鄭建華 金玉蘭 鄒澤陽(yáng)

目前的臨床病理組織蘇木精-伊紅染色(hematoxylin eosin，HE)染色處理時(shí)，通常采用含有二甲苯、含汞蘇木素的傳統(tǒng)試劑染色套液，但該試劑具有強(qiáng)烈的刺激性氣味和毒害性，人體表皮在接觸以后，會(huì)出現(xiàn)皮膚病，長(zhǎng)期接觸會(huì)引發(fā)癌癥、呼吸道感染、智力嚴(yán)重衰退、腸胃潰瘍、腹瀉、嘔吐、神志錯(cuò)亂、呼吸道衰竭、肺水腫等病害，導(dǎo)致人體產(chǎn)生易怒、焦慮、四肢抖動(dòng)及思想難以集中等不良情緒[1-2]。傳統(tǒng)試劑的廢液直接排放后，一旦流入城市的地下水道系統(tǒng)，將會(huì)破壞城市水源，若要處理后再排放則需要很高成本，醫(yī)院通常無(wú)法負(fù)擔(dān)[3]。此外，傳統(tǒng)試劑極易揮發(fā)，實(shí)際操作有難度。因此，尋找一種操作方便、無(wú)毒無(wú)公害、染色效果穩(wěn)定可靠及經(jīng)濟(jì)適用的新型HE染色試劑當(dāng)務(wù)之急。為此，本研究采用新型的環(huán)保試劑替代傳統(tǒng)試劑，并對(duì)環(huán)保試劑的染色性能進(jìn)行分析，比較新型的環(huán)保試劑與傳統(tǒng)試劑HE染色處理后的效果。

1 材料與方法

1.1 基本材料

隨機(jī)選取從2017年6月至2017年12月期間，到北京婦產(chǎn)醫(yī)院病理科進(jìn)行活檢及相關(guān)手術(shù)后遺留的100例已經(jīng)進(jìn)行過(guò)傳統(tǒng)試劑HE染色處理的病理組織片子納入觀察組，另選取2018年以來(lái)以相同的病理組織使用環(huán)保試劑進(jìn)行HE染色處理的100例片子納入對(duì)照組。觀察組采用新型的環(huán)保試劑HE染色，對(duì)照組采用傳統(tǒng)試劑HE染色。兩組病理組織均包括大網(wǎng)膜、子宮、乳房、輸卵管、卵巢、闌尾、子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜、淋巴結(jié)、平滑肌等組織，兩組基本材料無(wú)差異，具有可比性。

1.2 相關(guān)試劑

環(huán)保型HE染色試劑由北京九州柏林生物科技有限公司研發(fā)；傳統(tǒng)試劑包括的二甲苯、無(wú)水乙醇、含汞蘇木素、分化液、返藍(lán)液及伊紅等原料均為北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司出品。

1.3 HE染色方法

(1) 對(duì)照組。采用傳統(tǒng)HE染色試劑。

(2)環(huán)保HE染色試劑。采用環(huán)保型HE染色：①將觀察組病理組織標(biāo)本進(jìn)行切片，用無(wú)苯切片脫蠟液Ⅰ、Ⅱ均處理5 min，用無(wú)苯切片脫蠟液Ⅲ再處理10 min；②用無(wú)水乙醇Ⅰ處理1 min后再用無(wú)水乙醇Ⅱ處理1 min，分別用95%、85%乙醇各處理10 s；③用自來(lái)水進(jìn)行緩流清洗1 min后用蘇木素穩(wěn)定劑(高清恒染液)處理30 s，用蘇木素染色液處理9 min左右后用自來(lái)水進(jìn)行緩流清洗1 min；用0.5%的分化液處理2 s后用自來(lái)水進(jìn)行緩流清洗1 min；④用返藍(lán)染色液處理5 s后用自來(lái)水進(jìn)行緩流清洗1 min；⑤用伊紅染色液處理2 min后用自來(lái)水進(jìn)行緩流清洗5 s；⑥用85%乙醇處理5 s后再用95%乙醇處理10 s；⑦用無(wú)水乙醇Ⅰ、Ⅱ各處理10 s；⑧用無(wú)苯切片透明液I處理20 s后用無(wú)苯切片透明液Ⅱ處理1 min，用無(wú)苯切片透明液Ⅲ處理2 min；⑨濕封。

