楊康卓，趙 東，鄭 佳，張建敏，劉 芳

（宜賓五糧液股份有限公司技術(shù)研究中心，四川宜賓644007）

大曲是白酒發(fā)酵的糖化劑和發(fā)酵劑，同時(shí)，培曲過程中由于微生物代謝產(chǎn)生的大量風(fēng)味物質(zhì)及相關(guān)前體物質(zhì)在拌和酒醅、發(fā)酵過程中直接或間接進(jìn)入酒醅，經(jīng)酒醅發(fā)酵、蒸餾后會(huì)顯著影響產(chǎn)品的香味風(fēng)格特征，因此大曲也是一種生香劑[1]。五糧液生產(chǎn)使用的“包包曲”，屬濃香型大曲，按品溫來劃分則為中偏高溫大曲。它是以粉碎的純小麥為原料，壓制成帶有鼓包形狀的磚塊狀曲坯，在一定溫度及濕度條件下發(fā)酵而成的，具有獨(dú)特的香氣特征[2]。

固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(SPME-GC/MS)是目前研究大曲揮發(fā)性組分的最常用的方法。范文來等[3]在濃香型大曲中檢出了112種微量揮發(fā)性組分；陳勇等[4]在瀘州老窖高溫大曲中檢出了34種揮發(fā)性組分；趙東等[5]從五糧液包包曲中定性出68種揮發(fā)性成分，主要以雜環(huán)類化合物為主。但是，由于包包曲制曲過程是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，制曲過程中香氣成分往往隨著微生物群落結(jié)構(gòu)的演替而發(fā)生顯著的變化，因此，研究發(fā)酵過程曲坯中香氣成分的變遷規(guī)律對(duì)調(diào)節(jié)工藝參數(shù)、改善曲塊質(zhì)量具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

本研究利用SPME-GC/MS技術(shù)分析了包包曲發(fā)酵過程中的揮發(fā)性成分，結(jié)合質(zhì)譜匹配度、保留指數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)等進(jìn)行成分的定性，獲得了較為全面的五糧液“包包曲”揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫，為大曲質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立和探討大曲對(duì)酒質(zhì)的影響提供了數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集

包包曲樣品采集自五糧液股份有限公司制曲車間，分別取發(fā)酵期為0 d、3 d、7 d、14 d、30 d(即發(fā)酵完成后出房的成品曲)的大曲樣品。所有樣品在實(shí)驗(yàn)室粉碎混勻，制成曲粉于-20℃下保存。

1.1.2 試劑和儀器

C7—C30直鏈正構(gòu)烷烴、3-甲基-3-己醇、3-苯基-2-丁烯醛、萘、2-甲基吡嗪，購自美國Sigma-Aldrich公司。(E)-2-庚烯醛、(E,E)-2,4-己二烯醛、(E)-2-辛烯醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛,(E)-2-壬烯醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、己醛、壬醛、癸醛、乙酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、(E)-2-己烯酸己酯、辛酸乙酯、壬酸乙酯、己酸己酯、癸酸乙酯、琥珀酸乙酯、十一酸乙酯、月桂酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、十五烷酸乙酯、棕櫚酸乙酯、十七酸乙酯、硬脂酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯、4-辛酮、乙偶姻、異丁醇、異戊醇、己醇、1-辛烯-3-醇、庚醇、正辛醇、2,4-己二烯-1-醇,苯甲醛、苯乙醛、苯甲酸乙酯、苯乙酸甲酯、苯乙酸乙酯、愈創(chuàng)木酚、苯丙酸乙酯、苯乙醇、3-苯基-2-丁烯醛、苯酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、四甲基吡嗪、2-戊基呋喃、糠醛、糠醇、β-石竹烯、乙酸、己酸、γ-丁內(nèi)酯、γ-己內(nèi)酯、γ-壬內(nèi)酯，購自TCI(上海)公司。

固相微萃取手柄和50 μm CAR/DVB/PDMS纖維萃取頭，購自美國Supelco公司。氣質(zhì)聯(lián)用儀為7890B-977B，購自美國Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 萃取頭老化

