黃昌林，陳典剛，朱虹帆，湯金梁，王東林，李光輝

0 引言

腦膠質(zhì)瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，WHO分型將其分為Ⅰ～Ⅳ級，其中WHOⅣ級腦膠質(zhì)瘤又稱腦膠質(zhì)母細胞瘤，惡性程度最高，預后最差，患者的中位生存時間僅14月左右[1-2]。目前手術聯(lián)合放、化療是人腦膠質(zhì)母細胞瘤的主要治療方法，但腦膠質(zhì)母細胞瘤高度浸潤性生長的生物學特性及對放化療的抗拒性，使復發(fā)成為絕大多數(shù)腦膠質(zhì)母細胞瘤患者最終難以避免的臨床結(jié)局。隨著近年對腦膠質(zhì)母細胞瘤基因?qū)用娴纳钊胩剿?，為腦膠質(zhì)母細胞瘤的分子靶向、基因及免疫治療等帶來了新的策略[3]。

LITAF基因作為一個多功能的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛分布于人體的不同組織[4]。近年來有報道指出，LITAF可能是一個潛在的抑癌基因，其表達水平的降低可能與前列腺癌[5]、胰腺癌[6]、B細胞淋巴瘤[7]、急性白血病[8]等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和放化療敏感度相關。關于腦膠質(zhì)母細胞瘤中LITAF基因的表達水平及其功能尚不清楚。本文通過分析LITAF基因在人腦膠質(zhì)母細胞瘤組織中的表達，抑制人腦膠質(zhì)母細胞瘤U251細胞（以下簡稱U251細胞）中LITAF基因表達，觀察其對U251細胞增殖、凋亡以及放療敏感度的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qPCR）試劑盒（日本，TaKaRa公司）；熒光定量PCR儀（美國，貝克曼庫爾特有限公司）；LITAF基因PCR上游引物：5′-ATGTCGGTTCCAGGACCTTAC-3′,下游引物：5′-TACGAAGGAGGATTCATGCCC-3′（美國，賽默飛世爾科技有限公司）；β肌動蛋白（β-actin）基因PCR上游引物：5′-GAGCTACGAGCTGC CTGACG-3′，下游引物：5′-GTAGTTTCGTGGATGCCACAG-3′（美國，賽默飛世爾科技有限公司）；LITAF基因干擾病毒Target序列：5′-CCAUUUUCUGUAAUCAAAUGA-3′（中國上海，吉凱基因科技有限公司）；Western blot凝膠試劑盒（中國上海，碧云天生物技術有限公司）；LITAF-單抗（中國武漢，三鷹生物技術有限公司）；鼠和兔二抗（中國武漢，博士德生物工程有限公司）；聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）（瑞士，羅氏公司）；濕轉(zhuǎn)儀（美國，BioRad公司）；5-乙炔基-2脫氧尿嘧啶核苷（EDU）試劑盒（美國，GeneCopoeia公司）；PE-7AAD凋亡試劑盒（美國，BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫分析 利用UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu/）網(wǎng)站分析TCGA數(shù)據(jù)庫中腦膠質(zhì)瘤組織的LITAF mRNA表達情況。

1.2.2 細胞培養(yǎng) U251細胞由本實驗室保存，加入含1%雙抗和10%胎牛血清的Gibco DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.3 LITAF基因干擾載體反轉(zhuǎn)錄病毒感染U251細胞 取對數(shù)生長期U251細胞制備成單細胞懸液，計數(shù)，接種至25 cm2培養(yǎng)瓶中。按病毒感染比率值10:1取對照病毒和LITAF基因干擾病毒分別感染靶細胞，觀察細胞綠色熒光產(chǎn)生。感染72 h后，去除含病毒載體的培養(yǎng)液，洗滌后加入含6 μg/ml嘌呤毒素的新鮮培養(yǎng)液進行細胞篩選，2～3天更換一次培養(yǎng)液，篩選7～10天獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞后，更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞分別用qPCR和Western blot檢測干擾結(jié)果。

1.2.4 qPCR測定U251細胞LITAF mRNA表達 按照TRIzol試劑盒說明書提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄，重復2次；將3次實驗獲得的各組cDNA進行qPCR檢測；PCR引物見前述，采用SYBR Premix PCR試劑盒，于熒光實時定量PCR儀測定LITAF基因的mRNA水平。