1.4 儀器設(shè)備

采用DM2000 LED型光學(xué)顯微鏡(德國(guó)Leica公司)觀測(cè)；采用UC320C(MRNN)型高清數(shù)字顯微鏡相機(jī)[艾克騰視科技(北京)有限公司]進(jìn)行CCD圖像采集。

1.5 評(píng)價(jià)指標(biāo)

(1)染色質(zhì)量進(jìn)行等級(jí)劃分。①I(mǎi)級(jí)切片，可做出準(zhǔn)確病理診斷，病理組織HE染色切片呈現(xiàn)色彩鮮艷、對(duì)比度分明、色彩滲透力強(qiáng)、呈現(xiàn)圖像快、圖像組織結(jié)構(gòu)清晰等特點(diǎn)；②Ⅱ級(jí)切片，不妨礙做出準(zhǔn)確的病理診斷，病理組織HE染色切片內(nèi)呈現(xiàn)色彩較為鮮艷、對(duì)比較為分明、色彩滲透力比較強(qiáng)、呈現(xiàn)圖像較快、圖像組織結(jié)構(gòu)比較清晰等特點(diǎn)；③Ⅲ級(jí)切片，完全不能用于病理診斷，病理組織HE染色切片內(nèi)呈現(xiàn)色彩不鮮艷、對(duì)比不分明、色彩滲透力比較弱、呈現(xiàn)圖像緩慢、圖像組織結(jié)構(gòu)模糊等特點(diǎn)。

(2)分析指標(biāo)。對(duì)比兩組病理組織的染色色彩、對(duì)比度、色彩滲透力、呈現(xiàn)圖像的速度及圖像結(jié)構(gòu)清晰程度；比較相同病理組織在不同染色試劑下的HE染色效果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以%表示，采用卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組HE染色效果色彩比較

觀察組各種病理組織的HE染色效果色彩較為鮮艷，但兩組在Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)切片中的色彩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=0.604，x2=0.533，x2=0.785；P＞0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組HE染色效果色彩的對(duì)比 [例(%)]

2.2 兩組HE染色效果對(duì)比度比較

觀察組各種病理組織的HE染色效果對(duì)比度較為分明，觀察組Ⅰ級(jí)切片共有87例，而對(duì)照組則有88例，但兩組對(duì)比度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=0.324，x2=0.001，x2=0.546；P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 兩組HE染色效果對(duì)比度的對(duì)比[例(%)]

2.3 兩組HE染色效果色彩滲透力對(duì)比

觀察組和對(duì)照組各種病理組織的HE染色效果中，色彩滲透力強(qiáng)的Ⅰ級(jí)切片分別為86%和89%，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=0.529，x2=0.001，x2=0.631；P＞0.05)，見(jiàn)表3。

表3 兩組HE染色效果色彩滲透力的對(duì)比[例(%)]

2.4 兩組圖像呈現(xiàn)速度比較

兩組病理組織HE染色效果圖像呈現(xiàn)的速度，觀察組Ⅰ級(jí)切片有84例(占84%)，對(duì)照組Ⅰ級(jí)切片有85例(占85%)，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=0.312，x2=0.268，x2=0.721；P＞0.05)，見(jiàn)表4。

2.5 兩組圖像結(jié)構(gòu)清晰程度對(duì)比

兩組各種病理組織的HE染色效果的圖像結(jié)構(gòu)均具有較高的清晰水平，其中觀察組Ⅰ級(jí)切片有87例(占87%)，對(duì)照組Ⅰ級(jí)切片有89例(占89%)，兩組對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=0.692，x2=279，x2=0.301；P＞0.05)，見(jiàn)表5。

表4 兩組HE染色效果呈現(xiàn)圖像速度的對(duì)比[例(%)]

表5 兩組圖像結(jié)構(gòu)清晰程度的對(duì)比[例(%)]

