佟春艷，柳春韜，王學(xué)慧，劉麗霞

卵巢癌占所有女性生殖系統(tǒng)腫瘤的30%左右，其具有高致死率以及高隱匿性[1]。研究發(fā)現(xiàn)，近70%的卵巢癌患者發(fā)現(xiàn)時已為晚期，失去最佳治療時機，主要與卵巢位于盆腔內(nèi)、早期卵巢癌癥狀不明顯以及缺乏特異性高的生物標志物等有關(guān)[2]。卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展與多種因素有關(guān)，如環(huán)境、工作壓力、激素水平變化、絕經(jīng)前后以及遺傳因素等有關(guān)。EMSY與乳腺癌易感基因2（breast cancer susceptibility gene 2，BRCA 2）相互作用，參與DNA損傷修復(fù)[3]。研究顯示，EMSY基因擴增及過表達與多種癌癥的發(fā)生有關(guān)[4]。目前對于早期卵巢癌與EMSY基因表達水平及多態(tài)性相關(guān)性研究較少，其是否存在相關(guān)性仍值得深入研究。本研究旨在探討EMSY基因表達水平及多態(tài)性與早期卵巢上皮癌的關(guān)系，以期為臨床進一步深入研究早期卵巢上皮癌的發(fā)病及預(yù)后提供一定的基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2010年4月—2013年5月在大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院（我院）婦科行腹腔鏡或開腹行全面分期手術(shù)治療的早期卵巢上皮癌患者118例作為研究組，年齡28～57歲，平均（46.23±8.61）歲，經(jīng)產(chǎn)史者 107例，絕經(jīng)者53例。所有患者經(jīng)術(shù)中冰凍切片快速病理檢查或石蠟包埋病理切片確診為卵巢癌，根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）分期標準（2009版）進行手術(shù)病理分期，確定為Ⅰ～Ⅱ期。納入標準：①術(shù)前及術(shù)中檢查無腹水或者含少量盆腹腔積液；②病灶僅局限在一側(cè)或雙側(cè)卵巢；③盆腹腔、大網(wǎng)膜以及其他部位未見腫瘤病灶組織。排除標準：①診斷不明確或診斷出其他種類惡性腫瘤；②FIGO分期為Ⅲ～Ⅳ期；③合并有糖尿病、高血壓、冠心病等慢性病；④臨床資料不全或缺少病理標本。另選取同期來我院接受檢查的良性婦科腫瘤患者63例作為對照組，經(jīng)病理檢查證實為卵巢囊腫、子宮肌瘤等，年齡29～59歲，平均（47.51±8.83）歲，經(jīng)產(chǎn)史者57例，絕經(jīng)者28例。2組年齡（t=-0.944，P=0.346）、經(jīng)產(chǎn)史（χ2=0.002，P=0.965）和絕經(jīng)（χ2=0.004，P=0.952）差異無統(tǒng)計學(xué)意義，2組具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 病理組織RNA及全血DNA的提取 采用總RNA提取試劑盒（美國Omega公司）提取所有患者病理組織中總RNA，采用Axygene全血基因組DNA提取試劑盒（美國Axygen公司）提取DNA。經(jīng)電泳以及紫外分光光度法檢測RNA、DNA的濃度及質(zhì)量，所有樣品保存于－80℃冰箱中備用。全血經(jīng)離心后獲得血清，采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒檢測血清中BRCA2的表達水平。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測EMSY mRNA水平 采用逆轉(zhuǎn)錄酶將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用PCR儀分別擴增EMSY mRNA、BRCA2 mRNA以及內(nèi)參基因βactin。其中 β-actin上游引物序列：5′-AGTCTTGCTAGCTACGCGCCT-3′，下游引物序列：5′-CGCTAAAGCTAGCTACGCATCGA-3′，產(chǎn)物長度為290 bp；EMSY mRNA上游引物序列：5′-TAGCGGCTAACGTTTACGCC-3′，下游引物序列：5′-AGGCTGCTAGCTAACCGTCAA-3′，產(chǎn)物長度為 342bp；BRCAmRNA上游引物序列：5′-TGCCATCGATCAATTCGC-3′，下游引物序列：5′-GCATGCTAGCCTTAACGCATCAAC-3′，產(chǎn)物長度為220 bp。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。將5 μL擴增產(chǎn)物經(jīng)5%瓊脂糖電泳進行分離，后經(jīng)溴化乙錠染色，采用電泳凝膠成像分析系統(tǒng)測定EMSY/β-actin的灰度比，作為EMSY mRNA相對表達量。

