靖吉強 武世珍 郭洪梅 （山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院 濰坊 261061 ） 陳國花 譚清華 （山東省諸城市畜牧獸醫(yī)管理局）

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致水貂肺炎的銅綠假單胞菌分離鑒定及藥敏試驗

靖吉強 武世珍 郭洪梅*（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院 濰坊 261061 ） 陳國花 譚清華 （山東省諸城市畜牧獸醫(yī)管理局）

本文對致水貂肺炎的病源菌進行了分離鑒定及藥敏試驗，結果表明，致水貂肺炎的病菌為銅綠假單胞菌；藥敏試驗結果為美羅培南和頭孢他啶為高度敏感藥物。

水貂 肺炎 銅綠假單胞菌 鑒定 藥敏試驗

濰坊水貂養(yǎng)殖比較普遍，正處于品種不斷更新、產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展的過程中。但每年的8~9月份，水貂肺炎在不少水貂養(yǎng)殖場頻繁發(fā)生，發(fā)病率有時高達60%~80%，致死率高。2018年9月，濰坊一水貂養(yǎng)殖場發(fā)生傳染性肺炎，現(xiàn)把病情診斷及病原分離鑒定情況匯報如下：

1 材料與方法

1.1 材料

發(fā)病水貂，來自濰坊某水貂養(yǎng)殖場。沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、Baird-parker培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基均購自北京路橋技術股份有限公司。沙門氏菌顯色培養(yǎng)基、血液瓊脂培養(yǎng)基均購自濰坊天衡醫(yī)療器械有限公司。藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司。細菌基因組DNA提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 水貂飼養(yǎng)管理和發(fā)病情況調查 發(fā)生肺炎的水貂場，飼養(yǎng)水貂2000只。平時飼喂魚排、雞架、毛蛋、花生粕、玉米面以及含多種微量元素和維生素的預混劑等構成的混合飼料。魚排、雞架、毛蛋等飼料蒸熟、攪碎后成糊狀飼喂，自由飲水。幼貂斷奶后免疫犬瘟熱活疫苗，初免1個月后加強免疫一次。在7月初對非種用幼齡水貂埋植褪黑激素。2018年9月，水貂陸續(xù)發(fā)病，病貂有的呼吸困難，口鼻出血，急性死亡。有的發(fā)育遲緩，不愿運動，逐漸消瘦。發(fā)病期間投喂復方新諾明、氨芐西林，效果不明顯。發(fā)病后1周，共死亡當年幼貂89只，未埋植褪黑激素的幼齡種貂發(fā)病很少。

1.2.2 病理變化檢查 剖檢剛死亡的水貂2只，可見肺部腫脹，嚴重出血、淤血。心、脾、肝和腎未見明顯病變。胃、腸內(nèi)容物空虛。

1.2.3 犬瘟熱檢查 按照林特睿檢TM犬瘟熱抗原快速診斷試紙的說明書進行操作，取2只病貂眼、鼻、口的分泌物，和試劑盒的緩沖液混勻，然后取4滴緩沖液加入試紙卡的加樣窗中，5~10min內(nèi)讀取結果。

1.2.4 觸片、染色、鏡檢 常規(guī)無菌操作采集2只病貂的肺臟，作觸片。然后用美蘭染色液染色、顯微鏡油鏡檢查。

1.2.5 細菌的分離培養(yǎng) 常規(guī)無菌操作采集2只病貂肺臟，分別接種沙門氏菌顯色培養(yǎng)基、血液瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、Baird-parker培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)24h，觀察結果。

1.2.6 16S rRNA基因序列測定與比對 （1）分離菌基因組DNA提?。喝⊙涵傊囵B(yǎng)基上生長出的具有完全溶血性的小菌落，接種營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，獲得純培養(yǎng)物。用該純培養(yǎng)物提取該細菌的總DNA。按照細菌基因組DNA提取試劑盒的介紹的操作步驟提取細菌DNA。提取的總DNA用于分離菌的PCR檢測。（2）分離菌16S rRNA基因PCR檢測及測序：引物采用細菌16S rRNA基因的通用引物，27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3'；1541R：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'，設計擴增片段為1514bp。PCR反應體系為：DNA模板1μl，2×Master Mix 20μl，上、下游引物個1μl，加超純水至反應體積為40μl，震蕩混勻后，1000轉離心1min后放入PCR儀。反應條件：94℃預變性5min；94℃變性1min，53℃退火1min，72℃延伸1min，30個循環(huán)；72℃再延伸5min。反應結束，溫度降至4℃，直至取出。取5μl PCR產(chǎn)物用于瓊脂糖凝膠電泳。若有預計大小的核酸片段出現(xiàn)，則將剩余的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進行測序。將測得的PCR產(chǎn)物序列在美國國立生物技術信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫中，用BLAST程序在線進行基因序列相似性比對，搜索與PCR產(chǎn)物序列相同或相似的基因序列。

1.2.7 分離菌的生化試驗 將分離菌的純培養(yǎng)物用革蘭氏陰性菌鑒定卡(梅里埃VITEK 2GN 21341)進行生化鑒定。嚴格按該產(chǎn)品說明書介紹的操作步驟在全自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)(型號：VITEK 2 compact system)上進行生化試驗。