各類型萃取頭在首次使用之前均需要在熱條件下老化，老化程序參考Supelco配件盒內(nèi)老化指南。

1.2.2 萃取條件

稱取1 g大曲粉于20 mL頂空樣品瓶中，置于60℃水浴中平衡15 min，插入萃取頭吸附揮發(fā)性成分40 min，隨后插入GC進(jìn)樣口熱解析3 min，分析其中揮發(fā)性成分。

1.3 GC-MS條件

利用配備了極性色譜柱DB-WAX(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm)的GC-MS分析包包曲粉中的揮發(fā)性成分。

氣相色譜條件：進(jìn)樣口溫度250℃，載氣(He)流速1 mL/min，不分流模式進(jìn)樣；氣相色譜升溫程序：起始爐溫40℃，保持5 min，以4℃/min升至230℃，保持15 min。

質(zhì)譜條件：質(zhì)譜EI源，電子轟擊能量70 eV；離子源溫度200℃，四級(jí)桿溫度150℃，質(zhì)量數(shù)掃描范圍35～350 amu。

1.4 物質(zhì)鑒定

揮發(fā)性成分的鑒定采用參考文獻(xiàn)[6]的方法：即先將化合物與NIST08標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，匹配度＞800(最大值1000)，作為初步定性結(jié)果；再計(jì)算各物質(zhì)的Kovats保留指數(shù)(RI)[7]，并與文獻(xiàn)報(bào)道的保留指數(shù)值進(jìn)行比較。同時(shí)，與標(biāo)準(zhǔn)品在相同色譜條件下的保留時(shí)間對(duì)比，最終確定該物質(zhì)的歸屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵時(shí)期包包曲揮發(fā)性成分總離子流圖（見圖1）

本研究分析了包包曲發(fā)酵過程中的揮發(fā)性成分（圖1），共鑒定出137種揮發(fā)性成分，其中醛類19種、酯類40種、酮類8種、醇類15種、芳香族22種、吡嗪類12種、呋喃類7種、酸類3種、內(nèi)酯類3種、萜烯6種、其他物質(zhì)2種。

2.2 醛類（表1）

由表1所示，共檢出醛類化合物19種，其中不飽和醛最多(14種)，其次為直鏈飽和醛(4種)和支鏈飽和醛(1種)。

不飽和醛包括(E)-2-丁烯醛、2-甲基-戊烯醛、3-甲基-2-丁烯醛、2-乙烯基-2-丁烯醛、(E)-2-庚烯醛、(E,E)-2,4-己二烯醛、(E)-2-辛烯醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、2,4,6-辛三烯醛、(E)-2-壬烯醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、2-十一烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、5-乙基-1-環(huán)戊烯基-1-甲醛。其中，3-甲基-2-丁烯醛、2-乙烯基-2-丁烯醛、2-十一烯醛、2,4,6-辛三烯醛屬首次在濃香型大曲中檢出。

單不飽和醛多具有類似青草、蘑菇味，如(Z)-2-庚烯醛、(E)-2-辛烯醛具有顯著的蘑菇味、霉味，可能與包包曲驗(yàn)收過程中所謂的“菌香”有一定關(guān)聯(lián)性。多不飽和醛類(E,E)-2,4-壬二烯醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛，表現(xiàn)為典型的油脂與青草復(fù)合香氣。

直鏈飽和醛包括乙醛、己醛、壬醛、癸醛。這4種直鏈飽和醛在大曲發(fā)酵過程和成品中都能檢出。乙醛極易揮發(fā)，具有刺激性氣味。己醛具有顯著的青草味，氣味閾值為17 μg/L。壬醛和癸醛具有醛香味，氣味閾值分別為1 μg/L和6 μg/L。此外，這些直鏈飽和醛也在濃香型白酒中被全部檢出。

支鏈飽和醛僅有甲硫基丙醛1種。甲硫基丙醛呈現(xiàn)強(qiáng)烈的洋蔥味和肉腥味，其僅在大曲發(fā)酵的前期過程中發(fā)現(xiàn)，成品大曲中沒有檢出。

