趙亞卓，王 鑫，馮佳佳，孫丹丹，王鳳茹，董金皋

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北省植物生理和分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071001)

START(The lipid/sterol-binding StAR-related lipid transfer protein domains)結(jié)構(gòu)域廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中，此結(jié)構(gòu)域調(diào)控著磷脂運(yùn)輸和脂質(zhì)代謝。在人類和動(dòng)物很多蛋白質(zhì)中含有START結(jié)構(gòu)域，與疾病的發(fā)生密切相關(guān)；在植物中START結(jié)構(gòu)域往往和其他植物特有的結(jié)構(gòu)域同時(shí)存在于一個(gè)蛋白質(zhì)中，調(diào)控著植物各個(gè)生長發(fā)育過程，如ATML1(A.thalianaMERISTEM LAYER1)在皮層的發(fā)育過程中起重要的調(diào)控作用[1]，PDF2(PROTODERMAL FACTOR2)可調(diào)控花器官的形成[2]，GL2(GLABRA2)調(diào)控表皮毛的生長[3]。ATML1、PDF2和GL2均屬于START結(jié)構(gòu)域蛋白家族中的HD-ZLZ START(Homeodomain zipper-loop-zipper StAR-related lipid transfer)亞家族，這類亞家族成員屬于轉(zhuǎn)錄因子，START結(jié)構(gòu)域在這些轉(zhuǎn)錄因子中的作用類似于動(dòng)物中的甾醇類激素受體，通過結(jié)合脂類或甾醇類物質(zhì)來調(diào)控轉(zhuǎn)錄過程。擬南芥中含START結(jié)構(gòu)域家族成員共35個(gè)，但已知功能的僅有9個(gè)，均為轉(zhuǎn)錄因子家族[4]。在START結(jié)構(gòu)域家族中，還有PH-START(Pleckstrin homology StAR-related lipid transfer)亞家族，但此亞家族成員在調(diào)控植物生長發(fā)育方面的功能還未見報(bào)道。

擬南芥中PH-START蛋白亞家族由At4g19040、At5g45560、At3g54800、At2g28320 4個(gè)成員組成。除有研究發(fā)現(xiàn)At4g19040突變體可增強(qiáng)擬南芥對(duì)白粉菌(Erysiphecichoracearum)的抗性外[5]，此亞家族成員對(duì)擬南芥生長發(fā)育的調(diào)控作用未見報(bào)道。PH(Pleckstrin homology)結(jié)構(gòu)域首先在普雷克底物蛋白中識(shí)別，大約含有120個(gè)氨基酸殘基，是血小板中蛋白激酶C(PKC)的主要底物[6-7]。PH結(jié)構(gòu)域是很多與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)結(jié)合的第二信使蛋白質(zhì)所具有的結(jié)構(gòu)域。已證實(shí)PH結(jié)構(gòu)域參與了細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞骨架組成、膜磷脂的轉(zhuǎn)運(yùn)和修飾[8-9]。在人類基因組中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了252 種蛋白質(zhì)含有不同結(jié)構(gòu)的PH結(jié)構(gòu)域[10]，在釀酒酵母中，有33種蛋白質(zhì)具有不同結(jié)構(gòu)的PH結(jié)構(gòu)域[11]。迄今為止，一些PH結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)已經(jīng)通過核磁共振和X射線獲得，盡管不同PH結(jié)構(gòu)域之間的序列相似性很低，但其三維結(jié)構(gòu)卻具有顯著的保守性[12]。雖然已經(jīng)在不同基因組中識(shí)別了大量的PH結(jié)構(gòu)域，但PH結(jié)構(gòu)域的功能尚不清楚[13]。PH結(jié)構(gòu)域首次被識(shí)別時(shí)，認(rèn)為是一個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)合域，并且可以識(shí)別蛋白質(zhì)配體，例如異源三聚體G蛋白的β/γ亞基、WD40重復(fù)蛋白和酪氨酸激酶等[14]。然而，PH結(jié)構(gòu)域最顯著的功能是它們與磷脂(例如磷酸肌醇或肌醇磷脂酸)結(jié)合的能力[15]，與磷酸肌醇類物質(zhì)的結(jié)合可以使具有PH結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)對(duì)脂類細(xì)胞信使做出反應(yīng)，從而轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)上。蛋白磷脂酶C(PLC)家族具有PH結(jié)構(gòu)域，PLC酶是存在于胞漿膜上的一個(gè)關(guān)鍵酶，可以水解磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)，產(chǎn)生1,4,5-磷酸三肌醇和二酰甘油2個(gè)第二信號(hào)分子，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的Ca2+釋放和激活蛋白激酶C[15]。