1.2.8 分離菌的藥物敏感性試驗 無菌操作將分離菌的純培養(yǎng)物均勻涂布到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，然后貼藥敏片。37℃培養(yǎng)18~24h。觀察并記錄結果。根據(jù)美國國家標準化委員會(NCCLS)/美國臨床實驗室標準化研究所(CLSI)藥敏試驗執(zhí)行標準進行藥物敏感性的判斷。

3 結果

3.1 鏡檢及分離培養(yǎng)的結果

2只病貂肺臟觸片，染色后鏡檢，均發(fā)現(xiàn)的散在排列的小桿菌。2只病貂的肺臟分別接種沙門氏菌顯色培養(yǎng)基、血液瓊脂培養(yǎng)基等6種培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)24h后觀察結果，發(fā)現(xiàn)：Baird-parker培養(yǎng)基未見任何細菌生長；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基有很多中等大菌落生長，菌落周圍培養(yǎng)基被染成藍綠色；血液瓊脂培養(yǎng)基上生長出大小一致、表面光滑、有β溶血的小菌落；結晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基生長有很多非紅色菌落；沙門氏菌顯色培養(yǎng)基有很多微紅菌落生長；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基有很多白綠色小菌落生長。

3.2 犬瘟熱檢查的結果

2只病貂犬瘟熱檢查結果：對照線?均顯色，而檢測線(T)均不顯色。因此病貂未患犬瘟熱。

3.3 16S rRNA基因序列測定與比對

通過對分離菌16S rRNA基因的PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)擴增出約1500bp的核酸片段。將分離菌的16SrRNA基因的序列在美國國立生物技術信息中心(NCBI)的數(shù)據(jù)庫中，用BLAST程序在線進行基因序列相似性比對，發(fā)現(xiàn)該分離菌與登錄號為 KR349493.1的序列同源性為99%，因此確定該菌為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)。

3.4 分離菌的生化結果

分離菌的生化試驗結果見表1。該生化結果以98%的概率和極好的鑒定置信度鑒定該菌為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)。

表1 分離菌的生化試驗結果

3.5 藥物敏感性

頭孢他啶、美羅培南敏感。阿莫西林、頭孢呋辛、四環(huán)素、慶大霉素和恩諾沙星等不敏感。具體見表2。

表2 藥敏試驗結果

注：R為耐藥，S為敏感，I為中介

4 討論

（1）銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)在自然界分布廣泛，可存在于水、土壤和空氣中，是一種常見的條件性致病菌，革蘭氏染色后呈紅色[1]。它可感染狐貍、水貂、雞、犬、牛等多種動物，導致被感染動物乳房炎、流產(chǎn)、陰道炎、子宮內(nèi)膜炎、肺炎、敗血癥等[2]。這次從發(fā)生肺炎的水貂肺臟中只分離到銅綠假單胞菌，未檢測到犬瘟熱病毒。說明銅綠假單胞菌是導致本次水貂肺炎的致病菌。（2）銅綠假單胞菌可感染不同品種、不同日齡的水貂，可經(jīng)污染的空氣經(jīng)呼吸道感染，也可經(jīng)傷口感染，造成局部化膿，甚至敗血癥。死亡率可達30%~60%。本次水貂肺炎疫情發(fā)生后，先后波及相鄰的2個水貂養(yǎng)殖場，造成較大經(jīng)濟損失。因此，加強飼養(yǎng)管理，定期清糞，嚴格消毒飼養(yǎng)場所，經(jīng)常滅蠅除蚊，執(zhí)行嚴格的生物安全措施可減少本病的發(fā)生。（3）對于經(jīng)常發(fā)生銅綠假單胞菌感染，造成肺炎的水貂場?？煞蛛x銅綠假單胞菌，做成自家苗，在每年的7月初可免疫一次，幼齡水貂個半個月后可強化免疫一次，增加免疫效果。通過免疫接種，降低水貂對該病的易感性，從而減少該病的發(fā)生[3]。（4）水貂養(yǎng)殖場應注意廠址的選擇。建場時應遠離村莊和其他毛皮動物飼養(yǎng)場，以利于防疫。每年的8~9月份，可使用風機濕簾等降溫設施，使水貂生活在溫度適宜的環(huán)境里，避免熱應激導致水貂抗病力下降，減少銅綠假單胞菌導致的水貂肺炎。（5）本次從水貂肺部分離到的銅綠假單胞菌，對頭孢呋辛、四環(huán)素、慶大霉素等多種抗菌藥不敏感，只對美羅培南等少數(shù)抗菌藥敏感。為減少銅綠假單胞菌的耐藥性，應提升養(yǎng)殖模式，創(chuàng)造更好的養(yǎng)殖環(huán)境，采用優(yōu)質飼料，提高水貂抗病力，減少抗菌藥物在水貂養(yǎng)殖過程的使用。

[1] 朱利霞, 王洪彬, 楊楠等. 水貂綠膿桿菌病研究概述[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī), 2018(18): 214-217.

[2] 竹堃園, 吳蘭, 劉燕霏等.犬子宮蓄膿中綠膿桿菌分離鑒定及耐藥性分析[J].天津農(nóng)學院學報, 2018, (3): 47-51.

[3] 莊金秋, 梅建國, 沈志強等.水貂出血性肺炎的實驗室診斷方法研究進展[J].經(jīng)濟動物學報, 2013, 17(4): 225-227.

濰坊市科技發(fā)展計劃項目，項目編號2014GX069，項目名稱：山東部分地區(qū)毛皮動物肺炎流行病學調查及防治技術研究

（2019–01–10）

S852.61

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