劉麗娟 陳金之 張志軍 姜梅杰,*

(1 萊蕪市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，萊蕪 271100；2 泰安市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，泰安 271000；3 泰安市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，泰安 271000)

鮑曼不動(dòng)桿菌已成為院內(nèi)感染的重要病原菌之一。2012—2016年非發(fā)酵糖革蘭陰性菌中，鮑曼不動(dòng)桿菌分離率一直位居第一位[1-5]。Ying等[6]報(bào)道華南7個(gè)地區(qū)146株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌，主要是ST208，其次是ST191和ST729。Li等[7]報(bào)道17株MDRAB和35株XDRAB中，ST195可能是中國(guó)廣州最常見(jiàn)的ST。Ning等[8]報(bào)道2009年6月—2014年11月中國(guó)北京101株MDRAB中，主要是ST191和ST195。因此不同地區(qū)、甚至不同醫(yī)院分離MDRAB主要流行的序列類(lèi)型及耐藥性基因也不完全相同。為探明MDRAB在醫(yī)院內(nèi)傳播的原因，預(yù)防MDRAB在醫(yī)院內(nèi)發(fā)生克隆株流行，我們對(duì)該院4年間MDRAB分子流行病學(xué)特征進(jìn)行了研究。

1 資料與方法

1.1 菌株來(lái)源

收集2013—2016年間萊蕪市人民醫(yī)院住院患者標(biāo)本中分離出的51株MDRAB，其中34株來(lái)自重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)的患者，10株來(lái)自神經(jīng)外科病房的患者，7株來(lái)自神經(jīng)內(nèi)科病房的患者。50株標(biāo)本來(lái)源于痰液，1株來(lái)源于尿液。

1.2 細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)

采用BD鳳凰phoenixTM100 NMIC/ID-4復(fù)合板鑒定菌種及藥敏試驗(yàn)，同時(shí)用K-B紙片擴(kuò)散法檢測(cè)頭孢哌酮/舒巴坦和米諾環(huán)素的敏感性，藥敏試驗(yàn)執(zhí)行最新版的美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究協(xié)會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)。其中替加環(huán)素敏感性試驗(yàn)執(zhí)行FDA的標(biāo)準(zhǔn)，頭孢哌酮/舒巴坦敏感性試驗(yàn)執(zhí)行CLSI中頭孢哌酮的標(biāo)準(zhǔn)。MH瓊脂和藥敏紙片均為英國(guó)Oxoid產(chǎn)品。MDRAB的判斷標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)Magiorakos等[9]報(bào)道的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。銅綠假單胞菌ATCC27853、大腸埃希菌ATCC25922、大腸埃希菌ATCC35218作為質(zhì)控菌株。

1.3 耐藥基因檢測(cè)

采用煮沸法提取細(xì)菌DNA模板，碳青霉烯酶類(lèi)相關(guān)耐藥基因采用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)方法。PCR反應(yīng)體積為50μL，含H2O 31.75μL，10×PCR緩沖液5μL，dNTPs MIX(10mmol/L) 4μL，正反向引物各2μL，1.25UTap酶，10～100ng DNA模板5μL。PCR擴(kuò)增儀使用MJ-PTC-100(BIO-RAD)。退火溫度參照文獻(xiàn)[10]。碳青霉烯酶類(lèi)相關(guān)耐藥基因引物參照文獻(xiàn)文獻(xiàn)[10]，blaNDM-1基因PCR擴(kuò)增引物序列參照中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所公布的引物序列。

1.4 多位點(diǎn)序列(MLST)基因分型

參照Bartual等[11]方法進(jìn)行檢測(cè)分析。對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的7個(gè)管家基因進(jìn)行序列擴(kuò)增并測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在鮑曼不動(dòng)桿菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pubmlst.org/abauniannii/)中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，得到每個(gè)管家基因?qū)?yīng)的等位基因編號(hào)。然后將gltA-gyrB-gdhBrecA-cpn60-gpi-rpoD這一組管家基因編號(hào)的組合稱(chēng)為管家基因譜，每一個(gè)編號(hào)的組合對(duì)應(yīng)一個(gè)序列型(sequence type,ST)。與MLST數(shù)據(jù)庫(kù)中已有管家基因譜進(jìn)行比對(duì)，得到每株細(xì)菌對(duì)應(yīng)的ST型。

1.5 DNA測(cè)序

隨機(jī)取不同MLST的陽(yáng)性基因進(jìn)行測(cè)序，PCR產(chǎn)物送上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序(ABI3730XL全自動(dòng)DNA測(cè)序儀)，測(cè)序結(jié)果在GenBank網(wǎng)上查詢(xún)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

用WHONET5.6軟件對(duì)臨床分離的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行篩選,所有篩選出的菌株數(shù)據(jù)用WHONET5.6軟件進(jìn)行耐藥性分析。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

51株MDRAB對(duì)哌拉西林、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/三唑巴坦、復(fù)方磺胺甲噁唑、四環(huán)素、左氧氟沙星和環(huán)丙沙星耐藥率為100%(51/51)；對(duì)美羅培南和亞胺培南的耐藥率為94.1%(48/51)；對(duì)阿米卡星和慶大霉素的耐藥率分別為84.3%(43/51)和90.2%(46/51)；對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦和米諾環(huán)素的耐藥率分別為62.7%(32/51)和23.5%(12/51)；對(duì)多黏菌素B 100%敏感。