1.2.5 Western blot檢測U251細胞LITAF蛋白表達 蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，測定濃度后按常規(guī)方法進行凝膠電泳，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，小兔抗LITAF單抗標記，加入辣根過氧化物酶標記的相應二抗，增強化學發(fā)光顯影，以β-actin為參照。

1.2.6 干擾組、陰性對照組和空白組U251細胞增殖測定 干擾組為LITAF抑制病毒感染后的U251細胞，陰性對照組為轉(zhuǎn)染陰性對照病毒的U251細胞，空白組為未轉(zhuǎn)染病毒的U251細胞。每組按照3個孔重復。EDU檢測：各組細胞制備成單細胞懸液，計數(shù)后調(diào)整細胞濃度，按照1.5×105個/孔接種于6孔板內(nèi)，加培養(yǎng)液，37℃孵育過夜后，每孔分別加入2 ml混合培養(yǎng)液，37℃孵育6 h，按照EDU檢測試劑盒說明處理細胞，流式細胞儀分析各組細胞增殖比例。

1.2.7 細胞照射 分別取對數(shù)生長期細胞制備成單細胞懸液，計數(shù)后按2×105個/瓶接種至25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入10 ml含1%雙抗和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，細胞貼壁，封口膜封住培養(yǎng)瓶瓶蓋及透氣孔，75%酒精擦拭培養(yǎng)瓶， 6 MeV-電子線照射細胞后，75%酒精再次擦拭培養(yǎng)瓶消毒并撕去封口膜，放入37℃含5%CO2培養(yǎng)箱孵育。每組細胞設置3個重復。照射設備：美國Varian直線加速器；照射條件：28℃室溫，照射前治療室紫外線空氣消毒30 min，6 MeV-電子線照射細胞，劑量率為300 Mu/min，源皮距100 cm，照射野限光筒為25 cm×25 cm。培養(yǎng)液深度5 mm，培養(yǎng)瓶下方墊1 cm厚組織等效補償塊，照射劑量計劃由物理師在Eclipse放療計劃系統(tǒng)計算得出。

1.2.8 流式細胞凋亡分析 放療前細胞凋亡檢測：分別取對數(shù)生長期干擾組、陰性對照組和空白組U251細胞制備成單細胞懸液，計數(shù)后按2×105個/瓶接種至25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入4 ml含1%雙抗和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)箱孵育24 h，收集培養(yǎng)瓶內(nèi)所有細胞，PE-7AAD凋亡試劑盒染色，流式細胞分析儀檢測凋亡細胞比例。放療后細胞凋亡檢測：干擾組和陰性對照組U251細胞給予單次13 Gy（6MeV-電子線）照射后，37℃含5%CO2培養(yǎng)箱孵育72 h，收集培養(yǎng)瓶內(nèi)懸浮和貼壁的所有細胞，PE-7AAD凋亡試劑盒染色，流式細胞分析儀檢測凋亡細胞比例。

1.2.9 克隆形成實驗 干擾組和陰性對照組U251細胞給予單次7 Gy（6MeV-電子線）照射后，37℃含5% CO2培養(yǎng)箱孵育24 h，制備成單細胞懸液，計數(shù)后按2×103個/孔接種至6孔板中，每孔加入2 ml含1%雙抗和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，十字形輕輕晃動6孔板，使細胞分散均勻。每組細胞設3個重復。放入37℃培養(yǎng)箱中孵育，3～4天更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)10～14天，進行蘇木精染色并計數(shù)大于50個細胞的克隆數(shù)。最后計算克隆形成率，克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細胞數(shù)）×100%。

1.3 統(tǒng)計學方法

所有實驗圖表及數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 5軟件進行制作及統(tǒng)計學分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LITAF基因高表達于人腦膠質(zhì)母細胞瘤組織

對TCGA數(shù)據(jù)庫156例人腦膠質(zhì)母細胞瘤組織和5例正常腦組織中LITAF mRNA表達情況分析，結(jié)果顯示，與正常腦組織相比，LITAF mRNA顯著高表達于人腦膠質(zhì)母細胞瘤組織中（P＜0.0001），見圖1。

圖1 分析TCGA數(shù)據(jù)庫人腦膠質(zhì)母細胞瘤組織及正常腦組織中LITAF mRNA的表達Figure1 Expression of LITAF mRNA in human glioblastoma and normal brain tissues from TCGA