本研究以PH-START亞家族成員At2g28320(命名為PH-START1)作為研究對(duì)象，分析其時(shí)空表達(dá)特性，探究其在擬南芥生長發(fā)育中的作用，為更好地促控植物生長發(fā)育、提高作物產(chǎn)量提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana)：Columbia(Col-0)，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物生理和分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室種植；擬南芥PH-START1(At2g28320)基因的T-DNA插入突變體(SALK-060171、SALK-120376)，購自美國ABRC(ArabidopsisBiological Resource Center)突變體庫。擬南芥生長培養(yǎng)條件為：溫度22 ℃，光周期16 h光照/8 h黑暗。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1PH-START1基因表達(dá)量分析 為研究PH-START1基因在擬南芥的時(shí)空表達(dá)情況，以Col-0野生型為材料，分別以根、莖、不同位置的蓮座葉、不同花期的花、授粉后不同時(shí)間的角果為材料，提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，利用Real-time PCR分析PH-START1基因的表達(dá)情況。

1.2.2PH-START1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得 以PH-START1基因的CDS序列和擬南芥過表達(dá)載體pSN1301的MCS分析其酶切位點(diǎn)并選定為BamH Ⅰ和KpnⅠ，以野生型擬南芥的cDNA作為模板，擴(kuò)增PH-START1目的序列。對(duì)PCR擴(kuò)增得到的目的片段經(jīng)膠回收后與克隆載體pMD19-T Vector連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，對(duì)篩選得到的陽性克隆菌液檢測(cè)并測(cè)序，將測(cè)序正確的菌液提取質(zhì)粒，雙酶切回收目的條帶，然后與載體片段連接、轉(zhuǎn)化、驗(yàn)證。將最終得到的含有目的基因的過表達(dá)載體命名為pSN1301-PH-START1。用電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，利用花絮侵染法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，抗生素篩選陽性苗[16]，并用Real-time PCR進(jìn)行基因表達(dá)量的驗(yàn)證。

1.2.3PH-START1T-DNA插入突變體的獲得 將購買的PH-START1基因突變體種子播種在含有Kan抗性的MS平板上(Kan：100 mg/L)篩選，選取葉片鮮綠下胚軸較長的植株移栽，收獲種子繼續(xù)篩選并進(jìn)行驗(yàn)證。

三引物法：提取T3不再出現(xiàn)分離的突變體植株幼苗和野生型擬南芥的DNA，以T-DNA Primer Design(http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html)設(shè)計(jì)插入位點(diǎn)上下游的引物L(fēng)P、RP，以LBb1作為T-DNA特異引物，通過瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證T-DNA插入位點(diǎn)。

PH-START1基因表達(dá)量驗(yàn)證：提取28 d的Col-0野生型擬南芥和PH-START1突變體植株的RNA，反轉(zhuǎn)錄后用SqRT-PCR和Real-time PCR 驗(yàn)證PH-START1基因的表達(dá)情況。

1.2.4 擬南芥葉面積的測(cè)定 將生長環(huán)境完全一致的野生型和突變體植株相同部位的葉片展平，用Image J軟件測(cè)量葉片的面積，野生型和突變體各測(cè)量30個(gè)葉片。

