明建松 ，王曉雪 ，楊夢(mèng)晨 ，湯 可 ，袁玉華

（1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津300052；2.天津港口醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津300456）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種常見(jiàn)的慢性并累及多個(gè)關(guān)節(jié)的自身免疫性疾病，它的發(fā)病機(jī)理是一種涉及到多種細(xì)胞、細(xì)胞因子和免疫活性物質(zhì)的復(fù)雜過(guò)程，其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。近幾年發(fā)現(xiàn)microRNA參與免疫應(yīng)答反應(yīng)，可能在RA的疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-145-5p在RA中與對(duì)照組骨關(guān)節(jié)炎（OA）滑膜組織和滑膜細(xì)胞相比，在RA外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）、滑膜組織和成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞（FLS）中miR-145-5p水平顯著增加[1]。通過(guò)調(diào)節(jié)ADAM17的表達(dá)，miR-145-5p調(diào)節(jié)RA-FLS的增殖、細(xì)胞周期進(jìn)程和炎性細(xì)胞因子的表達(dá)；通過(guò)下調(diào)Ets-1，miR-145-5p模擬上調(diào)IL-17水平和基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-3，MMP-9和MMP-13的表達(dá)?，F(xiàn)結(jié)合膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎CIA小鼠模型，增強(qiáng)miR-145-5p表達(dá)，觀察CIA小鼠關(guān)節(jié)變化情況，分析miR-145-5p在CIA中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 DBA/1小鼠36只，雄性，8周齡左右，SPF（Specefic Pathogen Free，無(wú)特定病原體）級(jí)，體質(zhì)量（20±2）g，由北京華阜康公司提供，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水、飲食，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物于天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院飼養(yǎng)。本研究經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物護(hù)理與使用委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑 牛Ⅱ型膠原（液）及弗氏完全佐劑購(gòu)于美國(guó)chondrex公司，agomiR-145-5p購(gòu)于中國(guó)廣東Ribobio公司，小鼠麻醉劑水合氯醛購(gòu)于美國(guó)sigma公司。將凍干的牛II型膠原蛋白在4℃下在0.05 mol/L乙酸中過(guò)夜溶解，在弗氏完全佐劑中乳化至最終濃度為2 mg/mL。

1.3 CIA小鼠模型建立 取36只8周齡，雄性DBA/1小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)2～3 d之后，隨機(jī)分組選出10只小鼠作為miRNA陰性對(duì)照（miR-NC）組，其余作為模型構(gòu)建組，進(jìn)行初次免疫。按照每只100 μL牛Ⅱ型膠原進(jìn)行根部皮下注射，注射部位為距尾根部2 cm至0.5 cm區(qū)間，miR-NC組按同樣方法注射等體積的生理鹽水。初次免疫21 d后，進(jìn)行加強(qiáng)免疫，模型構(gòu)建組每只小鼠腹腔注射100 μL牛Ⅱ型膠原，miR-NC組同樣方法注射等體積生理鹽水。

1.4 成模小鼠免疫及分組給藥 加強(qiáng)免疫后，每天觀察記錄小鼠精神狀態(tài)及關(guān)節(jié)腫脹情況，篩選出發(fā)病時(shí)間相近的關(guān)節(jié)炎指數(shù)大于4分的發(fā)病小鼠20只，隨機(jī)分為agomiR-145-5p組及agomiR空載體（agomiR-NC）組，每組10只，在初次免疫后第30天將等體積的agomiR-145-5p和agomiR-NC進(jìn)行鼠尾靜脈注射，之后每隔3 d注射1次，共進(jìn)行3周。

1.5 關(guān)節(jié)評(píng)分觀察及CIA小鼠足跖腫脹程度比較 加強(qiáng)免疫后，隔天觀察誘導(dǎo)小鼠關(guān)節(jié)腫脹情況；于小鼠分組治療后，每天進(jìn)行關(guān)節(jié)炎評(píng)分，記錄關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI），相加得總評(píng)分[2]。