2.6 兩種試劑HE染色圖像對(duì)比

環(huán)保試劑進(jìn)行對(duì)病理組織的HE染色處理時(shí)，其色彩、對(duì)比度、滲透力、圖像呈現(xiàn)速度、圖像組織結(jié)構(gòu)清晰度等5個(gè)指標(biāo)出現(xiàn)I級(jí)質(zhì)量切片的概率和傳統(tǒng)試劑接近，環(huán)保試劑進(jìn)行HE染色圖像效果與傳統(tǒng)試劑HE染色的效果基本一致。兩組平滑肌、子宮內(nèi)膜的HE染色效果對(duì)比如圖1、圖2所示。

圖1平滑肌HE染色效果對(duì)比圖(×40)

圖2 子宮內(nèi)膜HE染色效果對(duì)比圖(×40)

3 討論

HE染色法也被稱(chēng)之為蘇木精-伊紅染色法，是石蠟切片技術(shù)里最為常用的染色法。蘇木精呈堿性，其主要功能為使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核酸質(zhì)呈紫藍(lán)色，而伊紅呈酸性，主要功能使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分呈紅色。HE染色法是組織學(xué)、胚胎學(xué)、病理學(xué)等諸多內(nèi)容的教學(xué)科研中最基本的技術(shù)方法，也是臨床上進(jìn)行病理組織活檢使用最為廣泛的手段[4-5]。

在對(duì)病理組織進(jìn)行的染色過(guò)程中，脫蠟過(guò)程的效果好壞對(duì)染色的質(zhì)量有著比較關(guān)鍵的作用。環(huán)保型HE染色試劑的無(wú)苯切片脫蠟液I、II與傳統(tǒng)試劑的二甲苯相比較，其脫蠟效果基本類(lèi)似，但具有染色時(shí)間短、基本無(wú)異味、對(duì)人體的危害和環(huán)境的破壞小等優(yōu)勢(shì)[6-8]。環(huán)保型HE染色試劑中蘇木精染液的最大特點(diǎn)是不含汞元素，能夠做到在切片組織上迅速著色，分化后流水沖洗返藍(lán)迅速，這要比傳統(tǒng)的含汞蘇木精染液的時(shí)間短，效果更好，最為重要的是，使病理技術(shù)工作人員徹底擺脫二甲苯和含汞蘇木精染液所帶來(lái)的毒害，避免接觸對(duì)人體破壞極大的劇毒物質(zhì)—黃色氧化汞[9]。同時(shí)，由于汞元素的徹底清除也極大地提高了染色液質(zhì)量的穩(wěn)定程度，從而在根源上避免人為因素和環(huán)境因素對(duì)含汞蘇木精質(zhì)量的影響，這更有利于提高對(duì)病理組織進(jìn)行HE染色處理的質(zhì)量。由于環(huán)保型HE染色試劑中不含二甲苯和汞元素，因此在更換新的試劑時(shí)不需要做過(guò)多處理。

隨著社會(huì)的發(fā)展和經(jīng)濟(jì)水平的提高，人們更注重健康的生活質(zhì)量，而對(duì)于危及身體健康的各種病害應(yīng)引起高度重視。醫(yī)院作為病毒傳染最集中的領(lǐng)域，更應(yīng)對(duì)環(huán)保及健康問(wèn)題給予高度關(guān)注。目前，在醫(yī)院以病理科為主的各科室已經(jīng)成為病毒輸出和污染環(huán)境的主要源頭。在對(duì)病理組織進(jìn)行HE染色試驗(yàn)時(shí)，以二甲苯、含汞蘇木精為主的傳統(tǒng)試劑因價(jià)格便宜，從而廣泛用于臨床和醫(yī)學(xué)試驗(yàn)上，但其缺點(diǎn)顯而易見(jiàn)，尤其是二甲苯、汞等有毒元素的危害較大。因此，尋找在HE染色時(shí)能夠替代的環(huán)保試劑，已經(jīng)成為當(dāng)前病理技術(shù)工作者、病理實(shí)驗(yàn)室工作人員等最為迫切的需求。