1.2.3 基因分型檢測 采用PCR-限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）技術(shù)檢測EMSY基因421+242A＞G位點多態(tài)性。引物以及探針經(jīng)Primer Express 2.0軟件進行設(shè)計，并經(jīng)上海生工生物工程股份有限公司合成。上游引物序列：5′-CGCGTGCGTTTCGAACCGCTGGCTAGC-3′，下游引物序列：5′-GGCGTCAAATCAGTACGCTGGTAC-3′。PCR擴增體系為25 μL，其中含有 5 μL PCR緩沖液，上游及下游引物各0.5 μL，5 U/L Taq DNA 聚合酶 0.25 μL，2.5 mmol/L 三磷酸堿基脫氧核苷酸（deoxyribonucleotide triphosphates，dNTPs）4.0 μL，剩余加入雙蒸水。EMSY基因421+242A＞G位點的擴增反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2 min，而后按照94℃30 s、59℃30 s、62℃ 15 s的順序進行40個循環(huán)，最后以62℃延伸1 min。PCR擴增產(chǎn)物長度為310 bp。所有樣本均在ABI-7500 Fast RT-PCR電泳儀上進行反應(yīng)，抽取10%的樣本進行基因測序，從而確定基因分型檢測的準確性。

1.2.4 隨訪 通過電話咨詢、門診復(fù)診等方式詳細記錄患者信息，隨訪時間從術(shù)后出院至隨訪截止時間（2018年7月31日），隨訪中位時間38個月，記錄研究組患者術(shù)后化療、術(shù)后復(fù)發(fā)以及術(shù)后生存情況（主要包含術(shù)后死亡原因、死亡時間以及生存時間等）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。定量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本均數(shù)的t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；采用卡方檢驗或Fisher確切概率法分析2組等位基因和基因型頻率分布情況；群體基因型采用Hardy-Weinberg平衡檢驗；采用Kaplan-Meier法進行卵巢上皮癌患者術(shù)后的生存分析，比較采用Log-rank檢驗；采用Cox回歸模型分析評估各病理參數(shù)對預(yù)后的相對危險度。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測EMSY mRNA表達RT-PCR檢測結(jié)果顯示，研究組EMSY mRNA相對表達量（0.813±0.126）高于對照組（0.274±0.088），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=33.592，P=0.000）；研究組 BRCA2 mRNA 相對表達量（0.366±0.060）高于對照組（0.170±0.044），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=25.046，P=0.000）。見圖1。

圖1 RT-PCR檢測2組EMSY mRNA表達情況

2.2 EMSY mRNA表達與早期卵巢上皮癌患者臨床病理因素的關(guān)系年齡、絕經(jīng)、FIGO分期、分化程度、病理類型、術(shù)后化療和術(shù)后復(fù)發(fā)與患者EMSY mRNA表達水平有關(guān)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。經(jīng)產(chǎn)史和體質(zhì)量指數(shù)（BMI）與患者EMSY mRNA表達水平無關(guān)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。見表1。

