余 華， 葉健強(qiáng)， 嚴(yán)玉寶， 謝 晶， 胡 娟， 康潤敏， 周岷江， 廖黨金， 崔鵬博， 葉勇剛， 于吉鋒， 肖 璐， 曹 冶， 魏 甬， 李興玉， 林 毅， 潘 夢， 戴卓建

(1.四川出入境檢驗(yàn)檢疫局， 四川 成都 610041； 2.四川省畜牧科學(xué)研究院， 四川 成都 610066； 3.動物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 四川 成都 610066)

恩拉霉素(Enramycin，Er)，又名安來霉素和持久霉素，由日本武田藥品研究所于1966年發(fā)現(xiàn)，是放線菌(StreptomycesfungicidiousNO. B5477)發(fā)酵產(chǎn)生的一種由不飽和脂肪酸和十二種氨基酸結(jié)合成的多肽類(Polypepide)抗生素[1-2]，其主要成分是恩拉霉素A(C107H138C12N26O31R=CH3)和恩拉霉素B(C108H140C12N26O31R=C2H5OH)。該藥具有很強(qiáng)的抗G+菌作用，用作飼料添加劑能促進(jìn)畜禽生長和提高飼料效率，長期使用不易產(chǎn)生耐藥性，與其他抗生素亦無交叉耐藥；其化學(xué)性能穩(wěn)定，無致突、致畸及致癌作用，殘留極少，適口性好?，F(xiàn)已成為當(dāng)前最具發(fā)展前景的獸用抗生素添加劑。

免疫分析法較傳統(tǒng)微生物檢測法、理化檢測法具有簡潔、快速、廉價(jià)、特異性強(qiáng)和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，已被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用于獸藥殘留的檢測，但至今國內(nèi)外尚無有關(guān)恩拉霉素酶免疫檢測技術(shù)的報(bào)道[3-5]，僅日本厚生省對該項(xiàng)殘留物質(zhì)有畜、水產(chǎn)性食品常規(guī)檢測技術(shù)報(bào)道[6]。因此，開發(fā)我國自主產(chǎn)權(quán)的恩拉霉素殘留檢測方法對恩拉霉素酶免疫檢測技術(shù)具有重要意義。建立相關(guān)免疫學(xué)分析方法，制備出特異性強(qiáng)且效價(jià)高的恩拉霉素抗體是關(guān)鍵，必須將其與蛋白質(zhì)載體等大分子載體偶聯(lián)形成人工合成的完全抗原進(jìn)而制備相應(yīng)抗體[7]，這也是建立免疫分析過程的前提和關(guān)鍵所在。鑒于此，在恩拉霉素人工抗原合成試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)對抗原合成條件和主要影響因素進(jìn)行優(yōu)化，以期為進(jìn)一步制備抗Enramycin多克隆抗體、單克隆抗體及檢測試劑盒奠定基礎(chǔ)，并為恩拉霉素殘留檢測方法的建立提供參考。

1材料與方法

1.1供試材料

1.1.1試劑恩拉霉素，純度≥98%，由項(xiàng)目組提純；牛血清白蛋白(BSA)，相對分子質(zhì)量67 kDa，上海博奧生物科技公司；卵清蛋白(OVA)，相對分子量45 kDa，上?；巧锟萍脊荆桓ナ贤耆魟?FCA)和弗氏不完全佐劑(FICA)，Sigma公司；透析袋，截留分子量14 kDa，Sigma公司；戊二醛，成都金山化學(xué)試劑公司；1，4-二氧六環(huán)，成都科龍化工試劑廠；Na2HPO4·2H2O，天津博迪化工公司；NaH2PO4和Na2CO3，成都長聊化工試劑有限公司；乙二胺四乙酸二鈉，天津華興精細(xì)化工公司。以上試劑均為分析純。