2.2 碳青霉烯酶相關(guān)耐藥基因檢測(cè)及測(cè)序結(jié)果

51株MDRAB中，blaOXA51基因都陽(yáng)性(圖1)，48株(94.12%)blaOXA23組基因陽(yáng)性(圖2)。隨機(jī)取不同MLSTblaOXA51陽(yáng)性基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果均為blaOXA51型碳青霉烯酶基因(圖3)。隨機(jī)取不同MLSTblaOXA23組陽(yáng)性基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果均為OXA23型碳青霉烯酶基因(圖4)。未檢出blaIMP、blaKPC、blaNDM-1、blaOXA-24、blaOXA-48、blaOXA-50、blaOXA-55、blaOXA-58和blaOXA-60碳青霉烯酶基因。

2.3 MLST分子分型結(jié)果

將51株MDRAB進(jìn)行MLST分子分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有3種STs，依次為ST191(52.94%)、ST208(31.37%)和ST136(15.69%)，均屬于克隆復(fù)合體CC92。本文收集的樣本中，序列型ST191和ST208是主要的序列類(lèi)型，其次是ST136。4年間ST208在醫(yī)院內(nèi)持續(xù)性的播散，ST191和 ST136在不同時(shí)間段間斷性的播散在該醫(yī)院4年間51株MDRAB 3種STs分型結(jié)果及碳青霉烯酶陽(yáng)性基因的分布情況見(jiàn)表1。

3 討論

鮑曼不動(dòng)桿菌是院內(nèi)常見(jiàn)的非發(fā)酵革蘭陰性菌之一。已有報(bào)道多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌主要引起下呼吸道感染[12]，主要分布在重癥監(jiān)護(hù)病房[13-14]。該院2013—2016年間臨床分離的51株MDRAB中，50株標(biāo)本來(lái)源于患者的痰液，34株標(biāo)本來(lái)源于重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)，說(shuō)明MDRAB主要引起呼吸道感染并且分布在ICU患者。

圖1 blaOXA51基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 blaOXA51 genes PCR results electropherogram

圖2 blaOXA23基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 blaOXA23 genes PCR results electropherogram

圖3 blaOXA51基因測(cè)序圖Fig.3 blaOXA51 genes sequencing diagram

圖4 blaOXA51基因測(cè)序圖Fig.4 blaOXA23 genes sequencing diagram

已有報(bào)道鮑曼不動(dòng)桿菌攜帶blaOXA-23型碳青霉烯酶與碳青霉烯類(lèi)耐藥相關(guān)[15-17]。本研究51株MDRAB均攜帶blaOXA-51型碳青霉烯酶基因，48株攜帶blaOXA-23型碳青霉烯酶基因的MDRAB對(duì)亞胺培南和美羅培南都耐藥，3株未檢出blaOXA-23型碳青霉烯酶基因的MDRAB對(duì)亞胺培南和美羅培南都敏感，對(duì)頭孢吡肟、頭孢他啶、頭孢塞肟、哌拉西林、哌拉西林/三唑巴坦都耐藥，說(shuō)明blaOXA-23型碳青霉烯酶與亞胺培南和美羅培南耐藥密切相關(guān)，這與有關(guān)報(bào)道相一致[15-17]。

不同地區(qū)院內(nèi)分離的MDRAB主要流行的序列類(lèi)型及耐藥性基因也不完全相同[6-8]。本研究分析發(fā)現(xiàn)，在收集的樣本中，序列類(lèi)型ST191(52.94%)和T208(31.37%)是主要的序列類(lèi)型，其次是ST136(15.69%)，均屬于全球流行的CC92克隆群，其祖先ST型為ST92，與國(guó)內(nèi)外的研究類(lèi)似[18-19]。雖然CC92克隆復(fù)合體在全球流行，但不同地區(qū)的流行株仍各有其特點(diǎn)，這可能不同地區(qū)的抗生素使用習(xí)慣等環(huán)境選擇壓力影響ST92的遺傳方向而造成的后果。表1顯示，該院4年間ST208型產(chǎn)blaOXA-23型酶基因的MDRAB在院內(nèi)持續(xù)性的播散，ST191型MDRAB在2013年、2014年和2015年檢出，但在2016年篩選出的12株MDRAB中未檢出ST191型MDRAB，說(shuō)明該院ST191型MDRAB在院內(nèi)可能存在間斷性的播散。我們的研究?jī)H在2016年篩選出的12株MDRAB中檢出了ST136型產(chǎn)blaOXA-23型酶基因的MDRAB，在2016年未檢出ST191型MDRAB，說(shuō)明該院MDRAB流行菌株可能有變化。本研究發(fā)現(xiàn)該院發(fā)生過(guò)克隆株的流行。因此醫(yī)院感染控制部門(mén)要進(jìn)一步關(guān)注醫(yī)院內(nèi)耐藥菌的傳播，這對(duì)醫(yī)院感染控制是非常有幫助的。

表1 51株MDRAB STs分布及碳青霉烯酶陽(yáng)性基因分布情況Tab.1 Distribution of fifty-one MDRAB STs strains and carbapenem positive gene

本研究51株MDRAB中，有3株對(duì)亞胺培南和美羅培南敏感(這3株是ST191型未檢出blaOXA-23型酶基因的MDRAB)，其余48株耐藥。1株對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦敏感、18株中介、32株耐藥，27株對(duì)米諾環(huán)素敏感、12株中介、12株耐藥，對(duì)多黏菌素B都敏感，對(duì)頭孢他啶等10種抗菌藥物都耐藥。因此臨床醫(yī)師治療MDRAB引起的感染必須根據(jù)藥敏結(jié)果選用抗菌藥物。

綜上所述，該院臨床4年間分離的MDRAB存在克隆株的流行，醫(yī)院應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)消毒隔離措施，防止院內(nèi)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的暴發(fā)流行。