表1 EMSY mRNA表達與早期卵巢上皮癌患者臨床病理因素的關(guān)系 （±s）

表1 EMSY mRNA表達與早期卵巢上皮癌患者臨床病理因素的關(guān)系 （±s）

變量 n EMSY mRNA相對表達量 t或F P年齡 18.823 0.000≥45歲 70 0.870±0.065＜45歲 48 0.650±0.058經(jīng)產(chǎn)史1.274 0.239是107 0.770±0.041否11 0.740±0.077絕經(jīng)19.262 0.000是53 0.880±0.065否65 0.640±0.069 BMI（kg/m2）1.371 0.173≥25 42 0.790±0.061＜25 76 0.773±0.067 FIGO分期 17.611 0.000Ⅰ97 0.607±0.050Ⅱ21 0.910±0.075分化程度 224.967 0.000低分化 53 0.909±0.057中分化 33 0.759±0.095高分化 32 0.560±0.072病理類型 27.854 0.000漿液性乳頭狀癌 79 0.650±0.065黏液腺癌 32 0.727±0.068透明細胞癌 7 0.803±0.074術(shù)后化療11.279 0.000是110 0.614±0.065否8 0.883±0.064術(shù)后復(fù)發(fā)18.801 0.000是18 0.900±0.076否100 0.610±0.057

2.3 EMSY基因421+242A＞G位點電泳產(chǎn)物EMSY基因421+242A＞G位點酶切過程中呈現(xiàn)一條亮帶且長度為326bp的條帶為GG型；長度分別為123、286、326 bp的3條亮帶為AG型；長度分別為123、286 bp的2條亮帶為AA型。隨機選取EMSY基因421+242A＞G位點的PCR擴增產(chǎn)物行基因測序，結(jié)果顯示堿基的改變與酶切結(jié)果一致。見圖2。

圖2 EMSY基因421+242A＞G位點電泳及基因擴增序列圖

2.4 EMSY基因421+242A＞G位點基因頻率分布情況2組患者EMSY基因421+242A＞G位點基因型（χ2=1.287，P=0.149）及 A、G 等位基因頻率（χ2=1.056，P=0.164）符合 Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，提示樣本具有群體代表性。研究組該位點3種基因型和2種等位基因分布頻率與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見表2。

表2 EMSY基因421+242A＞G位點基因頻率分布情況[n（%）]

采用ELISA法檢測2組不同基因型患者血清BRCA2表達水平。結(jié)果顯示，研究組AA型BRCA2（29.79±3.68）mg/L、AG 型 （28.31±4.19）mg/L、GG 型（25.87±6.38）mg/L，對照組 AA 型 BRCA2（20.69±6.74）mg/L、AG 型（21.78±7.21）mg/L、GG 型（21.19±7.39）mg/L，2組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=9.954，P=0.000；t=6.617，P=0.000；t=4.445，P=0.000）。

2.5 研究組不同基因型生存分析研究組不同基因型之間總生存期、疾病無進展生存期差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=7.590，P=0.022；χ2=8.415，P=0.015）。GG 基因型總生存期、疾病無進展生存期與AA基因型比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Log-rank χ2=7.482，P=0.006；Log-rank χ2=8.406，P=0.004）。見圖 3。將年齡、FIGO分期、分化程度、病理類型、EMSY mRNA、EMSY多態(tài)性及術(shù)后化療納入Cox風(fēng)險回歸模型行多變量分析，結(jié)果顯示EMSY mRNA高表達是影響患者總生存期的危險因素（OR=2.322，95%CI：1.277～5.031，P=0.027），AA基因型是影響患者疾病無進展生存期的危險因素（OR=1.882，95%CI：1.192～4.323，P=0.039）。

圖3 Kalplan-Meier法分析早期卵巢上皮癌患者總生存期、疾病無進展生存期情況

3 討論

上皮性卵巢癌是婦科較為常見的女性生殖系統(tǒng)腫瘤，5年生存率約30%。研究顯示，我國卵巢癌發(fā)病率較高，且呈逐年上升趨勢。卵巢癌組織類型較為復(fù)雜，發(fā)病時隱匿性高，多數(shù)患者初診時已為晚期（Ⅲ～Ⅳ期），而早期卵巢癌（Ⅰ～Ⅱ期）預(yù)后較好，因此早發(fā)現(xiàn)、早治療對于患者預(yù)后有明顯改善作用。Matsuo等[5]研究顯示，早期卵巢癌患者行腹腔鏡全面分期手術(shù)術(shù)后復(fù)發(fā)率約為13%。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)手術(shù)治療后復(fù)發(fā)率為15.25%（18/118），略高于國外研究報道，原因可能為：①納入的Ⅱ期卵巢癌患者例數(shù)稍多；②納入的118例患者有53例為低分化，屬于高?；颊?。

