尤曉光，彭明麗，涂蓉，文麗君

1. 海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，海南 ?？?570102；2. 西北大學，陜西 西安 710127；3. 海南醫(yī)學院 藥學院，海南 海口 571100

引言

腫瘤血管內(nèi)皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）是維持腫瘤血管生長和增殖的關(guān)鍵生長因子，廣泛存在于惡性腫瘤中，分布于腫瘤細胞和腫瘤鄰近血管內(nèi)皮細胞的胞漿內(nèi)外，通過細胞膜上受體發(fā)揮作用。VEGF165是體內(nèi)最多的亞型，其生物活性最強，故在臨床和科研中應用最多[1]。VEGF165能直接刺激腫瘤細胞增殖，促進腫瘤的血管生成及轉(zhuǎn)移，其表達水平與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)，使得VEGF165成為重要的腫瘤顯像與治療靶分子。適配體（Aptamer）是具有特異性蛋白結(jié)合功能的單鏈寡核苷酸片段，VEGF165-Aptamer是可特異性識別和結(jié)合VEGF165的適配體，其序列由27個堿基組成[2]。由于其結(jié)構(gòu)靈活易變，三維構(gòu)象復雜，很容易形成與靶標結(jié)合的口袋結(jié)構(gòu)，所以理論上能與VEGF165靶分子結(jié)合。CY5.5的發(fā)光在近紅外區(qū)，背景非常低，易于標記蛋白質(zhì)、適配體等靶向物質(zhì)，特別適合于活體小動物體內(nèi)成像研究。

Lim等[3]將αvβ3-Aptamer與超順磁性氧化鐵（Ultrasmall Superparamagnetic Iron Oxide，USPIO）連接構(gòu)建 Apt αvβ3-MNPs磁性納米粒，對肝癌小鼠模型顯示出較好的T2負性強化效果。Fan等[4]用人類表皮成長因子受體2（Human Epidermal Growth Factor Receptor 2，HER2）特異性CY3-Aptamer標記USPIO，從SK-BR-3乳腺癌患者血中成功分離出乳腺癌細胞，并被熒光及MRI成像證實。Wu等[5]將前列腺癌膜抗原PSMA特異性Aptamer與USPIO連接，體外對前列腺癌PC3細胞顯示出明顯的T2負性靶向強化作用。Cui等[6]合成RGD-PAA-USPIO，對鼻咽癌移植瘤抗血管生成治療效果監(jiān)測，治療后4天與14天，實驗組觀察到腫瘤T2負性靶向強化，隨著時間延長，腫瘤縮小，而對照組T2負性強化不明顯。我們采用化學交聯(lián)法將USPIO與CY5.5-VEGF165-Aptamer進行化學交聯(lián)，得到靶向性磁性納米微粒CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO，并進行活體內(nèi)外靶向?qū)嶒?，與上述實驗相比，我們選用的靶點VEGF165在活體內(nèi)腫瘤分布更廣泛，VEGF165-Aptamer分子量更小，體內(nèi)無免疫源性，因此本靶向?qū)Ρ葎┙窈蟾信R床應用價值。本實驗鑒定其理化性質(zhì)，觀察其體外對腫瘤VEGF165靶點的靶向結(jié)合能力，同時觀察其體內(nèi)MRI及熒光靶向腫瘤顯像效果，為今后其攜帶阿霉素或多柔比星等化療藥用于腫瘤治療奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

CY5.5-VEGF165-Aptamer（由大連寶生物工程有限公 司 合 成 ），VEGF165（ProSpec-Tany TechnoGene Ltd），抗 -VEGF165（1:500-1000，Millipore Corporation），辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗兔IgG（1:500-1:2000，Millipore公司）。顯色液A、B，終止液（英科新創(chuàng)科技有限公司），洗滌液為磷酸鹽緩沖液（PBS，PH值為7.4），96孔酶標板（Sigma)，酶標儀（Thermo Scientific Corporation，MK3型），USPIO（西北大學），EDC與NHS（Thermo Fisher Scientific Inc），普魯氏藍染色試劑盒（Solarbio），BEL-7402荷瘤鼠（上海斯萊克實驗動物有限公司），3.0T MRI（GE），小動物熒光成像儀（IVIS Lumina II in vivo Imaging System）。