1.1.2儀器UV2501-PC型紫外掃描儀，日本島津Shimadzu公司；BS124S型電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；BS 100S型分析天平，北京賽多利斯有限公司；ULT1386-3-V38型低溫冰箱，美國REVCO公司；DCD-172K型常規(guī)冰箱，美國伊萊克斯公司；Freeze 6型冷凍干燥機(jī)，Labconco公司；DF-101S型智能集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，河南省予華儀器有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)在采用戊二醛法(glutaraldehyde)合成恩拉霉素人工免疫抗原(圖1)的基礎(chǔ)上，選取影響恩拉霉素人工抗原合成偶聯(lián)率的反應(yīng)物質(zhì)量比例、反應(yīng)溶劑比例、溫度及pH等因素，采用L9(34)正交試驗(yàn)進(jìn)行4因素3水平的試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)(表1和表2)，以確定恩拉霉素人工抗原合成的最佳方案。其中，溶劑的比例以PBS與1,4-二氧六環(huán)的體積比表示，相同反應(yīng)溫度的各處理在同一全溫培養(yǎng)搖床中進(jìn)行反應(yīng)，pH通過緩沖液PBS調(diào)節(jié)及維持。

圖1恩拉霉素人工免疫抗原合成路線

表1恩拉霉素人工免疫抗原合成的 L9 (34) 正交試驗(yàn)因素與水平

注：表中mBSA、mEr分別為牛血清蛋白(BSA)和恩拉霉素(Enramycin)的質(zhì)量。

Note: mBSAand mErare BSA and Enramycin mass respectively.

表2恩拉霉素人工免疫抗原合成L9(34)正交試驗(yàn)方案

1.2.2恩拉霉素人工免疫抗原的制備過程取一定量的BSA于一試管中，然后根據(jù)表1中PBS與1,4-二氧六環(huán)的體積比加入相應(yīng)體積的PBS溶液，等BSA完全溶解后即得試驗(yàn)用溶劑。根據(jù)表2各試驗(yàn)方案取相應(yīng)量的恩拉霉素分別盛于錐形瓶中，將上述配制的溶劑分別加入其中后搖勻，待恩拉霉素基本溶解后，再向錐形瓶中加入相應(yīng)量的1,4-二氧六環(huán)，混勻。將磁力攪拌子放入錐形瓶后將其放入一個(gè)盛有水的大燒杯中，于25℃下邊攪拌邊水浴，5 min后在保持?jǐn)嚢锠顟B(tài)下，向反應(yīng)器內(nèi)逐滴加入0.25%的戊二醛溶液數(shù)5 mL，之后仍保持?jǐn)嚢锠顟B(tài)反應(yīng)4 h。經(jīng)過透析，干燥后得目標(biāo)物質(zhì)。

1.2.3人工免疫抗原的鑒定及其偶聯(lián)率采用UV2501-PC型紫外掃描儀對Er、BSA和制備的人工免疫抗原進(jìn)行紫外全波段(波長200～400 nm)掃描。當(dāng)Er與BSA偶聯(lián)形成免疫抗原后，其紫外最大吸收波長偏移至Er和BSA特征峰之間，則表明偶聯(lián)成功，得到免疫抗原。根據(jù)吸光度計(jì)算各處理恩拉霉素人工免疫抗原的偶聯(lián)率。

1.2.4最佳方案的選擇利用Excel 2016對正交試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析，根據(jù)極差的大小確定各因素對反應(yīng)的影響；Ki和ki分別為因素第i水平(i=1，2，3)所在處理考查指標(biāo)的總偶聯(lián)率和平均偶聯(lián)率，對Ki和ki進(jìn)行比較，最大即為最優(yōu)，以此確定恩拉霉素人工抗原的最佳合成工藝。

2結(jié)果與討論

2.1人工免疫抗原的紫外光譜鑒定

從圖2可知，Er標(biāo)準(zhǔn)品紫外最大吸收波長為279 nm，BSA紫外最大吸收波長為278 nm，合成物的紫外最大吸收波長偏移至Er和BSA特征峰之間，表明，Er與BSA偶聯(lián)成功，得到免疫抗原Er-BSA。

