陶春梅，龔雅利

作者單位：1重慶市沙坪壩區(qū)陳家橋醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 401331；2第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院燒傷研究所，重慶 400038

銅綠假單胞菌是一種重要的條件致病菌，也是引起醫(yī)院感染的重要病原菌之一。在免疫力低下或缺失、肺囊性纖維化以及燒傷病人中的感染尤為常見(jiàn)［1-2］。近年來(lái)，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，銅綠假單胞菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率日益攀升，多重耐藥（multidrug-resistant，MDR）及廣泛耐藥（extensively drug resistant，XDR）菌株的分離率不斷升高，為臨床感染的控制和治療帶來(lái)了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)［3］。根據(jù)2016年全國(guó)耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素的耐藥率達(dá)到了25%以上。不僅在中國(guó)，多耐藥銅綠假單胞菌在全球亦呈現(xiàn)出廣泛流行和傳播的特點(diǎn)，成為重要的全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題［3］。因此有必要對(duì)臨床感染的銅綠假單胞菌進(jìn)行定期的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)及耐藥性分析，從而幫助我們了解細(xì)菌的親緣關(guān)系、傳播途徑以及耐藥特點(diǎn)，確認(rèn)是否存在暴發(fā)或交叉感染，以便制定有效的防控措施。

在本研究中，我們對(duì)280株銅綠假單胞菌進(jìn)行了ERIC-PCR分型及耐藥性分析，并檢測(cè)了35株碳青霉烯不敏感菌株中12種主要的碳青霉烯酶基因（blaIMP，blaVIM，blaNDM，blaGES，blaSPM，blaOXA-48，blaBIC，blaKPC，blaAIM，blaGIM，blaSIM，blaDIM）的攜帶情況，探討細(xì)菌的型別分布及耐藥變遷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株 280株銅綠假單胞菌分離自2011年6月至2017年7月重慶市沙坪壩區(qū)陳家橋醫(yī)院住院病人，所有菌株經(jīng)API 20NE系統(tǒng)（非腸道革蘭陰性桿菌鑒定系統(tǒng)）鑒定為銅綠假單胞菌。

1.1.2主要儀器和試劑 生化鑒定系統(tǒng)（API 20NE，法國(guó)BioMerieux）；PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)Bio-Rad）；電泳儀（美國(guó)Bio-Rad）；凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad）；藥敏檢測(cè)紙片（英國(guó)Oxoid）；LB培養(yǎng)基（英國(guó)Oxoid）。

1.2 方法

1.2.1菌株的分離鑒定 按常規(guī)方法分離采集菌株，均采用API 20NE生化鑒定系統(tǒng)分析鑒定。

1.2.2ERIC-PCR分型 取各菌株菌液煮沸10 min后5 000g離心，吸取上清作為PCR擴(kuò)增模板。以ERIC1：5’-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3’和ERIC2：5’-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’為引物（上海生工合成）［4］，用2×Fast Taq酶（Novoprotein）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件如下：95℃預(yù)變性7 min，95℃變性1 min，52℃退火1 min，62℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，最后62℃終延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。應(yīng)用Quantity one軟件對(duì)獲得的指紋圖譜進(jìn)行識(shí)別提取，最后采用非加權(quán)組平均法進(jìn)行聚類(lèi)分析。以相似度≥0.8作為同一基因型，＜0.8為不同基因型。

1.2.3藥敏試驗(yàn) 應(yīng)用K-B擴(kuò)散法鑒定哌拉西林（PIP）、哌拉西林/他唑巴坦（TZP）、替卡西林/棒酸（TIM）、頭孢他啶（CAZ）、頭孢吡肟（FEP）、氨曲南（ATM）、亞胺培南（IMP）、美羅培南（MEM）、阿米卡星（AMK）、慶大霉素（GEN）、妥布霉素（TOB）、左氧氟沙星（LVX）、環(huán)丙沙星（CIP）等抗生素的敏感性，判定方法參考細(xì)菌分離當(dāng)年的CLSI（美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)）標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4碳青霉烯酶基因檢測(cè) 按上述PCR模板制備方法，取碳青霉烯不敏感菌株35株中12對(duì)主要的碳青霉烯酶基因（blaIMP，blaVIM，blaNDM，blaGES，blaSPM，blaOXA-48，blaBIC，blaKPC，blaAIM，blaGIM，blaSIM，blaDIM）的引物，以2×Fast Taq酶進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，引物及方法參見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)［5］。擴(kuò)增體系及條件如下：模板1 μL，上下游引物各0.5 μL，2×Fast Taq酶5 μL，去離子水3 μL。94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5 min。PCR產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳分析。

