王琳琳，尚冀寧，徐麗娟

（銀川能源學(xué)院石油化工系，寧夏銀川750100）

枸杞是寧夏地區(qū)名貴中藥材和重要經(jīng)濟(jì)作物，具有滋肝補(bǔ)腎、益精明目的功效[1]。枸杞一直被廣泛應(yīng)用于調(diào)節(jié)免疫力、預(yù)防和降低心腦血管疾病發(fā)病率、保護(hù)肝臟、抗衰老等領(lǐng)域[2]。枸杞的化學(xué)成分主要為枸杞多糖、甜菜堿、色素、維生素和黃酮類(lèi)化合物等活性成分[3-4]。其中，枸杞中的黃酮類(lèi)化合物具有止咳、平喘、祛痰等功效[5-6]，并且具有降低膽固醇、擴(kuò)張血管、增強(qiáng)心臟收縮能力、減少心臟搏動(dòng)次數(shù)和清除身體自由基等作用，從而引起了國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注[7-10]。目前對(duì)黃酮類(lèi)化合物的提取方法最主要為溶劑回流提取法[11-12]、超聲波提取法[13-16]和微波提取法[17-19]。而超聲-微波協(xié)同提取法提取枸杞中的總黃酮目前尚未報(bào)道。超聲-微波協(xié)同提取法是在超聲波提取和微波提取基礎(chǔ)上發(fā)展的一種新型提取方法，它兼顧超聲波和微波的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)又彌補(bǔ)各自的不足，提取過(guò)程中利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈空化效應(yīng)和微波的高選擇性等作用，可使植物細(xì)胞中的有效成分快速進(jìn)入溶劑，提高有效成分的提取率，有效縮短提取時(shí)間，并且避免高溫對(duì)活性成分的破壞，因此超聲-微波協(xié)同提取技術(shù)被廣泛應(yīng)用于提取植物中的生物堿、多糖、黃酮類(lèi)等生物活性物質(zhì)[20-23]。

通過(guò)超聲-微波協(xié)同提取技術(shù)對(duì)枸杞中總黃酮進(jìn)行提取，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取條件，得出超聲-微波提取枸杞中總黃酮的最佳提取工藝條件，并在此條件下比較乙醇回流法、超聲波提取法、微波提取法和超聲-微波協(xié)同提取法對(duì)枸杞總黃酮的提取率，為更好地開(kāi)發(fā)利用枸杞中黃酮類(lèi)物質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：枸杞，寧夏百潤(rùn)源生物食品有限公司。

試劑及耗材：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)藥品生物制品檢定所；無(wú)水乙醇（分析純）；亞硝酸鈉（分析純）；硝酸鋁（分析純）；氫氧化鈉（分析純）；CW-2000型超聲-微波協(xié)同提取儀，上海新拓測(cè)試技術(shù)有限公司；電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；UT-1950紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DHG-9071型電熱恒溫干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；SHZ-DCⅢ循環(huán)水式真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 枸杞中總黃酮的提取

將枸杞在50℃下烘干，粉碎后過(guò)50目篩；稱(chēng)取過(guò)篩后樣品10 g，加入乙醇溶劑，置于超聲-微波協(xié)同提取儀中提取，抽濾、濾液為總黃酮提取液。

1.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱(chēng)取干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.020 g，用65%的乙醇溶解，并定容于100.00 mL的容量瓶中。分別移取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL置于25.00 mL容量瓶中，依次加入65%的乙醇5 mL，6%的NaNO2溶液1 mL，搖勻靜置6 min，再加入10%的Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻靜置6 min；再加入6%的NaOH溶液5 mL，用65%的乙醇定容至25.00 mL，搖勻靜置15 min。在510 nm處測(cè)定其吸光度。線性回歸方程為：A=25.963C-0.00609，R2=0.99995，在0.008～0.048 mg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

1.2.3 總黃酮提取率的計(jì)算

精確移取5.0 mL總黃酮提取液置于25.00 mL容量瓶中，參照“1.2.2”進(jìn)行定容，測(cè)定吸光度，根據(jù)公式（1）計(jì)算出總黃酮提取率。提取率公式為：

式中：25——測(cè)定時(shí)定容體積，mL；

V——總黃酮提取液總體積，mL；

5——測(cè)定時(shí)移取的總黃酮的體積，mL；

10000——枸杞粉末質(zhì)量，mg；

A——吸光度；

0.00609 、25.963——蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線系數(shù)。

1.2.4 超聲-微波提取法提取枸杞中總黃酮單因素實(shí)驗(yàn)

分別設(shè)置提取功率為200 W、250 W、300 W、350 W、400 W、450 W，提取溫度為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%、100%，料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35，提取時(shí)間為10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min條件下進(jìn)行枸杞中總黃酮提取，考查提取功率、提取溫度、乙醇濃度、料液比和提取時(shí)間對(duì)提取率的影響。

1.2.5 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)影響提取率的4個(gè)主要因素，每個(gè)因素3個(gè)水平，進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)(表1)，優(yōu)化最佳提取條件。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

按照方法“1.2.2”在510 nm下測(cè)蘆丁對(duì)照品的吸光度，并以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 提取功率對(duì)總黃酮提取率的影響（圖2）