2.2 抑制U251細胞中LITAF表達不影響細胞的增殖和凋亡

用RNAi抑制U251細胞LITAF表達，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。采用qPCR、Western blot方法檢測干擾效果，結(jié)果顯示干擾組與陰性對照組細胞相比，LITAF mRNA和蛋白表達顯著降低（P=0.0013），見圖2。該結(jié)果提示LITAF RNAi顯著抑制了干擾組U251細胞內(nèi)LITAF基因的表達。EDU標記、流式細胞術分析空白組、陰性對照組、干擾組細胞增殖情況。結(jié)果顯示空白染組、陰性對照組和干擾組增殖比例分別為57.03%、56.26%和57.69%，三組細胞增殖比例差異無統(tǒng)計學意義（P=0.4665），見圖3，提示U251細胞內(nèi)LITAF基因表達抑制后，U251細胞的增殖未受到明顯影響，在缺乏其他因素作用下，LITAF基因未參與細胞的增殖調(diào)控。

圖2 qPCR和Western blot檢測U251細胞LITAF RNAi的表達Figure2 Expression of LITAF RNAi in U251 cells measured by qPCR and Western blot

圖3 EDU檢測抑制LITAF后U251細胞的増殖情況Figure3 Effect of LITAF on proliferation of glioblastoma U251 cells detected by EDU

流式細胞術檢測三組細胞凋亡，結(jié)果顯示凋亡率發(fā)生比例為空白組4.64%、陰性對照組5.37%、干擾組細胞4.85%，三組細胞凋亡比例差異無統(tǒng)計學意義（P=0.4619），見圖4。該結(jié)果顯示僅抑制LITAF基因表達，不會影響U251細胞的凋亡調(diào)控機制。

圖4 流式細胞術檢測干擾LITAF對U251細胞凋亡的影響Figure4 Apoptosis of glioblastoma U251 cells measured by flow cytometry

2.3 抑制U251細胞LITAF基因后放療敏感度減弱

陰性對照組與干擾組細胞在單次13 Gy 6MeV-電子線照射后72 h，流式細胞分析，結(jié)果顯示陰性對照組凋亡比例為22.24%、干擾組細胞為13.20%，干擾組細胞凋亡比例顯著低于陰性對照組（P=0.0016），見圖5。說明抑制U251細胞LITAF基因表達后，細胞在接受電離輻射后凋亡顯著減少，提示LITAF基因參與了U251細胞電離輻射后細胞損傷修復或凋亡機制的調(diào)控，抑制LITAF基因表達可導致U251細胞放療敏感度減弱。

陰性對照組與干擾組細胞經(jīng)單次7 Gy 6MeV-電子線照射后，細胞克隆形成實驗結(jié)果顯示干擾組細胞克隆大小、形態(tài)與對照組相似，但克隆形成率顯著高于陰性對照組細胞（P=0.0142），見圖6。結(jié)果提示抑制LITAF基因可顯著增加電離輻射后U251細胞的存活和增殖能力，進一步證實了抑制LITAF基因表達可明顯減弱U251細胞的放療敏感度。

圖5 流式細胞術檢測抑制LITAF基因?qū)Ψ暖熀骍251細胞凋亡的影響Figure5 Apoptosis of glioblastoma U251 cells treated with 13 Gray irradiation measured by flow cytometry

3 討論

人LITAF基因（LPS-induced TNF-α factor）被稱作p53誘導的基因7（PIG7），位于16號染色體上，其mRNA大小為1.8 kb ，編碼蛋白質(zhì)大小為23.9 kDa，包含228個氨基酸。LITAF廣泛表達于人體各組織細胞中，其中脾臟、淋巴結(jié)和外周血白細胞表達最高，其次為骨髓、胸腺、闌尾、腎臟和胎盤，表達最低的是心臟、大腦和胎兒肝臟[4]。LITAF可在脂多糖（LPS）的刺激下，與STAT6B形成復合物，共同調(diào)控TNF-α、IL-6和CCL-18等炎性因子的表達，在正常的炎性反應過程中起著重要的作用[9]。異常表達的LITAF與炎性反應性腸病[10]和骨關節(jié)炎[11]的發(fā)生發(fā)展相關。除此之外，LITAF的突變還與乳腺佩吉特病[12]和腓骨肌萎縮癥[13]有關。

圖6 克隆形成實驗檢測抑制LITAF對放療后U251細胞克隆形成率的影響Figure6 Clone formation rate of glioblastoma U251 cells treated with 7 Gray irradiation measured with Clonogenic assay

