翁碧霞 婁江濤 周 俊 魏任雄

炎癥是常見(jiàn)的危害男性生殖健康的因素之一，也是造成男性不育癥發(fā)生發(fā)生的重要原因。炎癥反應(yīng)對(duì)細(xì)胞正常功能的影響是多方面的，可造成細(xì)胞正常功能的低下或缺失。睪丸支持細(xì)胞是精子發(fā)生和發(fā)育的搖籃，在生精小管內(nèi)，每個(gè)睪丸支持細(xì)胞（Sertoli cell）上都附著十幾個(gè)處于各發(fā)育階段的精子細(xì)胞，其在為精子發(fā)生發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如乳酸鹽等必須的能量物質(zhì)和免疫保護(hù)，而炎癥的發(fā)生勢(shì)必造成睪丸支持細(xì)胞功能的損傷[1-2]。女貞子（Fructus Ligustri Lucidi Ait）系木犀科女貞屬植物，是一味傳統(tǒng)中藥材，具有扶正固本，滋補(bǔ)肝腎，養(yǎng)陰益精作用，是治療男性不育的常用中藥[3]。而女貞子多糖（Ligustri Lucidi Ait Polysaccharide，LLP）是中藥女貞子有效成份之一。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，在炎癥條件下，其對(duì)睪丸支持細(xì)胞的免疫分泌功能具有調(diào)節(jié)作用，但是否對(duì)細(xì)胞的代謝功能具有保護(hù)作用還不清楚。而脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性桿菌細(xì)胞壁的主要組分之一，極少量的LPS在細(xì)胞內(nèi)就能引起廣泛的炎癥反應(yīng)，影響細(xì)胞的代謝功能。本研究擬通過(guò)睪丸支持細(xì)胞體外培養(yǎng)，探討LLP含藥血清在LPS誘導(dǎo)炎癥條件下是否對(duì)Sertoli細(xì)胞代謝功能具有保護(hù)作用，為女貞子在治療男性不育方面提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠10只，體質(zhì)量150～170g，由上海斯萊克動(dòng)物有限公司提供（動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2012-0002）。飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心[動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（浙）2013-0184]，室內(nèi)溫度（24±2）℃，相對(duì)濕度 40～60%，自由進(jìn)食水，適應(yīng)性飼養(yǎng)兩周備用。

1.2 試劑和儀器 DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司（批號(hào)0781003、SH30848.01B、SV30087.03）、Ⅱ型膠原酶購(gòu)于上海李記生物科技有限公司（批號(hào)C5100L0041）；96、24和12孔細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Coming公司；CCK-8購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司（批號(hào)CZ677）；三磷酸腺苷（ATP）、乳酸（LD）、乳酸脫氫酶（LDH）和琥珀酸脫氫酶（SDH）測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物科技有限公司 （批號(hào) 20170314、20170415、20170106、20170218），兔抗大鼠Fas L多克隆抗體和HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體均購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司（批號(hào)K1563、BL0817）；倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司），CO2培養(yǎng)箱（德國(guó)Heraceu公司），超凈工作臺(tái)（蘇州華宇凈化設(shè)備有限公司）,酶標(biāo)儀（科華ST-360），紫外分光光度計(jì)（UV-1800型）。

1.3 女貞子多糖含藥血清的制備 女貞子多糖為棕色粉末，多糖含量大于50%，由寧波市藥品檢驗(yàn)所提供。選取8只SD雄鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為高劑量LLP組、中劑量LLP組、低劑量LLP組和陰性對(duì)照組，每組2只。高劑量LLP組按照每日4g/kg、中劑量LLP組按照每日2g/kg、低劑量LLP組按照每日1g/kg女貞子多糖連續(xù)灌胃10天，對(duì)照組采用蒸餾水（1mL/100g）灌胃10天，最后一次給藥2h后處死并取血，分別制備高、中、低劑量女貞子多糖含藥血清和正常血清備用。

1.4 睪丸支持細(xì)胞原代培養(yǎng)鑒定 Sertoli細(xì)胞分離培養(yǎng)、純化和培養(yǎng)方法參考文獻(xiàn)[4]，Sertoli鑒定采用特異FasL抗體免疫組化進(jìn)行鑒定，支持細(xì)胞純度=FasL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%，純度達(dá)到90%后備用。實(shí)驗(yàn)分為分為陰性對(duì)照組、LPS組和3個(gè)LPS+LLP組。LPS終濃度為5μg/mL，三個(gè)LPS+LLP組分別加入培養(yǎng)體積10%的高、中、低劑量女貞子多糖含藥血清，對(duì)照組加入培養(yǎng)體積10%正常血清，LPS組加入培養(yǎng)體積10%正常血清和LPS,每組5復(fù)孔。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞依據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆謩e接種于96孔、24孔和12孔培養(yǎng)孔內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞融合到約30～50%后，將LPS加入LPS刺激組和三個(gè)女貞子+LPS組，不同濃度女貞子含藥血清加入LPS+低劑量LLP組、LPS+中劑量LLP組、LPS+高劑量LLP組后繼續(xù)培養(yǎng)48h后備用。