圖2 提取功率對(duì)總黃酮提取率的影響

由圖2可知，隨著提取功率增大，總黃酮提取率也在增大，當(dāng)功率為300 W時(shí)，提取率達(dá)到最大值，之后隨著功率增加，提取率出現(xiàn)下降趨勢(shì)。這種變化趨勢(shì)可能由以下原因所導(dǎo)致：第一，超聲波對(duì)植物細(xì)胞有破壞作用，功率小于300 W時(shí)，總黃酮有效成分溶解速度加快，故提取率增大，大于300 W后功率繼續(xù)增大，對(duì)細(xì)胞的破壞作用也增大，細(xì)胞中的雜質(zhì)溶解量也相應(yīng)增加，導(dǎo)致提取率下降；第二，微波功率增大使溶液溫度升高，當(dāng)功率為350 W時(shí)，測(cè)得溶液溫度為65℃，使總黃酮中的活性成分結(jié)構(gòu)被破壞而使提取率下降。因此最佳提取功率為300 W。

2.2.2 提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響（圖3）

圖3 提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響

由圖3可知，隨著提取溫度不斷上升，總黃酮提取率也在逐漸上升。當(dāng)提取溫度達(dá)到50℃時(shí)，提取率開(kāi)始下降，超過(guò)50℃后，溫度升高使總黃酮中的某些不耐高溫的化合物的結(jié)構(gòu)被破壞而使提取率下降，故最佳提取溫度為50℃。

2.2.3 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響（圖4）

圖4 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響

由圖4可知，隨著乙醇濃度的增大，總黃酮提取率隨之上升，當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí)，提取率最高，說(shuō)明提取效果最好；之后隨著乙醇濃度進(jìn)一步增大，提取率呈下降趨勢(shì)。原因可能為黃酮類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)決定其具有較高極性，而不同濃度的乙醇溶劑極性不同。根據(jù)相似相溶原理，乙醇濃度為70%時(shí)與枸杞總黃酮的極性最相似，故對(duì)黃酮類(lèi)化合物溶解性最強(qiáng)，因此最佳濃度為70%。

圖5 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響

2.2.4 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響（圖5）由圖5可知，隨著料液比的增大，提取率也隨之增大，當(dāng)料液比達(dá)到1∶25時(shí)，提取率達(dá)到最大值，之后隨著料液比增大，提取率趨于平緩。因?yàn)殡S著料液比的增大，枸杞粉末與溶劑接觸面增加，

黃酮類(lèi)化合物越容易被提取出來(lái)；當(dāng)料液比增大到一定值后，一定量的枸杞中總黃酮含量完全被提取出來(lái)，故提取率趨于平緩；而且，液料比增大，溶劑用量會(huì)增加，導(dǎo)致提取成本增高，同時(shí)也增加溶劑回收難度，使操作時(shí)間延長(zhǎng)。因此，確定最佳料液比為1∶25。

圖6 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

2.2.5 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響（圖6）由圖6可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率也上升。當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到25 min時(shí)，繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間，提取率有所下降，這表明提取時(shí)間達(dá)到25 min時(shí)，枸杞中的總黃酮已完全被提取出來(lái)，繼續(xù)增加提取時(shí)間，會(huì)使已提取的總黃酮部分被氧化，導(dǎo)致提取率下降。故最佳提取時(shí)間為25 min。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)果分析

L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，各因素對(duì)總黃酮提取率影響的主次順序?yàn)椋禾崛囟?A)＞料液比(C)＞乙醇濃度(B)＞提取時(shí)間(D)，比較各因素的極差R可知，提取溫度(A)和料液比(C)的極差較大，說(shuō)明這兩個(gè)因素對(duì)提取率影響較顯著；而乙醇濃度(B)和提取時(shí)間(D)的極差較小，說(shuō)明這兩個(gè)因素對(duì)提取率影響較小。通過(guò)分析可以確定超聲-微波協(xié)同提取的最佳提取條件為A2B1C2D2，即提取溫度50 ℃，料液比為1∶20，乙醇濃度為60%，提取時(shí)間20 min。

表2 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

將優(yōu)化后的最佳提取條件重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，計(jì)算總黃酮的提取率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 驗(yàn)證結(jié)果

由表3可知，最佳提取條件所得到3組平均提取率為1.98%，RSD為0.35%，重現(xiàn)性較好，工藝條件合理。

2.5 方法對(duì)比

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)及其結(jié)果分析，在最佳工藝條件下，分別采用乙醇回流法、超聲波提取法、微波提取法和超聲-微波協(xié)同提取法提取枸杞中的總黃酮，并比較提取率，結(jié)果見(jiàn)圖2—圖6。對(duì)比結(jié)果見(jiàn)圖7。

由圖7可知，對(duì)4種提取方法進(jìn)行對(duì)比，得出超聲-微波協(xié)同提取法的提取率最高，達(dá)到1.98%。

圖7 不同提取方法的總黃酮提取率

3 結(jié)論

以枸杞總黃酮提取率為考查標(biāo)準(zhǔn)，采用超聲-微波提取法提取枸杞中的總黃酮。并采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化提取工藝得到最佳提取條件。最佳提取條件為：提取功率300 W，提取溫度50℃，乙醇濃度60%，料液比1∶20，提取時(shí)間20 min；由此條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得出提取率為1.98%。并在最佳條件下比較4種提取方法的提取率，得出超聲-微波協(xié)同提取法總黃酮提取率最高。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為高效合理開(kāi)發(fā)枸杞中的活性成分提供了一定的理論基礎(chǔ)。