近年來多篇報道指出，LITAF基因可能是一個潛在的抑癌基因，抑制腫瘤細胞的增殖，并促進其凋亡。Zhou等[5]指出LITAF通過調(diào)控TNFSF15來抑制前列腺癌細胞的增殖。Wang等[8]分析了138例急性白血病患者和21例健康者骨髓標本中LITAF mRNA表達情況，發(fā)現(xiàn)在急性白血病患者骨髓中LITAF的表達跟健康者相比顯著下降；且難治復發(fā)白血病患者跟初治白血病患者相比，LITAF的表達更低，同時對化療也表現(xiàn)出更明顯的抗拒性。王金潔等[14]檢測了105例B細胞淋巴瘤石蠟標本中LITAF基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化情況，發(fā)現(xiàn)89.5%的標本中存在LITAF基因啟動子CpG島的甲基化，由其所致的LITAF表達沉默或降低可能會引起B(yǎng)細胞淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展。Zhou等[6]發(fā)現(xiàn)在胰腺癌組織中也存在LITAF啟動子的甲基化并使其表達降低，LITAF基因的去甲基化恢復表達會抑制胰腺癌細胞的增殖和凋亡。

我們分別對TCGA數(shù)據(jù)庫中156例人腦膠質(zhì)母細胞瘤組織和5例正常腦組織進行了分析。與其他腫瘤組織相反的是，人腦膠質(zhì)母細胞瘤組織中LITAF的mRNA表達高于正常腦組織。該結(jié)果提示LITAF基因在人腦膠質(zhì)母細胞瘤中的作用可能異于前列腺癌、急性白血病等惡性腫瘤。為此，我們通過RNAi技術抑制了人腦膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251中LITAF的表達，觀察抑制LITAF基因后是否會影響U251細胞的增殖和凋亡。EDU和流式細胞分析結(jié)果顯示抑制LITAF表達后細胞的增殖比率和凋亡發(fā)生無顯著性差異，說明單純抑制LITAF表達并未對U251細胞的增殖和凋亡產(chǎn)生顯著影響。該結(jié)果提示LITAF可能不直接參與U251細胞的增殖和凋亡信號通路調(diào)節(jié)，腦膠質(zhì)母細胞瘤較正常腦組織細胞高表達LITAF可能在于其上游基因突變或過表達，例如TP53[4]、AMPK[5]等，導致LITAF基因表達上調(diào)。

盡管抑制U251細胞LITAF表達不影響細胞增殖和凋亡，但其與正常腦組織表達的差異仍提示其可能在腦膠質(zhì)母細胞瘤中承擔某種調(diào)節(jié)功能。放射治療作為腦膠質(zhì)母細胞瘤的主要治療手段，LITAF基因是否在U251細胞放療后的細胞生物學功能改變中發(fā)揮作用？由此我們繼續(xù)觀察到通過給予單次電離輻射后，流式細胞分析顯示，LITAF抑制組U251細胞在接受放射治療后的凋亡顯著低于對照組，而細胞克隆形成試驗結(jié)果顯示LITAF抑制組細胞克隆數(shù)顯著高于對照組。通過抑制LITAF基因U251細胞在電離輻射后細胞凋亡減少和克隆形成增強結(jié)果，提示高表達LITAF基因會增強U251細胞的放療敏感度。Hoey等[15]在前列腺癌細胞中也發(fā)現(xiàn)低表達LITAF的前列腺癌細胞表現(xiàn)出對放療的抵抗。從LITAF抑制組U251細胞在電離輻射后細胞凋亡較少、克隆數(shù)增加，但細胞克隆的大小形態(tài)與對照組無明顯差異，說明LITAF基因可能影響了細胞放療后的凋亡發(fā)生。該結(jié)果結(jié)合單純抑制LITAF表達對U251細胞凋亡無明顯影響結(jié)果，提示LITAF基因可能主要參與了放療后細胞的DNA損傷修復調(diào)節(jié)，抑制LITAF基因后，細胞在放療后DNA損傷修復能力增強，導致細胞凋亡減少。其具體機制還有待進一步研究。

通過本研究，我們發(fā)現(xiàn)LITAF mRNA高表達于人腦膠質(zhì)母細胞瘤組織中，抑制人腦膠質(zhì)母細胞瘤U251細胞LITAF表達雖未對細胞的增殖和凋亡產(chǎn)生影響，但可使U251細胞的放療敏感度降低，其具體機制尚待深入研究。