浮和貼壁的所有細(xì)胞，PE-7AAD凋亡試劑盒染色，流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞比例。

1.2.9 克隆形成實(shí)驗(yàn) 干擾組和陰性對(duì)照組U251細(xì)胞給予單次7 Gy（6MeV-電子線）照射后，37℃含5% CO2培養(yǎng)箱孵育24 h，制備成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后按2×103個(gè)/孔接種至6孔板中，每孔加入2 ml含1%雙抗和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，十字形輕輕晃動(dòng)6孔板，使細(xì)胞分散均勻。每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)重復(fù)。放入37℃培養(yǎng)箱中孵育，3～4天更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)10～14天，進(jìn)行蘇木精染色并計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。最后計(jì)算克隆形成率，克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)圖表及數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行制作及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LITAF基因高表達(dá)于人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織

對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)156例人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織和5例正常腦組織中LITAF mRNA表達(dá)情況分析，結(jié)果顯示，與正常腦組織相比，LITAF mRNA顯著高表達(dá)于人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中（P＜0.0001），見(jiàn)圖1。

圖1 分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織及正常腦組織中LITAF mRNA的表達(dá)Figure1 Expression of LITAF mRNA in human glioblastoma and normal brain tissues from TCGA

2.2 抑制U251細(xì)胞中LITAF表達(dá)不影響細(xì)胞的增殖和凋亡

用RNAi抑制U251細(xì)胞LITAF表達(dá)，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。采用qPCR、Western blot方法檢測(cè)干擾效果，結(jié)果顯示干擾組與陰性對(duì)照組細(xì)胞相比，LITAF mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低（P=0.0013），見(jiàn)圖2。該結(jié)果提示LITAF RNAi顯著抑制了干擾組U251細(xì)胞內(nèi)LITAF基因的表達(dá)。EDU標(biāo)記、流式細(xì)胞術(shù)分析空白組、陰性對(duì)照組、干擾組細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示空白染組、陰性對(duì)照組和干擾組增殖比例分別為57.03%、56.26%和57.69%，三組細(xì)胞增殖比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.4665），見(jiàn)圖3，提示U251細(xì)胞內(nèi)LITAF基因表達(dá)抑制后，U251細(xì)胞的增殖未受到明顯影響，在缺乏其他因素作用下，LITAF基因未參與細(xì)胞的增殖調(diào)控。

圖2 qPCR和Western blot檢測(cè)U251細(xì)胞LITAF RNAi的表達(dá)Figure2 Expression of LITAF RNAi in U251 cells measured by qPCR and Western blot

圖3 EDU檢測(cè)抑制LITAF后U251細(xì)胞的増殖情況Figure3 Effect of LITAF on proliferation of glioblastoma U251 cells detected by EDU

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)三組細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示凋亡率發(fā)生比例為空白組4.64%、陰性對(duì)照組5.37%、干擾組細(xì)胞4.85%，三組細(xì)胞凋亡比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.4619），見(jiàn)圖4。該結(jié)果顯示僅抑制LITAF基因表達(dá)，不會(huì)影響U251細(xì)胞的凋亡調(diào)控機(jī)制。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)干擾LITAF對(duì)U251細(xì)胞凋亡的影響Figure4 Apoptosis of glioblastoma U251 cells measured by flow cytometry

2.3 抑制U251細(xì)胞LITAF基因后放療敏感度減弱

陰性對(duì)照組與干擾組細(xì)胞在單次13 Gy 6MeV-電子線照射后72 h，流式細(xì)胞分析，結(jié)果顯示陰性對(duì)照組凋亡比例為22.24%、干擾組細(xì)胞為13.20%，干擾組細(xì)胞凋亡比例顯著低于陰性對(duì)照組（P=0.0016），見(jiàn)圖5。說(shuō)明抑制U251細(xì)胞LITAF基因表達(dá)后，細(xì)胞在接受電離輻射后凋亡顯著減少，提示LITAF基因參與了U251細(xì)胞電離輻射后細(xì)胞損傷修復(fù)或凋亡機(jī)制的調(diào)控，抑制LITAF基因表達(dá)可導(dǎo)致U251細(xì)胞放療敏感度減弱。

陰性對(duì)照組與干擾組細(xì)胞經(jīng)單次7 Gy 6MeV-電子線照射后，細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示干擾組細(xì)胞克隆大小、形態(tài)與對(duì)照組相似，但克隆形成率顯著高于陰性對(duì)照組細(xì)胞（P=0.0142），見(jiàn)圖6。結(jié)果提示抑制LITAF基因可顯著增加電離輻射后U251細(xì)胞的存活和增殖能力，進(jìn)一步證實(shí)了抑制LITAF基因表達(dá)可明顯減弱U251細(xì)胞的放療敏感度。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)抑制LITAF基因?qū)Ψ暖熀骍251細(xì)胞凋亡的影響Figure5 Apoptosis of glioblastoma U251 cells treated with 13 Gray irradiation measured by flow cytometry