圖1 不同發(fā)酵時(shí)期包包曲揮發(fā)性成分總離子流圖

2.3 酯類（表2）

如表2所示，共檢出酯類化合物共40種，其中直鏈飽和酯最多(21種)，其次為不飽和酯(11種)和支鏈飽和酯(8種)。

表1 大曲中醛類化合物

9-壬酮酸乙酯、2-羥基-4-甲基戊酸乙酯、甲氧基乙酸異戊酯、12-甲基-十三烷酸甲酯、13-甲基十四烷酸乙酯、15-甲基-棕櫚酸乙酯、(E)-2-己烯酸己酯、12,15-辛二烯酸甲酯、(3E)-3-壬烯酸乙酯、肉豆蔻烯酸乙酯、(Z)-9-十五烯酸乙酯、9,12-十六碳二烯酸乙酯、(Z)-9-十七烯酸乙酯等13種酯類在濃香型大曲揮發(fā)性物質(zhì)的研究中首次發(fā)現(xiàn)。

表2 大曲中酯類化合物

飽和酯類多呈現(xiàn)水果味，且大部分在濃香型白酒中已經(jīng)被檢出。而不飽和酯類物質(zhì)對(duì)于大曲香味的貢獻(xiàn)還不清楚，需以后進(jìn)一步探討。

2.4 酮類（表3）

如表3所示，共檢出酮類化合物8種，其中飽和酮4種，不飽和酮2種，環(huán)酮1種，羥酮1種。

在本次研究中，飽和酮2-辛酮、2-十一烷酮和不飽和酮6-甲基-5-庚烯-2-酮、乙偶姻在濃香型白酒中均有檢出。而(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮是首次在濃香型大曲中發(fā)現(xiàn)，其呈現(xiàn)辛辣味道，氣味閾值為150 μg/L。

2.5 醇類（表4）

如表4所示，共檢出15種醇類化合物，其中不飽和醇5種，直鏈醇3種，支鏈醇3種，環(huán)狀醇2種和多元醇2種。

本次研究中有8種醇類物質(zhì)在中高溫大曲中均有檢出，且異戊醇、正己醇的含量在醇類中最高[20]。3-甲基-2-丁烯-1-醇具有典型的金屬味、酚味，其在發(fā)酵前期含量較高，直至發(fā)酵結(jié)束時(shí)逐漸減少，說明其可能是大曲發(fā)酵中的一種過程產(chǎn)物[15]。1-辛烯-3-醇具有強(qiáng)烈的蘑菇味和土腥味，閾值為2.7 μg/L。(E)-2-壬烯-1-醇、2,4-己二烯-1-醇分別呈現(xiàn)脂肪味和新鮮蔬菜味，此前在其他濃香型大曲揮發(fā)性物質(zhì)研究中也有檢出。

2,3-丁二醇在濃香型白酒和大曲中均有發(fā)現(xiàn)，主要呈現(xiàn)黃油和奶油的香氣。本次研究定性了2,3-丁二醇的兩種異構(gòu)體([R-(R*,R*)]-2,3-丁二醇、[S-(R*,R*)]-2,3-丁二醇)，而兩種異構(gòu)體對(duì)大曲香氣的影響還沒有相關(guān)報(bào)道，需進(jìn)一步探討。

2.6 芳香族類（表5）

表3 大曲中酮類化合物

表4 大曲中醇類化合物

如表5所示，本次研究共檢出22種芳香族化合物，其中芳香酯類5種，芳香醇類4種，芳香醛類3種，酚類4種，萘類2種，烷基苯類2種，噻唑類2種。其中3-苯基-2-丁烯醛、1,5-二甲基萘、2-苯基-1-丁醇、1-甲基-3苯基丙烯醇是首次在濃香型大曲中發(fā)現(xiàn)，其他大部分物質(zhì)在濃香型大曲[3，14，21]和白酒[13，22]中均有檢出。