1.5 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖活性 選用上述96孔板內(nèi)培養(yǎng)的各組細(xì)胞，分別加入CCK-8 10μl，孵箱培養(yǎng)60min后酶標(biāo)分析儀450nm測(cè)定各組吸光度值。

1.6 細(xì)胞內(nèi)ATP、LD含量和LDH、SDH活力的測(cè)定收集各組細(xì)胞，并用預(yù)冷的生理鹽水清洗3次，每個(gè)待測(cè)樣品中加入0.2mL生理鹽水進(jìn)行勻漿并置于冰上勻漿裂解細(xì)胞。采用相關(guān)試劑盒測(cè)定ATP、LD含量和LDH、SDH活力，具體操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。測(cè)定結(jié)果采用蛋白含量進(jìn)行標(biāo)化

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s） 表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。

2 結(jié)果

2.1 睪丸支持細(xì)胞分離鑒定 原代Sertoli細(xì)胞分離培養(yǎng)后呈不規(guī)則形，F(xiàn)asL高表達(dá)于胞漿中，免疫組化染色可見(jiàn)胞質(zhì)內(nèi)有大量棕黑色顆粒，即為支持細(xì)胞，純度＞95%。

2.2 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果 對(duì)照組、LPS組、LPS+低劑量LLP組、LPS+中劑量LLP組和LPS+高劑量LLP組OD值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。方差齊性檢驗(yàn)（P＞0.05），組內(nèi)兩兩比較采用LSD法。LPS組與對(duì)照組相比細(xì)胞增殖活性明顯減弱（P＜0.01）。與LPS組相比三組LPS+女貞子多糖組細(xì)胞增殖活力有不同程度的增強(qiáng)，見(jiàn)表1。

2.3 細(xì)胞內(nèi)ATP、LD含量檢測(cè)結(jié)果 各組細(xì)胞ATP和LD含量組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01），LPS組中ATP、LD 含量與對(duì)照組相比顯著降低（P均＜0.01），LPS+LLP組與LPS組相比ATP、LD含量均隨LLP濃度的增加而逐漸增加（P均＜0.05），見(jiàn)表 2。

表1 各組細(xì)胞增殖活性比較

表2 睪丸支持細(xì)胞ATP和LD 含量測(cè)定結(jié)果（nmol/mL±s）

表2 睪丸支持細(xì)胞ATP和LD 含量測(cè)定結(jié)果（nmol/mL±s）

注：與對(duì)照組相比較，*P＜0.01；與 LPS 組相比較，△P＜0.05，▲P＜0.01；ATP：三磷酸腺苷；LD：乳酸；LPS：脂多糖；LLP：女貞子多糖；對(duì)照組予蒸餾水1mL/100g灌胃；LPS組經(jīng)濃度為5μg/mL；LPS+低、中、高劑量LLP 組分別為 1g/kg、2g/kg、4g/kg灌胃

組別空白對(duì)照組LPS組LPS+低劑量LLP組LPS+中劑量LLP組LPS+高劑量LLP組孔數(shù)5 5 5 5 5 ATP 87.47±4.88 36.41±3.67*40.34±4.40△55.35±6.54▲65.34±5.27▲LD 107.21±7.47 44.91±3.39*49.54±4.67△55.32±5.44▲76.08±0.42▲

2.4 細(xì)胞內(nèi)LDH、SDH活力檢測(cè)結(jié)果 各組細(xì)胞LDH和SDH活力組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01），LPS組中LDH和SDH活力與對(duì)照組相比顯著降低（P均＜0.01），LPS+LLP組與LPS組相比LDH和SDH活力均隨LLP濃度的增加而逐漸增加（P 均＜0.05），見(jiàn)表 3。

表3 睪丸支持細(xì)胞LDH和SDH活性檢測(cè)（U/mL

表3 睪丸支持細(xì)胞LDH和SDH活性檢測(cè)（U/mL

注：與對(duì)照組相比較，*P＜0.01；與 LPS 組相比較，△P＜0.05，▲P＜0.01；LDH：乳酸脫氫酶；SDH：琥珀酸脫氫酶；LPS：脂多糖；LLP：女貞子多糖；對(duì)照組予蒸餾水1mL/100g灌胃；LPS組經(jīng)濃度為5μg/mL；LPS+低、中、高劑量 LLP 組分別為 1g/kg、2g/kg、4g/kg灌胃