圖2恩拉霉素人工免疫抗原與BSA、Er紫外全波段掃描

2.2正交試驗(yàn)

各處理恩拉霉素人工抗原合成的偶聯(lián)率為17.96～26.04，其中，處理7的偶聯(lián)率最高，為26.04，處理2其次，為25.70，處理8最低，僅17.96。從表3看出，A、B、C和D 4個(gè)因素不同水平的極差依次為0.41、0.79、5.90和2.36，表明，4個(gè)因素對偶聯(lián)率的影響依次為C>D>B>A，主要影響因素為反應(yīng)物質(zhì)量比和溫度，而pH和反應(yīng)溶劑比例為次要影響因素。結(jié)合圖4對k值(表3)進(jìn)行比較得出，恩拉霉素人工抗原合成的最佳方案為A3B1C2D2，即pH 7.7，VPBS∶V二氧六環(huán)為1∶1，mBSA∶mEr為1∶1，反應(yīng)溫度為28℃。

注：表中Ki為因素A、B、C、D的第i(i=1，2，3)水平所在的試驗(yàn)考查指標(biāo)偶聯(lián)率之和。

Note:Kipresents the coupling rate sum ati=1, 2 and 3 level of A, B, C and D factors respectively.

圖3 Er-BSA直觀分析圖

2.3最佳方案的確定

對比分析發(fā)現(xiàn)，該最佳方案A3B1C2D2不在試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案中，但與其中處理7(A3B1C3D2)較接近，處理7僅有反應(yīng)物質(zhì)量比(C因素)未處于最好水平，但其偶聯(lián)率最高。由于確定最佳優(yōu)化方案時(shí)不僅要看試驗(yàn)結(jié)果，同時(shí)也要結(jié)合極差分析結(jié)果進(jìn)行綜合考慮，因此，基于對重要因素反應(yīng)物質(zhì)量比(C因素)和溫度(D因素)首選最佳水平，對次要因素反應(yīng)溶劑比例(B因素)和pH(A因素)應(yīng)綜合考慮的原則，確定處理2(A1B2C2D2)為最佳方案，其Er-BSA偶聯(lián)率僅次于處理7，為25.70，居第2位，表明，篩選的最佳方案符合實(shí)際，并且節(jié)約反應(yīng)物(純化后的恩拉霉素)。

3結(jié)論與討論

通過L9(34) 正交試驗(yàn)方法對一步法合成恩拉霉素人工免疫抗原的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定反應(yīng)物質(zhì)量比和溫度是該反應(yīng)的主要影響因素，最佳反應(yīng)條件為反應(yīng)物質(zhì)量比( mBSA∶mEr) 為1∶1，反應(yīng)溫度28℃，VPBS∶V二氧六環(huán)為2∶1，pH 6.7，在此條件下，Er-BSA偶聯(lián)率為25.70。

偶聯(lián)物的結(jié)合比是指偶聯(lián)物中半抗原與載體蛋白的分子個(gè)數(shù)之比，試驗(yàn)優(yōu)化方案中符合實(shí)際的最佳方案為反應(yīng)物質(zhì)量比( mBSA∶mEr) 為1∶1，反應(yīng)溫度28℃，VPBS∶V二氧六環(huán)為2∶1，pH 6.7，其Er-BSA偶聯(lián)率為25.70，僅次于反應(yīng)條件為反應(yīng)物質(zhì)量比( mBSA∶mEr) 為2∶1，反應(yīng)溫度28℃，VPBS∶V二氧六環(huán)為1∶1，pH 7.7的偶聯(lián)率(26.04)，居第2位。不同研究最佳偶聯(lián)比的結(jié)果存在差異，通常認(rèn)為半抗原分子與載體蛋白的偶聯(lián)比為(5～30)∶1最佳[11]。該研究以結(jié)合比適當(dāng)?shù)呐悸?lián)物作為人工抗原，能夠獲得效價(jià)高、特異性強(qiáng)的以BSA為載體的偶聯(lián)物。