1.6 micro-CT掃描 小鼠膝關(guān)節(jié)和踝關(guān)節(jié)在固定后進(jìn)行micro-CT掃描重建。

1.7 病理分析及免疫組化檢測(cè) 用10%水合氯醛（0.04 mL/10 g）麻醉小鼠后，處死所有小鼠。取小鼠踝關(guān)節(jié)進(jìn)行固定、脫水、透明，并用石蠟包埋切片，進(jìn)行HE染色，鏡下觀察小鼠關(guān)節(jié)病變情況。通過(guò)對(duì)小鼠踝關(guān)節(jié)組織切片進(jìn)行免疫組化染色，檢測(cè)MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13、IL-17和 ADAM17 的表達(dá)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用±s表示，采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型建立及關(guān)節(jié)炎評(píng)分指數(shù)變化情況 對(duì)DBA/1建模，約85%小鼠成功建立CIA模型，足部出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎癥狀。對(duì)小鼠四肢進(jìn)行評(píng)分記和。與agomiR-NC組比較，agomiR-145-5p組的小鼠在給藥后第4天關(guān)節(jié)炎評(píng)分指數(shù)開(kāi)始相對(duì)下降（P＜0.05）（圖 1）。

2.2 小鼠足部變化 miR-NC組小鼠足部呈正常粉紅色，足掌、踝、掌指及指關(guān)節(jié)均無(wú)腫脹。發(fā)病小鼠足掌增厚、多關(guān)節(jié)紅腫，行走不便，急性期受累足不能負(fù)重。膠原誘導(dǎo)成功小鼠足厚度、足體積較miR-NC組小鼠高。agomiR-145-5p治療后部分減輕了小鼠足部的腫脹和發(fā)紅（圖2）。

圖1 CIA小鼠的關(guān)節(jié)炎評(píng)分Fig 1 Arthritis scores for CIA mice

圖2 注射前后CIA小鼠的后爪Fig 2 Hind paws of CIA mice before and after injection

2.3 HE染色觀察miR-145-5p對(duì)CIA小鼠關(guān)節(jié)軟骨損傷的治療效果 HE染色結(jié)果如圖3所示，與miR-NC組比較，agomiR-145-5p組小鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織明顯增生肥厚，滑膜周圍結(jié)締組織中有大量淋巴細(xì)胞和少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，有豐富的血管翳形成，關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨侵蝕破壞嚴(yán)重。與agomiR-NC組比較，agomiR-145-5p組滑膜增生顯著降低，骨破壞顯著增強(qiáng)（P＜0.05）（圖 4）。

圖3 來(lái)自CIA小鼠后爪切片的HE染色Fig 3 Hematoxylin and eosin staining of sections from the hind paws of CIA mice

圖4 CIA小鼠的組織病理學(xué)評(píng)分Fig 4 Histopathological scores of CIA mice

2.4 micro-CT掃描評(píng)價(jià)miR-145-5p治療對(duì)CIA小鼠關(guān)節(jié)損傷的影響 與miR-NC組比較，agomiR-145-5p組與agomiR-NC組都表現(xiàn)出踝關(guān)節(jié)的骨侵蝕；與agomiR-NC組相比較，agomiR-145-5p組骨侵蝕更嚴(yán)重（圖5）。

圖5 骨破壞的比較Fig 5 Comparison of bone destruction

2.5 免疫組化檢測(cè) 與agomiR-NC組相比較，agomiR-145-5p組小鼠的后踝中MMP-3，MMP-9，MMP-13和IL-17蛋白水平增加，MMP-1水平?jīng)]有差異，ADAM17蛋白減少（圖6）。

圖6 CIA小鼠的MMP-1，MMP-3，MMP-9，MMP-13，IL-17和ADAM17的免疫組化檢測(cè)Fig 6 Immunohistochemistry （IHC）and quantification of MMP-1,MMP-3,MMP-9,MMP-13,IL-17,and ADAM17in CIA mice