1.2 CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO探針構(gòu)建

取 1.5 mg USPIO（50 μL）加入 200 μL EDC（5 mg/mL）與200 μL NHS（5 mg/mL），37℃活化30 min；磁分離后向離心管中加入CY5.5-Aptamer 1 mg，PBS（pH=8.0）調(diào)整液體總體積500 μL，37℃避光偶聯(lián)3 h；再次磁分離后加入1%甘氨酸封閉磁株，放入4℃冰箱備用。

1.3 CY5.5-Aptamer-USPIO與VEGF165體外結(jié)合能力的ELISA實驗

實驗分三組：空白對照組、實驗組與陰性對照組?？瞻讓φ战M5只2.5 mL離心管中放入0.25 mL CY5.5-USPIO，實驗組與陰性對照組加入與之等量CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO。將空白對照組與實驗組加入相同量的VEGF165，陰性對照組加入與之等量VEGF121，37℃搖床內(nèi)反應1 h；磁分離后每管內(nèi)加入等量VEGF165一抗50 μL，37℃搖床內(nèi)反應30 min；再次磁分離后每管內(nèi)加入等量VEGF165二抗50 μL，37℃搖床內(nèi)反應30 min；最后磁分離后每管內(nèi)加入顯色A液200 μL與B液200 μL，37℃搖床內(nèi)反應10 min后每管內(nèi)加入終止液200 μL，移液器從每管內(nèi)吸出50 μL液體放入96孔酶標板中，450 nm測吸光度（Optical Density，OD）值，OD=l g(1/trans)，其中trans為檢測物的透光值。

1.4 CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO體內(nèi)靶向熒光成像實驗

實驗隨機分兩組，實驗組與對照組。實驗組與對照組均為8只腋下BEL-7402肝癌荷瘤鼠。實驗組尾靜脈注射CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO 0.2 mL；對照組尾靜脈給予CY5.5-USPIO 0.2 mL（與實驗組等劑量、等摩爾濃度）。分別在注射對比劑后進行間斷多時（1、2、3、4、6h）點掃描，檢測每次成像采集的腫瘤熒光強度并進行記錄，觀察對比劑在腫瘤內(nèi)的結(jié)合情況及代謝時間記錄。在熒光強度峰值時間采集熒光成像后處死實驗組2只、對照組1只荷瘤鼠，行免疫組化及普魯氏藍染色檢查。

1.5 CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO體內(nèi)MRI靶向?qū)嶒?/h3>

實驗隨機分兩組，實驗組和對照組各8只腋下BEL-7402肝癌荷瘤鼠。掃描參數(shù)為軸位FSE T2WI：TR 400 ms，TE 102 ms；矩陣：192×192；FOV：8 cm×8 cm；層厚：0.8 mm；層間距：0。對比劑增強給藥方式：麻醉方法，采用戊巴比妥1.0～1.25 mg/20～25 g，即0.05 mg/g（荷瘤鼠），每次掃描前10 min給藥。實驗組尾靜脈注射CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO 0.3 mL（1.5 mg/mL），對照組尾靜脈注射等量CY5.5-USPIO。共掃描3次，分別在注射前平掃、注射后3 h與6 h掃描。信號強度的測量方法為分別在各時段同層面取三個感興趣區(qū)（Region of Interest，ROI）求平均值，每個ROI直徑約2.0 mm。

1.6 免疫組化

取腫瘤組織脫水、包埋、切片、脫蠟后，接著熱修復。用pH=9.0檸檬酸緩沖液放在微波爐中火煮沸約10 min，然后自然冷卻至室溫；然后加VEGF165一抗1:4000，4℃過夜；取出玻片復溫，從4℃冰箱內(nèi)拿出玻片后復溫10 min，PBS浸洗后加VEGF165二抗，37℃孵育30 min；最后PBS液浸洗三次后，使用DAB顯色試劑盒的顯色劑A、B各一滴，加至標本上，顯色5～10 min，充分水洗后，蘇木素復染細胞核1 min，再次充分水洗，待玻片干后，中性樹脂封片。

1.7 普魯氏藍染色

取腫瘤組織脫水，包埋、切片、烤片、脫蠟，然后在玻片上滴加鹽酸與亞鐵氰化鉀等量混合液染20～30 min，蒸餾水洗3遍；接著中性紅溶液染1.5～2 min，自來水沖洗；最后脫水，二甲苯透明2 min兩次，中性樹脂封片。

1.8 統(tǒng)計學分析

用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件及Excel 2016進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，實驗組與對照組均為計量資料，不同組間采用LSD-t檢驗進行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 探針構(gòu)建結(jié)果

CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO構(gòu)建示意圖，見圖1。CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO粒徑小于30 nm（圖2），磁飽和度為35 emu/g（圖3）。CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO熒光發(fā)射光譜，見圖4，其最大發(fā)射波峰在707 nm附近。

圖1 USPIO經(jīng)EDC與NHS活化后將CY5.5-VEGF165-Aptamer包被于其表面，構(gòu)建成CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO

圖2 透射電鏡示CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO粒徑小于30 nm

圖3 CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO飽和磁化強度

圖4 CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO磁性納米顆粒水溶液的熒光發(fā)射光譜

2.2 CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO體外與VEGF165體外結(jié)合實驗研究實驗結(jié)果

為確認與USPIO偶連的CY5.5-VEGF165-Aptamer能特異、高效地與VEGF165結(jié)合，我們設(shè)計了本ELISA實驗。實驗結(jié)果表明CY5.5-VEGF165-Aptamer僅能與VEGF165結(jié)合，而不能與VEGF121結(jié)合，USPIO沒有與VEGF165結(jié)合的能力（見表1與圖5）。

2.3 CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPI體內(nèi)靶向熒光實驗

腋下肝癌實驗組尾靜脈注射CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO后腫瘤熒光信號逐漸上升，3 h信號達最大值，然后信號逐漸下降，6 h接近平掃（圖6）。對照組腫瘤未見明顯熒光，未見明確強化。

表1 ELISA實驗展示不同組在450 nm處獲得的OD值 （±s）

表1 ELISA實驗展示不同組在450 nm處獲得的OD值 （±s）

注：本實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理為LSD-t檢驗，F(xiàn)=474519.233，組間兩兩比較的統(tǒng)計結(jié)果顯示P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。

組號 組名 OD值 統(tǒng)計學處理組比 P 1 空白對照 0.800±0.001 1:2 P＜0.001 2 實驗組 2.311±0.002 2:3 P＜0.001 3 陰性對照組 0.803±0.004 1:3 P = 0.099

圖5 CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO體外與VEGF165體外結(jié)合ELISA實驗

圖6 CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO活體熒光成像圖

2.4 CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO體內(nèi)靶向MRI實驗

實驗結(jié)果表明荷瘤鼠尾靜脈注射CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO后，在3 h T2WI上信號較平掃明顯降低，6 h信號已經(jīng)回升與平掃無顯著差異；對照組鼠尾靜脈注射CY5.5-USPIO后，不同時間點掃描，T2WI信號無明顯差異（圖7和圖8）。免疫組化及普魯氏藍染色結(jié)果，見圖9。腫瘤細胞漿VEGF165免疫組化染色陽性，呈棕黃色；部分腫瘤細胞漿見藍色鐵沉積，染色陽性。

3 討論

利用Aptamer構(gòu)建靶向探針是近年來頗受重視的一個研究方向，與抗體相比，核酸類配基更優(yōu)越，如不受免疫條件和免疫原性限制，可體外人工合成，變性與復性可逆，可修飾并易于長期保存和室溫運輸[7-8]。利用酰胺鍵將CY5.5標記到VEGF165-Aptamer表面，合成時3'端帶有一游離氨基供與羧基USPIO連接，其中Aptamer是一種小分子的寡核苷酸，其序列由27個堿基組成，序列結(jié)構(gòu)特點是5'-CGGAAUCAGUGAAUGCUUA UACAUCCG-3'，所有的嘧啶（C，U）為核糖環(huán)2'位被氟修飾（2'-F-C或2'-F-U），所有嘌呤（A，G）用核糖環(huán)2'位被甲基修飾（2'-O-CH3-A或2'-O-CH3-G），在自然環(huán)境下不被RNA酶降解。由于其結(jié)構(gòu)靈活易變，三維構(gòu)象復雜，很容易形成與靶標結(jié)合的口袋結(jié)構(gòu)。其識別分子的模式與抗體類似，但比抗體具有更高的特異性，能識別VEGF165的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域[2]。

圖7 CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO活體MRI成像圖

圖8 CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO SNR統(tǒng)計圖

圖9 免疫組化及普魯氏藍染色圖

細胞高表達靶分子是分子成像的基礎(chǔ)，由于VEGF165廣泛分布于多種腫瘤細胞和腫瘤鄰近血管內(nèi)皮細胞的胞漿內(nèi)外，通過細胞膜上VEGFR2受體發(fā)揮作用，促進血管內(nèi)皮細胞增殖，提高血管的通透性，誘導新生血管的形成。腫瘤細胞不僅分泌VEGF165，同時還能表達其受體[9-10]。因此，VEGF165能直接刺激腫瘤細胞的增殖，但在生理情況下VEGF165表達水平很低，僅在胚胎組織與增殖期子宮內(nèi)膜有適量的表達，因而是構(gòu)建分子探針的理想靶點[11-12]。USPIO表面攜帶羧基，經(jīng)EDC與NHS活化后可與CY5.5-Aptamer游離氨基反應，形成穩(wěn)定連接體，成為靶向性對比劑合成基礎(chǔ)[13-14]。