2 結(jié)果

2.1 菌株標(biāo)本來(lái)源及病房分布本研究一共統(tǒng)計(jì)了分離的280株銅綠假單胞菌，同一病人選取首次分離菌。標(biāo)本來(lái)源以痰液標(biāo)本最多，為262株（93.6%）。其他標(biāo)本來(lái)源依次為傷口分泌物9株（3.2%）、膿液3株（1.0%）、組織液2株（0.7%）、血液2株（0.7%）、穿刺液1株（0.4%）、尿液1株（0.4%）。280株細(xì)菌的病房分布以內(nèi)一科（呼吸內(nèi)科、消化內(nèi)科）居多，共179株（63.9%），其次是ICU共36株（12.9%），其余病房依次為兒科21株（7.5%）、內(nèi)二科（心血管內(nèi)科、神經(jīng)內(nèi)科）18株（6.4%）、外一科（骨科）13株（4.6%）、外二科（普外科）8株（2.9%）、門(mén)診4株（1.4%）、婦產(chǎn)科1株（0.4%）。

2.2 ERIC-PCR分型280株銅綠假單胞菌通過(guò)ERIC-PCR分型及聚類(lèi)分析后，以相似度≥0.8作為同一基因型分型，所有細(xì)菌可以分為17種型別，分別命名為A（42株）、B（1株）、C（4株）、D（16株）、E（18株）、F（16株）、G（47株）、H（43株）、I（22株）、J（20株）、K（8株）、L（24株）、M（1株）、N（8株）、O（7株）、P（2株）、Q（1株）型，見(jiàn)圖1。

其中A、G、H三種為主要型別，分別有42株、47株和43株。A、G、H三種型別在幾個(gè)主要的科室如內(nèi)一科（呼吸內(nèi)科、消化內(nèi)科）、ICU、兒科、內(nèi)二科（心血管內(nèi)科、神經(jīng)內(nèi)科）、外一科（骨科）、外二科（普外科）均有分布。其余型別散在分布于各個(gè)科室。

圖2為典型的ERIC-PCR產(chǎn)物電泳圖，箭頭所示依次為A、G、H三種主要型別的指紋圖譜。

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果藥敏試驗(yàn)共測(cè)試了13種抗菌藥物的敏感性，結(jié)果按照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)分為敏感、中介和耐藥。細(xì)菌對(duì)各種抗生素的敏感性分別為哌拉西林（PIP，82.9%）、哌拉西林/他唑巴坦（TZP，90.4%）、替卡西林/棒酸（TIM，80.4%）、頭孢他啶（CAZ，81.1%）、頭孢吡肟（FEP，86.8%）、氨曲南（ATM，88.6%）、亞胺培南（IMP，89.6%）、美羅培南（MEM，92.9%）、阿米卡星（AMK，94.6%）、慶大霉素（GEN，90.7%）、妥布霉素（TOB，95.4%）、左氧氟沙星（LVX，86.4%）、環(huán)丙沙星（CIP，87.5%）。

2.4 碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥趨勢(shì)分析該院6年間銅綠假單胞菌亞胺培南和美羅培南的總不敏感率（亞胺培南或美羅培南不敏感菌株數(shù)/菌株總數(shù)）分別為10.4%（29/280）和7.1%（20/280），其中，2011年6月至2017年7月各年份分離菌株對(duì)亞胺培南的不敏感 率 分 別 為 5.5%、5.4%、7.1%、10.6%、13.2%、12.2%、14.7%，而對(duì)美羅培南的不敏感率分別為5.5%、2.7%、2.3%、6.3%、9.4%、10.2%、11.7%。表明該院分離的銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素的耐藥率有逐年升高的趨勢(shì)。見(jiàn)圖3。

圖3 2011年6月至2017年7月分離銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素的不敏感率

2.5 碳青霉烯酶的攜帶檢測(cè)結(jié)果分析通過(guò)PCR檢測(cè)35株碳青霉烯類(lèi)抗生素不敏感菌株的碳青霉烯酶的攜帶情況，結(jié)果表明僅IMP和VIM兩種酶編碼基因有檢出，攜帶率分別為8.57%（3/35）和5.71%（2/35）。 其 余 基 因 blaNDM，blaGES，blaSPM，blaOXA-48，blaBIC，blaKPC，blaAIM，blaGIM，blaSIM，blaDIM均未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)。