3 討論

為進(jìn)一步明確miR-145-5p在RA關(guān)節(jié)軟骨損傷中的作用，本實(shí)驗(yàn)選用造模成功率高的DBA/1小鼠，通過(guò)II型膠原和完全弗氏佐劑混合尾根部皮下注射的方法制備CIA小鼠模型，初次免疫后4周，小鼠出現(xiàn)足爪紅腫、活動(dòng)受限等RA相關(guān)癥狀，由此可見(jiàn)本實(shí)驗(yàn)所建立的CIA模型是成功的。通過(guò)關(guān)節(jié)評(píng)分、micro-CT分析、病理分析及免疫組化檢測(cè)等相關(guān)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-145-5p加重關(guān)節(jié)破壞的同時(shí)部分抑制了CIA小鼠的關(guān)節(jié)炎癥，同時(shí)發(fā)現(xiàn)與agomiR-NC組相比較，agomiR-145-5p組小鼠的后踝中 MMP-3，MMP-9，MMP-13 和 IL-17 蛋白水平升高，MMP-1水平?jīng)]有差異，ADAM17蛋白水平降低。

ADAM17是一種TNF-轉(zhuǎn)換酶，被鑒定為切割TNF-α前結(jié)構(gòu)域的酶，并且被認(rèn)為是在炎癥反應(yīng)期間負(fù)責(zé)釋放TNF-α的主要蛋白酶[3]。另外，據(jù)報(bào)道ADAM17通過(guò)激活EGFR/PI3K/AKT途徑促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[4]。本實(shí)驗(yàn)相關(guān)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)ADAM17促進(jìn)FLS增殖并且還表明ADAM17減少RA-FLS中的TNF-α產(chǎn)生。此外，敲減ADAM17減少TNF-α產(chǎn)生并增加miR-145-5p以及IL-17和MMPs的表達(dá)，這可能表現(xiàn)為miR-145/ADAM17/TNF-α的反饋環(huán)。據(jù)報(bào)道，F(xiàn)LT1，TLR4，TGFB2和APRIL分別與炎癥反應(yīng)有關(guān)，涉及RA中的細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和血管生成[5-8]。今后需要進(jìn)一步研究miR-145-5p是否可以 直 接 降 低 ADAM17，F(xiàn)LT1，TLR4，TGFB2 和APRIL的表達(dá)，從而抑制炎癥反應(yīng)。

IL-17主要由Th17細(xì)胞釋放，Th17細(xì)胞是一種特殊類型的人類輔助性T細(xì)胞[9]。這種細(xì)胞因子在炎癥和包括RA在內(nèi)的自身免疫性疾病的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[10]。研究表明，IL-17誘導(dǎo)RA中MMP-3，MMP-9和MMP-13的產(chǎn)生[11-12]。眾所周知，RA患者的骨和軟骨破壞部分由MMP活化的滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞構(gòu)成[13]。此外，Ets-1被報(bào)道為T(mén)h17分化的負(fù)調(diào)節(jié)因子。miR-145過(guò)表達(dá)導(dǎo)致RA-FLS中IL-17，MMP-3，MMP-9 和 MMP-13 水平升高與Ets-1水平降低的相關(guān)性，以及RA-FLS中Ets-1調(diào)節(jié)IL-17的機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

即使CIA小鼠模型中關(guān)節(jié)炎癥被部分抑制，施用miR-145-5p也會(huì)加重骨破壞，說(shuō)明miR-145-5p可能調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路，例如miR-146a和miR-155與炎癥反應(yīng)和RA疾病呈正相關(guān)，但在關(guān)節(jié)破壞中起負(fù)面作用[14-15]。這項(xiàng)研究證實(shí)了RA中miR-145-5p介導(dǎo)的基因調(diào)節(jié)的復(fù)雜性，為后續(xù)研究提供了參考。