評價藥物靶向投遞系統(tǒng)的一個重要研究內(nèi)容是分子探針對其病變部位的選擇性，即靶向性[15]。靶向性使藥物在活性部位有更高的濃度，從而降低藥物劑量，減少毒副反應。為了檢測CY5.5-VEGF165-Aptamer與VEGF165體外特異性結(jié)合能力，我們構(gòu)建了ELISA實驗，CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO實驗組與陰性對照組OD值差異有統(tǒng)計學意義，表明CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO上連接的VEGF165-Aptamer只能與VEGF165結(jié)合而不能與生長因子VEGF121結(jié)合。由于空白對照組USPIO表面沒有與VEGF165結(jié)合的對應物質(zhì)，因此空白對照組與實驗組OD值差異有統(tǒng)計學意義。這更進一步說明在我們設(shè)計的ELISA實驗中，CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO與VEGF165的結(jié)合是特異性靶向性的結(jié)合。為了驗證CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO在活體內(nèi)對VEGF165的靶向性，我們建立了BEL-7402腋下荷瘤鼠模型，并分成實驗組鼠尾靜脈注射CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO，對照組鼠尾靜脈注射等量CY5.5-USPIO。體內(nèi)熒光靶向?qū)嶒烇@示，腋下肝癌實驗組尾靜脈注射CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO后腫瘤熒光信號逐漸上升，表明CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO逐漸積聚靶向BEL-7402腫瘤，3 h信號最大值，然后信號逐漸下降，6 h接近平掃，強化作用消失，對照組未見明顯強化。MRI掃描發(fā)現(xiàn)實驗組荷瘤鼠腫瘤在3 h T2WI信號較平掃明顯降低，與熒光成像吻合，6 h T2WI信號已經(jīng)回升與平掃無顯著差異；對照組平掃、3 h、6 h各時間點T2WI信號變化不大；實驗組腫瘤確實存在明顯負性強化，并被普魯氏藍染色證實（圖9）。腫瘤區(qū)VEGF165是我們靶向成像的靶點，其由腫瘤細胞分泌出胞外，經(jīng)間質(zhì)移向新生血管內(nèi)皮細胞，刺激腫瘤新生血管形成及腫瘤細胞增殖（免疫組化證明瘤區(qū)VEGF165染色陽性，見圖9），隨著生物學功能完成而被解離代謝（動態(tài)過程）。實驗組在3 h出現(xiàn)明顯強化，說明此時CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO已經(jīng)與瘤區(qū)VEGF165靶點結(jié)合，6 h負性強化作用消失，說明此時與CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO結(jié)合的VEGF165可能被代謝解離，與之結(jié)合的CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO失去了這個游動的靶點，重新返回腫瘤血管進入體循環(huán)被代謝。對照組USPIO表面沒有與VEGF165特意性結(jié)合的VEGF165-Aptamer，因此不可能與瘤區(qū)靶點結(jié)合，始終不存在強化效應。Huang等[16]合成anti-VEGF-conjugate@IO多功能靶向MRI探針，內(nèi)結(jié)合Fe3O4及多柔比星抗癌藥，表面標記VEGF抗體，靶向瘤區(qū)生長因子；尾靜脈給藥后1 h，腋下肝癌模型小鼠腫瘤出現(xiàn)T2負性強化，12 h強化達峰值，24 h瘤區(qū)仍見靶向負性強化存在。我們合成的靶向?qū)Ρ葎娀逯翟诮o藥后3 h、6 h負性強化作用消失，與Huang等[16]的實驗結(jié)果比，強化峰值時間較早，體內(nèi)代謝較快，這可能與對比劑體內(nèi)與靶點結(jié)合方式不同及對比劑粒徑大小等特性有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示通過化學方法構(gòu)建CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO多模態(tài)靶向分子探針，體外可靶向結(jié)合VEGF165，體內(nèi)可以VEGF165為靶點靶向MRI及熒光顯像；但活體內(nèi)是否存在毒性及其大小，還需進一步實驗證明。