趙志新，張思瑾

（商洛學院 生物醫(yī)藥與食品工程學院，陜西商洛726000）

三萜皂苷是植物界中一類重要的次生代謝產(chǎn)物，具有多種生物活性，其可增強植物抗病、抗蟲害的能力，還具有抗炎、抗腫瘤、抗凝血、抗病毒、降低膽固醇、保肝等作用[1]。三萜皂苷合成途徑，其第一步是先通過甲羥戊酸等途徑生成異戊二烯焦磷酸，再經(jīng)過催化酶鯊烯環(huán)氧酶等的催化，生成2,3-氧化鯊烯環(huán)化酶，環(huán)化形成三萜類骨架，然后通過細胞色素p450、糖基轉(zhuǎn)移酶、β-糖苷酶的修飾作用，最后形成糖苷化合物——三萜皂苷[2]。糖基轉(zhuǎn)移酶（GT,Glycosyltransferase）作為三萜皂苷生物合成的最后一步，對其基因的克隆以研究植物抗病機理及藥用植物次生代謝調(diào)控機制目前已深入到了分子水平[3]。糖基轉(zhuǎn)移酶在植物的生長發(fā)育過程和次生代謝調(diào)節(jié)方面起著重要作用[4]，經(jīng)過糖基化修飾的受體分子能改變其在細胞內(nèi)溶解性、穩(wěn)定性和區(qū)域定位等特性，還能調(diào)節(jié)信號傳導、細胞周期、應答反應、蛋白表達調(diào)控和清除細胞[5]。一直以來，對于糖基轉(zhuǎn)移酶的研究多是以擬南芥為材料，近年來雖然有植物糖基轉(zhuǎn)移酶體外生物化學方面的研究，但在糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域和功能關(guān)系方面的研究進展還相對緩慢[6]。本研究利用生物信息學分析工具，首先搜集GenBank中已公布的植物糖基轉(zhuǎn)移酶序列，然后使用生物信息學工具對糖基轉(zhuǎn)移酶序列的保守結(jié)構(gòu)域以及親緣進化關(guān)系進行分析，為以后研究糖基轉(zhuǎn)移酶酶學特征及三萜皂苷代謝提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

首先查找有關(guān)植物GT相關(guān)文獻，然后依據(jù)查找文獻并GenBank搜索，獲得已公布的16種植物GT序列（見表1）。

表1 獲得的具有糖基轉(zhuǎn)移酶的植物

1.2 方法

使用NCBI提供的在線分析工具CDD（Conserved Domain Database,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析蛋白質(zhì)序列保守結(jié)構(gòu)域；使用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，分析所搜集的植物中GT進化關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 保守結(jié)構(gòu)域的預測和分析

圖1為CDD工具顯示紅景天保守結(jié)構(gòu)域結(jié)果；同樣，利用CDD工具對其余15條序列進行保守結(jié)構(gòu)域預測分析，結(jié)果見表2。

圖1 紅景天GT保守結(jié)構(gòu)域分析

從圖1可以看出，紅景天GT氨基酸序列有一個GTB糖基轉(zhuǎn)移酶超家族，有三類不同的保守結(jié)構(gòu)域，分別為活性位點結(jié)構(gòu)域（active site）、底物結(jié)合保守結(jié)構(gòu)域（substrate-binding pocket）和TDP結(jié)合位點結(jié)構(gòu)域（TDP-binding site）。其他植物GT也都屬于GTB超家族（Accession登錄號：Cl10013），具有統(tǒng)計極顯著性（E<8.95×10-49），主要參與催化糖類轉(zhuǎn)移的生物學功能。

表2 糖苷轉(zhuǎn)移酶序列保守結(jié)構(gòu)域

2.2 構(gòu)建糖基轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)進化樹

使用MEGA 6.0軟件對16種植物的GT序列構(gòu)建進化樹，采用不同算法以比較所構(gòu)建樹的差異，進而分析其親緣關(guān)系。

2.2.1 Maximum Likelihood Tree算法構(gòu)建進化樹

依據(jù)Maximum Likelihood Tree算法（圖2），這16種植物的GT序列可以分為三大類，滇牡丹（芍藥科）和蒺藜苜蓿（豆科）為一類；野葛（蝶形花科）、北柴胡（傘形科）、七彩紅竹（禾本科）和薔薇（薔薇科）聚為一類；其余的植物中，花生（豆科）為一個亞類，剩余的紅景天等聚為一個亞類。進化關(guān)系顯示，七彩紅竹（禾本科）和薔薇（薔薇科）、三七（五加科）和黑莓（薔薇科）、桉樹（桃金娘科）和白蘇子（唇形科）、紅景天（景天科）和毛白楊（楊柳科）它們兩兩之間糖基轉(zhuǎn)移酶進化關(guān)系最近。