組別空白對(duì)照組LPS組LPS+低劑量LLP組LPS+中劑量LLP組LPS+高劑量LLP組孔數(shù)5 5 5 5 5 LDH 98.54±6.59 34.25±3.25*39.27±4.24△45.09±7.54▲57.54±4.37▲SDH 132.54±7.44 54.24±4.24*59.87±5.34△65.62±7.27▲72.13±6.37▲

3 討論

炎癥是影響男性生殖的常見(jiàn)病因之一，其對(duì)男性生殖系統(tǒng)細(xì)胞功能影響廣泛，可誘發(fā)多種男性生殖疾病，如睪丸炎、男性免疫性不育癥等。Sertoli細(xì)胞是精子發(fā)生發(fā)育的保姆，在生精小管內(nèi)，每個(gè)Sertoli細(xì)胞的表面都哺育這十幾個(gè)處于不同發(fā)育階段的精子細(xì)胞，為精子發(fā)生發(fā)育提供多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[5]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)Sertoli細(xì)胞代謝的改變可直接影響精子的發(fā)生過(guò)程[6]。精子細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育需較高的能量，其能量供給底物主要為乳酸而非葡萄糖。睪丸支持細(xì)胞可將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸，為精子細(xì)胞提供能量來(lái)源[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)沒(méi)有足夠乳酸供應(yīng)時(shí)，精子細(xì)胞將會(huì)發(fā)生退化和凋亡[8]。LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，也是一種主要的致炎因子，能誘多種細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子，造成炎癥損傷。研究表明，LPS可造成睪丸支持細(xì)胞的多種功能受損，如分泌蛋白功能，Sertoli細(xì)胞間緊密連接等，同時(shí)還能影響Sertoli細(xì)胞的代謝[9]。本研究亦發(fā)現(xiàn)，LPS可造成Sertoli細(xì)胞分泌LD含量降低。在糖酵解代謝途徑中，乳酸的生產(chǎn)主要由LDH 催化丙酮酸產(chǎn)生，因此細(xì)胞內(nèi)LDH的活力將直接影響到乳酸生成。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LPS組細(xì)胞LDH的活力明顯下降。SDH是三羧酸循環(huán)中唯一存在于線(xiàn)粒體內(nèi)膜上的酶，是線(xiàn)粒體的標(biāo)志酶，因此SDH活力可作為評(píng)價(jià)細(xì)胞線(xiàn)粒體功能重要指標(biāo)。同時(shí)在三羧酸循環(huán)中，SDH催化琥珀酸脫氫轉(zhuǎn)變成延胡索酸，脫下的氫最后生成ATP。ATP是細(xì)胞生命活動(dòng)的直接供能者，亦是睪丸支持細(xì)胞維持正常功能的前提。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS可造成Sertoli細(xì)胞SDH活性下降，同時(shí)ATP含量亦降低。

女貞子是系木犀科女貞屬植物，其性味甘、苦、涼，歸肝、腎經(jīng)，具有扶正固本，滋補(bǔ)肝腎，養(yǎng)陰益精作用，是臨床治療男性不孕癥的常用中藥成份[10]。主要藥物有效成份為齊墩果酸、紅景天苷和女貞子多糖等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，女貞子多糖具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等多種功效。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)女貞子多糖可明顯減輕LPS對(duì)Sertoli細(xì)胞能量代謝關(guān)鍵酶SDH和LDH的酶活性的損傷，進(jìn)而有效提高LD和ATP的含量。而這一作用可能是其能提高細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞凋亡的原因之一。

女貞子具有滋補(bǔ)肝腎，養(yǎng)陰益精作用，本研究發(fā)現(xiàn)女貞子多糖可有效減輕LPS對(duì)sertoli細(xì)胞造成代謝功能損傷，提示其可能對(duì)細(xì)胞的代謝具有一定的調(diào)節(jié)作用，這為中藥女貞子在治療男性生殖系統(tǒng)疾病中的藥理作用提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，但炎癥是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程，女貞子多糖是否對(duì)睪丸支持細(xì)胞代謝功能具有直接調(diào)節(jié)功能而不是通過(guò)對(duì)其它功能（如免疫調(diào)節(jié)）調(diào)節(jié)而間接影代謝能能還有待進(jìn)一步研究。