芳香族化合物多數(shù)具有花香、甜香味。其中苯乙醇、愈創(chuàng)木酚被認(rèn)為是優(yōu)質(zhì)濃香型大曲的主要香味成分，而苯甲醛、苯甲醇為優(yōu)質(zhì)濃香型大曲香味體系的組成部分[24]。酚類物質(zhì)具有特殊氣味，其中苯酚呈現(xiàn)為一種刺激性氣味，4-乙基愈創(chuàng)木酚呈現(xiàn)為辛辣味和藥味，2-乙烯基愈創(chuàng)木酚呈現(xiàn)為木材味和煙熏味，它們的氣味閾值分別為5.5 mg/L、25 μg/L、3 μg/L。

表5 大曲中芳香族類化合物

表6 大曲中吡嗪類化合物

2.7 吡嗪類物質(zhì)（表6）

如表6所示，本次研究共檢出12種吡嗪類化合物,均在濃香型白酒中檢出。此次研究中檢出的吡嗪類化合物多呈現(xiàn)出堅(jiān)果味、烘培味、巧克力味，其主要在大曲發(fā)酵過程后期(降溫期)產(chǎn)生[24]，與高溫下的美拉德反應(yīng)和微生物代謝合成作用有關(guān)。2,5-二甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪被認(rèn)為是中高溫曲中的重要香氣物質(zhì)[21]，氣味閾值分別為800 μg/L和200 μg/L。

2.8 呋喃類化合物（表7）

如表7所示，本次研究共檢出7種呋喃類化合物。2-戊基呋喃、糠醛、糠醇是重要的呋喃類化合物，在白酒中已經(jīng)檢測到[13]。2-戊基呋喃呈青豆味、金屬味，糠醛呈面包味、霉味，糠醇呈水果味，它們的氣體閾值分別為6 μg/L、3 mg/L、2 mg/L。有研究表明，2-戊基呋喃、糠醛在發(fā)酵的升溫階段是主要的化合物，有很高的濃度[24]。

2.9 萜烯類化合物（表8）

表7 大曲中呋喃類化合物

表8 大曲中萜烯類化合物

表9 大曲中酸類、內(nèi)酯類化合物

本研究中共檢出6種萜烯類化合物（表8），其中α-古云烯、長葉烯、順-羅漢柏烯、韋得醇這4種化合物是首次在濃香型大曲中發(fā)現(xiàn)。α-古云烯在是芒果揮發(fā)油的主要成分[25]，且有研究表明含α-古云烯的揮發(fā)油有鎮(zhèn)靜效果[26]。γ-欖香烯在溫莪術(shù)的揮發(fā)油中被分離出來，具有抗癌活性[27]。β-石竹烯呈現(xiàn)木材味、丁香味，在其他大曲揮發(fā)性物質(zhì)的研究中也有發(fā)現(xiàn)，具有治療結(jié)腸炎、鎮(zhèn)咳等作用[28]。

2.10 酸類、內(nèi)酯類化合物（表9）

由表9所示，本研究一共發(fā)現(xiàn)了3種酸類化合物、3種內(nèi)酯類化合物。

乙酸呈醋味、酸味，己酸呈汗臭味。γ-丁內(nèi)酯、γ-己內(nèi)酯、γ-壬內(nèi)酯主要呈甜香味、奶香味。這5種化合物均在濃香型白酒中檢出。

2.11 其他類化合物（表10）

由表10所示，本次研究中還發(fā)現(xiàn)了1種烴類化合物、1種雜環(huán)類化合物。其中2-乙酰吡咯具有堅(jiān)果味，但閾值較高。

表10 大曲中其他類化合物

3 結(jié)論

本次研究利用HS-SPME-GC-MS技術(shù)從五糧液包包曲中共檢測出揮發(fā)性化合物137種，其中有26種物質(zhì)系首次在濃香型大曲中發(fā)現(xiàn)。下一步我們將逐步對(duì)這些鑒定出來的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定量，進(jìn)一步探索五糧液“包包曲”的香氣構(gòu)成及香氣活性物質(zhì)。