3 討論

人LITAF基因（LPS-induced TNF-α factor）被稱作p53誘導(dǎo)的基因7（PIG7），位于16號(hào)染色體上，其mRNA大小為1.8 kb ，編碼蛋白質(zhì)大小為23.9 kDa，包含228個(gè)氨基酸。LITAF廣泛表達(dá)于人體各組織細(xì)胞中，其中脾臟、淋巴結(jié)和外周血白細(xì)胞表達(dá)最高，其次為骨髓、胸腺、闌尾、腎臟和胎盤(pán)，表達(dá)最低的是心臟、大腦和胎兒肝臟[4]。LITAF可在脂多糖（LPS）的刺激下，與STAT6B形成復(fù)合物，共同調(diào)控TNF-α、IL-6和CCL-18等炎性因子的表達(dá)，在正常的炎性反應(yīng)過(guò)程中起著重要的作用[9]。異常表達(dá)的LITAF與炎性反應(yīng)性腸病[10]和骨關(guān)節(jié)炎[11]的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。除此之外，LITAF的突變還與乳腺佩吉特病[12]和腓骨肌萎縮癥[13]有關(guān)。

圖6 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抑制LITAF對(duì)放療后U251細(xì)胞克隆形成率的影響Figure6 Clone formation rate of glioblastoma U251 cells treated with 7 Gray irradiation measured with Clonogenic assay

近年來(lái)多篇報(bào)道指出，LITAF基因可能是一個(gè)潛在的抑癌基因，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)其凋亡。Zhou等[5]指出LITAF通過(guò)調(diào)控TNFSF15來(lái)抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖。Wang等[8]分析了138例急性白血病患者和21例健康者骨髓標(biāo)本中LITAF mRNA表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在急性白血病患者骨髓中LITAF的表達(dá)跟健康者相比顯著下降；且難治復(fù)發(fā)白血病患者跟初治白血病患者相比，LITAF的表達(dá)更低，同時(shí)對(duì)化療也表現(xiàn)出更明顯的抗拒性。王金潔等[14]檢測(cè)了105例B細(xì)胞淋巴瘤石蠟標(biāo)本中LITAF基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化情況，發(fā)現(xiàn)89.5%的標(biāo)本中存在LITAF基因啟動(dòng)子CpG島的甲基化，由其所致的LITAF表達(dá)沉默或降低可能會(huì)引起B(yǎng)細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展。Zhou等[6]發(fā)現(xiàn)在胰腺癌組織中也存在LITAF啟動(dòng)子的甲基化并使其表達(dá)降低，LITAF基因的去甲基化恢復(fù)表達(dá)會(huì)抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖和凋亡。

我們分別對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中156例人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織和5例正常腦組織進(jìn)行了分析。與其他腫瘤組織相反的是，人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中LITAF的mRNA表達(dá)高于正常腦組織。該結(jié)果提示LITAF基因在人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的作用可能異于前列腺癌、急性白血病等惡性腫瘤。為此，我們通過(guò)RNAi技術(shù)抑制了人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251中LITAF的表達(dá)，觀察抑制LITAF基因后是否會(huì)影響U251細(xì)胞的增殖和凋亡。EDU和流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示抑制LITAF表達(dá)后細(xì)胞的增殖比率和凋亡發(fā)生無(wú)顯著性差異，說(shuō)明單純抑制LITAF表達(dá)并未對(duì)U251細(xì)胞的增殖和凋亡產(chǎn)生顯著影響。該結(jié)果提示LITAF可能不直接參與U251細(xì)胞的增殖和凋亡信號(hào)通路調(diào)節(jié)，腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤較正常腦組織細(xì)胞高表達(dá)LITAF可能在于其上游基因突變或過(guò)表達(dá)，例如TP53[4]、AMPK[5]等，導(dǎo)致LITAF基因表達(dá)上調(diào)。

盡管抑制U251細(xì)胞LITAF表達(dá)不影響細(xì)胞增殖和凋亡，但其與正常腦組織表達(dá)的差異仍提示其可能在腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中承擔(dān)某種調(diào)節(jié)功能。放射治療作為腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的主要治療手段，LITAF基因是否在U251細(xì)胞放療后的細(xì)胞生物學(xué)功能改變中發(fā)揮作用？由此我們繼續(xù)觀察到通過(guò)給予單次電離輻射后，流式細(xì)胞分析顯示，LITAF抑制組U251細(xì)胞在接受放射治療后的凋亡顯著低于對(duì)照組，而細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)結(jié)果顯示LITAF抑制組細(xì)胞克隆數(shù)顯著高于對(duì)照組。通過(guò)抑制LITAF基因U251細(xì)胞在電離輻射后細(xì)胞凋亡減少和克隆形成增強(qiáng)結(jié)果，提示高表達(dá)LITAF基因會(huì)增強(qiáng)U251細(xì)胞的放療敏感度。Hoey等[15]在前列腺癌細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)低表達(dá)LITAF的前列腺癌細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)放療的抵抗。從LITAF抑制組U251細(xì)胞在電離輻射后細(xì)胞凋亡較少、克隆數(shù)增加，但細(xì)胞克隆的大小形態(tài)與對(duì)照組無(wú)明顯差異，說(shuō)明LITAF基因可能影響了細(xì)胞放療后的凋亡發(fā)生。該結(jié)果結(jié)合單純抑制LITAF表達(dá)對(duì)U251細(xì)胞凋亡無(wú)明顯影響結(jié)果，提示LITAF基因可能主要參與了放療后細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)調(diào)節(jié)，抑制LITAF基因后，細(xì)胞在放療后DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡減少。其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

通過(guò)本研究，我們發(fā)現(xiàn)LITAF mRNA高表達(dá)于人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中，抑制人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞LITAF表達(dá)雖未對(duì)細(xì)胞的增殖和凋亡產(chǎn)生影響，但可使U251細(xì)胞的放療敏感度降低，其具體機(jī)制尚待深入研究。