EMSY位于染色體11q13，編碼1 322個氨基酸，其“N”末端約有100個保守的氨基酸序列。而在惡性腫瘤中常伴有11q13位點的擴增[6]。Dansonka-Mieszkowska等[7]研究采用熒光原位雜交法（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）檢測28個乳腺癌細胞系EMSY的擴增情況，發(fā)現(xiàn)有5個細胞系伴有EMSY擴增。Jelinic等[8]對875例散發(fā)性婦科腫瘤患者的研究發(fā)現(xiàn)，65例患者表現(xiàn)出EMSY高擴增。EMSY能夠與BRCA家族中BRCA2以“伙伴”形式出現(xiàn)，且EMSY蛋白可與BRCA2結(jié)合并抑制BRCA2的活性，當(dāng)EMSY過表達時，可使BRCA2失活，導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定以及癌變[9]。目前研究發(fā)現(xiàn)散發(fā)性乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、甲狀腺癌以及前列腺癌等癌細胞系中均能檢測到EMSY mRNA及蛋白產(chǎn)物。本研究發(fā)現(xiàn)，卵巢上皮癌患者病理組織中EMSY mRNA與BRCA2 mRNA相對表達量均高于對照組，且ELISA檢測發(fā)現(xiàn)研究組不同基因型BRCA2表達水平高于對照組，提示EMSY與BRCA2以“伙伴”形式共表達于早期卵巢上皮癌患者體內(nèi)，從而影響疾病的發(fā)生、發(fā)展。需要指出的是，BRCA2在絕經(jīng)、年齡≥45歲的卵巢癌患者體內(nèi)高表達，而本研究也發(fā)現(xiàn)≥45歲、絕經(jīng)、FIGO分期Ⅱ期、低分化、透明細胞癌、術(shù)后未化療和術(shù)后復(fù)發(fā)患者EMSY mRNA表達水平均較高，提示上述因素可能與EMSY、BRCA2過表達和卵巢癌患者預(yù)后有關(guān)。

目前對于EMSY基因多態(tài)性與早期卵巢上皮癌預(yù)后的關(guān)系研究報道較少，尤其是國內(nèi)鮮有關(guān)于該基因位點與早期卵巢癌關(guān)系的研究報道。本研究發(fā)現(xiàn)，研究組EMSY基因421+242A＞G位點AA基因型、A等位基因頻率高于對照組，提示EMSY基因421+242A＞G位點可能為早期卵巢上皮癌發(fā)病的易感基因。為進一步探討EMSY基因421+242A＞G位點與早期卵巢上皮癌預(yù)后的關(guān)系，Kalplan-Meier法分析顯示，該位點GG基因型總生存期、疾病無進展生存期高于AA基因型；Cox風(fēng)險模型顯示，AA基因型是早期卵巢上皮癌患者疾病無進展生存期的危險因素，提示EMSY基因421+242A＞G位點為早期卵巢上皮癌預(yù)后的重要基因位點。

綜上所述，初步研究證實EMSY基因表達水平及421+242A＞G位點多態(tài)性與早期卵巢上皮癌預(yù)后有關(guān)。目前對于BRCA2與卵巢癌的關(guān)系已經(jīng)得到初步證實，但不同基因型卵巢癌患者BRCA2表達水平不盡相同，表明EMSY基因表達可能影響B(tài)RCA2的表達，從而影響卵巢癌患者預(yù)后。仍有待進一步大樣本、多中心研究，為卵巢癌的臨床治療和預(yù)防提供依據(jù)。