傳統(tǒng)試劑以二甲苯為主，這種有毒試劑不但毒害較大，一旦處理不當(dāng)還會(huì)影響診斷結(jié)果，直接排放后污染較大，經(jīng)過(guò)處理則需要耗費(fèi)大量的成本[10-11]。二甲苯的危害很強(qiáng)烈，極易揮發(fā)，對(duì)人體危害極大。會(huì)嚴(yán)重刺激人體中樞神經(jīng)和其他神經(jīng)，長(zhǎng)時(shí)間接觸會(huì)引發(fā)人頭暈?zāi)垦?、四肢無(wú)力不聽(tīng)使喚、人體免疫功能?chē)?yán)重衰退等，并有致癌風(fēng)險(xiǎn)。二甲苯對(duì)環(huán)境具有破壞性，一旦大量且未經(jīng)過(guò)任何處理的廢棄二甲苯流入城市的地下水道系統(tǒng)，將會(huì)徹底破壞城市水源。含汞蘇木精中的汞元素也有極強(qiáng)的揮發(fā)性，會(huì)對(duì)人體中樞神經(jīng)造成傷害，導(dǎo)致腸胃潰瘍、腹瀉、嘔吐、神志錯(cuò)亂、呼吸道衰竭、肺水腫及死亡等嚴(yán)重病癥，還會(huì)導(dǎo)致人產(chǎn)生易怒、激動(dòng)、善忘、害羞、沮喪、結(jié)巴、膽小、焦慮、四肢抖動(dòng)、思想難以集中等不良情緒[12]。汞元素不經(jīng)過(guò)任何處理就排放后，會(huì)使汞迅速轉(zhuǎn)化為劇毒物質(zhì)甲基汞，使蔬菜、水果及魚(yú)類(lèi)攜帶汞元素，最后極大地危害人類(lèi)[13-15]。因此，替換HE染色試劑中的二甲苯、汞等有害物質(zhì)，研發(fā)替代性的環(huán)保試劑，已經(jīng)是一種不可逆的趨勢(shì)。朱建雯[16]報(bào)道，市場(chǎng)上曾出現(xiàn)過(guò)打著環(huán)保試劑“噱頭”的產(chǎn)品，通常價(jià)格過(guò)高，或效果不佳，因此均未產(chǎn)生極大的應(yīng)用效應(yīng)，導(dǎo)致國(guó)內(nèi)醫(yī)院不得不依然使用傳統(tǒng)試劑進(jìn)行HE染色。

新型環(huán)保試劑推出后，受到了國(guó)內(nèi)許多醫(yī)院病理工作者的密切關(guān)注。本研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)保試劑完全將二甲苯、汞等有害物質(zhì)分離出去，且不易揮發(fā)、易進(jìn)行生物降解、不會(huì)造成環(huán)境污染、無(wú)毒無(wú)公害。其主要特點(diǎn)有：①在染色的各個(gè)環(huán)節(jié)均表現(xiàn)良好，不會(huì)出現(xiàn)病理組織標(biāo)本收縮等問(wèn)題；②色彩艷麗、對(duì)比分明、色彩滲透力強(qiáng)、呈現(xiàn)圖像快、圖像組織結(jié)構(gòu)清晰，與傳統(tǒng)的HE染色試劑的染色效果基本一致；③廢液易處理回收，無(wú)毒無(wú)污染；④使病理科活檢成本降低，減輕了病患和醫(yī)院的負(fù)擔(dān)；⑤有效地防止了醫(yī)院病理科工作人員及高校病理實(shí)驗(yàn)室人員遭受到有毒物質(zhì)的襲擾。

環(huán)保試劑與傳統(tǒng)試劑相比，具有染色效果科學(xué)及良好、無(wú)毒無(wú)公害、高效省力、低碳排放保護(hù)環(huán)境、降低活檢成本以及減輕病患和醫(yī)院的負(fù)擔(dān)等優(yōu)點(diǎn)。

環(huán)保試劑在臨床的病理組織活檢和相關(guān)病理研究中，有著較高的創(chuàng)新價(jià)值和實(shí)用價(jià)值，不僅其染色效果可靠、穩(wěn)定，而且無(wú)毒無(wú)公害，完全可以代替以二甲苯、含汞蘇木精為主要成分的傳統(tǒng)試劑，是一種值得推廣的試劑。