2.2.2 Neighbor-joining Tree算法構(gòu)建進化樹

使用Neighbor-joining Tree算法構(gòu)建的進化樹顯示（圖3），這16種植物的氨基酸序列明顯地分為三大類，北柴胡（傘形科）、薔薇（薔薇科）、七彩紅竹（禾本科）、紅景天（景天科）、毛白楊（楊柳科）、野葛（蝶形花科）聚為一類；黑莓（薔薇科）、蒺藜苜蓿（豆科）、三七（五加科）、天山雪蓮（菊科）、桉樹（桃金娘科）、白蘇子（唇形科）為一類；花生（豆科）、刺五加（五加科）、滇牡丹（芍藥科）、石榴（石榴科）為一類。其中毛白楊（楊柳科）和野葛（蝶形花科）、薔薇（薔薇科）和北柴胡（傘形科）、滇牡丹（芍藥科）和石榴（石榴科）、桉樹（桃金娘科）和白蘇子（唇形科）、三七（五加科）和天山雪蓮（菊科）、黑莓（薔薇科）和蒺藜苜蓿（豆科）它們兩兩之間糖基轉(zhuǎn)移酶進化關(guān)系最近。

圖2 Maximum Likelihood Tree算法

圖3 Neighbor-joining Tree算法

2.2.3 Maximum Parsimony Tree算法構(gòu)建進化樹

由圖4可以看出，16種植物分為三大類，及野葛（蝶形花科）為一類；薔薇（薔薇科）、七彩紅竹（禾本科）、北柴胡（傘形科）、桉樹（桃金娘科）、黑莓（薔薇科）、蒺藜苜蓿（豆科）為一類；滇牡丹（芍藥科）、石榴（石榴科）、刺五加（五加科）、花生（豆科）、白蘇子（唇形科）、紅景天（景天科）、毛白楊（楊柳科）、天山雪蓮（菊科）、三七（五加科）為一類。薔薇（薔薇科）和七彩紅竹（禾本科）、紅景天（景天科）和毛白楊（楊柳科）、滇牡丹（芍藥科）和石榴（石榴科）它們兩兩之間糖基轉(zhuǎn)移酶進化關(guān)系最近。

綜合比較三種不同算法所構(gòu)建的進化樹，可以明顯看出三種算法所得結(jié)果差異較大，說明這16種植物的糖基轉(zhuǎn)移酶序列總體變異不大，進化上比較保守，以至于不同算法的影響遠大于物種本身的差異。同時也表明算法對進化樹構(gòu)建結(jié)果影響較大，要審慎選擇不同的進化樹構(gòu)建算法。

圖4 Maximum Parsimony Tree(s)算法

3 討論與結(jié)論

糖基轉(zhuǎn)移酶催化的糖基化反應是三萜皂苷生物合成的最后一步，使得單糖與三萜皂苷苷元由糖苷鍵相連。本文通過使用生物信息學方法，顯示16種植物的保守結(jié)構(gòu)域都屬于GTB超家族，主要參與催化糖類轉(zhuǎn)移的生物學功能，表明糖基轉(zhuǎn)移酶的功能結(jié)構(gòu)域具有高度的保守性。進化分析表明，16種植物GT基因大致被分為三類，滇牡丹（芍藥科）和石榴（石榴科）、紅景天（景天科）和毛白楊（楊柳科）、薔薇（薔薇科）和七彩紅竹（禾本科）它們兩兩之間糖基轉(zhuǎn)移酶進化關(guān)系最近，說明GT基因在進化上具有一定的保守性，這與野葛中的研究結(jié)果相類似[7]，同時研究顯示藥用植物中鯊烯環(huán)氧酶進化也比較保守[8]，這與本文研究相一致。同時許多基因組數(shù)據(jù)表明，糖基轉(zhuǎn)移酶基因在進化上不是獨立的，在糖基轉(zhuǎn)移酶基因家族中，旁系同源基因更易被選擇；代謝途徑中存在基因共調(diào)節(jié)和蛋白相互作用；代謝途徑中某些化合物相互排斥；糖基轉(zhuǎn)移酶進化還依賴基因重復，主要是串聯(lián)重復，而不是片段重復[9]。因為酶的功能表現(xiàn)最終是催化代謝反應，對于糧食或藥用植物來說與有效成分的生成或積累相關(guān)，本研究顯示糖基轉(zhuǎn)移酶在保守結(jié)構(gòu)域和進化中都顯示較高的保守性，因此建議下一步研究與糖基轉(zhuǎn)移酶表達相關(guān)的三萜皂苷產(chǎn)物是否也有類似的特性，以指導人們開發(fā)和利用相近的植物資源。本文對糖基轉(zhuǎn)移酶的生物信息學分析，可為以后研究GT酶學特征及三萜皂苷代謝提供幫助。