3 討論

銅綠假單胞菌是引起醫(yī)院感染的重要的條件致病菌，由于耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重，對(duì)其臨床感染的治療和耐藥機(jī)制的研究一直備受關(guān)注。不同于其他細(xì)菌單一的克隆傳播，銅綠假單胞菌往往呈現(xiàn)出多樣性的遺傳背景，而基因型別的多樣性使其更容易獲得耐藥性或者其他遺傳優(yōu)勢(shì)，導(dǎo)致其毒力增強(qiáng)，感染能力增加［6］。本研究中，從標(biāo)本來(lái)源和科室分布來(lái)看，絕大部分標(biāo)本來(lái)自于痰液，呼吸內(nèi)科和ICU病房分離率最高，說(shuō)明在我院銅綠假單胞菌多來(lái)源于肺部感染的內(nèi)科病人，該群體應(yīng)該成為銅綠假單胞菌防控的重點(diǎn)。ERIC-PCR分型的結(jié)果顯示我院分離的銅綠假單胞菌呈現(xiàn)出較高的遺傳多樣性，與國(guó)內(nèi)各地區(qū)醫(yī)院流調(diào)報(bào)道基本一致［7-9］。但基因分型以A、G、H三種主要型別為主，且在大多數(shù)科室均有分布，表明這三種型別是我院流行的優(yōu)勢(shì)型別，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)這些主要型別的監(jiān)測(cè)，控制其在病區(qū)間的傳播，降低醫(yī)院感染的發(fā)生率。此外，各個(gè)科室的型別組成也有一定的差異。這種差異可能是由于各個(gè)科室抗生素使用習(xí)慣不同所致，不同的選擇壓力導(dǎo)致了不同型別的感染和流行。但ERIC-PCR也存在一定的局限性，與脈沖場(chǎng)凝膠電泳及多位點(diǎn)序列分型相比，ERIC-PCR的分型結(jié)果很難進(jìn)行橫向比較，只能反映局部地區(qū)流行細(xì)菌的親緣關(guān)系。

隨著抗生素的廣泛使用，銅綠假單胞菌對(duì)大多數(shù)臨床常用抗生素的敏感性不斷下降，多耐藥和廣泛耐藥細(xì)菌分離率日益增高。碳青霉烯類(lèi)抗生素是治療多耐藥銅綠假單胞菌常用且有效的抗菌藥物之一，其耐藥率也在不斷攀升［10］。但各地銅綠假單胞菌的碳青霉烯耐藥率也有所差異，在歐洲各國(guó)，碳青霉烯類(lèi)抗生素不敏感率大多在10%～30%不等，但希臘達(dá)到了50.5%［11］。美國(guó)研究機(jī)構(gòu)所提供的數(shù)據(jù)顯示亞胺培南耐藥率為21.9%，美羅培南耐藥率為15.4%［12］。中國(guó)2016年全國(guó)耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為28.7%和25.3%。而本研究中，我院6年來(lái)銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南和美羅培南的平均不敏感率分別為10.4%和7.1%。與其他檢測(cè)的大多數(shù)抗生素一樣，我院所分離的銅綠假單胞菌的耐藥率顯著低于全國(guó)耐藥數(shù)據(jù)。其可能原因是由于全國(guó)耐藥數(shù)據(jù)所統(tǒng)計(jì)的大多數(shù)細(xì)菌來(lái)自于全國(guó)三級(jí)甲等以上的醫(yī)院所致。但從不同年份的耐藥情況來(lái)看，碳青霉烯類(lèi)抗生素的耐藥率仍在逐年升高。因此，盡管可能在基層醫(yī)院碳青霉烯的耐藥率較低，但其逐年升高的趨勢(shì)也不容忽視，抗生素合理有效的使用仍應(yīng)引起臨床工作者的足夠重視。

銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素的耐藥機(jī)制較為復(fù)雜，目前報(bào)道的主要包括攜帶碳青霉烯酶，孔蛋白OprD的突變或表達(dá)抑制，以及外排泵系統(tǒng)高表達(dá)［13］。在本研究中，我們只檢測(cè)了碳青霉烯酶的攜帶情況，結(jié)果表明檢測(cè)菌株中主要攜帶IMP和VIM兩種常見(jiàn)的碳青霉烯酶基因，但陽(yáng)性率較低。既往文獻(xiàn)報(bào)道也顯示，與歐美國(guó)家相比，國(guó)內(nèi)流行的銅綠假單胞菌碳青霉烯酶攜帶率較低［7，14］。oprD基因突變和外排泵高表達(dá)是國(guó)內(nèi)菌株耐碳青霉烯的主要機(jī)制［15］。

綜上，本研究調(diào)查了我院2011年至2017年六年中銅綠假單胞菌的總流行情況，分析發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌多來(lái)源于內(nèi)科肺部感染病人，存在A、G、H三種主要型別。細(xì)菌對(duì)碳青霉烯酶類(lèi)抗生素的耐藥率雖逐年升高，但仍低于全國(guó)耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)所提供的數(shù)據(jù)，且細(xì)菌碳青霉烯酶基因攜帶率較低。

（本文圖1，2見(jiàn)插圖5-6）

圖1 銅綠假單胞菌280株ERIC-PCR分型結(jié)果

圖2 銅綠假單胞菌280株ERIC-PCR分型典型電泳圖