2 結(jié)果與分析

2.1 PH-START1時(shí)空表達(dá)分析

分別提取野生型擬南芥不同生長時(shí)期的根、莖、蓮座葉、花、角果的總RNA并反轉(zhuǎn)錄，然后利用Real-time PCR分析PH-START1基因的表達(dá)量(圖1)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在擬南芥的各個(gè)器官中均有PH-START1基因的表達(dá)，在葉中表達(dá)最多，然后依次是根、花、角果和莖，且在各個(gè)器官中的表達(dá)差異達(dá)極顯著水平(圖1-A)；從子葉期到幼苗期，根中PH-START1基因的表達(dá)量極顯著上升，但到成苗期根中PH-START1的表達(dá)無顯著改變(圖1-B)；對(duì)第2，4，6，8，10片蓮座葉中PH-START1的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，每片蓮座葉中均有PH-START1的表達(dá)，在第6片蓮座葉中的表達(dá)量最高，其次是第2片蓮座葉，在第8，10片蓮座葉中表達(dá)量最低(圖1-C)；授粉后的角果中PH-START1均有表達(dá)，授粉后第5天(5DAP)的角果中PH-START1表達(dá)量極顯著高于3 d的角果，而在以后時(shí)期角果的表達(dá)量更低(圖1-D)；比較不同花期的花中PH-START1表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)隨著花的發(fā)育，花中PH-START1表達(dá)量逐漸增高，差異均達(dá)極顯著水平(圖1-E)；比較花器官中花萼、花瓣、雄蕊、雌蕊PH-START1基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)雄蕊中PH-START1的表達(dá)量最高(差異極顯著)、其次是花瓣和萼片，而雌蕊中最少，差異達(dá)極顯著水平(圖1-F)。

不同小寫和大寫字母分別表示5%和1%水平差異顯著。圖9同。Different small and capital letters indicate 5% and 1% significant level respectively.The same as Fig.9.

2.2 PH-START1過表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)PH-START1CDS序列引物擴(kuò)增得到PH-START1CDS序列，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在2 214 bp處得到單一條帶，與PH-START1片段大小一致(圖2-A)。回收目的條帶，并與克隆載體pMD19-T vector 16 ℃連接1 h，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，PCR檢測(cè)陽性菌落(圖2-B)。選擇陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，并提取測(cè)序正確的陽性克隆質(zhì)粒，用BamH Ⅰ和KpnⅠ對(duì)其雙酶切(圖2-C)，回收目的片段。目的片段與pSN1301載體片段用T4DNA Ligase在16 ℃過夜連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α后對(duì)陽性克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)(圖2-D)。將陽性克隆用BamH Ⅰ和KpnⅠ進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，得到PH-START1目的條帶(圖2-E)，表明PH-START1過表達(dá)載體構(gòu)建成功，命名為35S∶pSN1301-PH-START1。將構(gòu)建好的35S∶pSN1301-PH-START1轉(zhuǎn)化GV3101，用基因序列引物檢測(cè)陽性克隆，得到PH-START1基因目的條帶(圖2-F)，說明構(gòu)建好的過表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101中。

A.PH-START1基因擴(kuò)增；B.陽性克隆PCR檢測(cè)；C.pMD19-PH-START1雙酶切驗(yàn)證；D.pSN1301-PH-START1的PCR檢測(cè)；E.35S∶pSN1301-PH-START1雙酶切驗(yàn)證；F.35S∶pSN1301-PH-START1轉(zhuǎn)化GV3101后PCR檢測(cè)。M.5 kb Marker；1-3.目的條帶。

A.PH-START1gene amplification; B. Positive clone detection by PCR; C.pMD19-PH-START1double enzyme digestion test; D. pSN1301-PH-START1PCR detection; E.35S∶pSN1301-PH-START1double enzyme digestion test; F.PCR detection of pSN1301-PH-START1transformation into GV3101. M. 5 kb Marker; 1-3. Target band.

圖2PH-START1過表達(dá)載體的構(gòu)建
Fig.2 Construction ofPH-START1overexpressing vector

2.3 過表達(dá)PH-START1轉(zhuǎn)基因擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化和篩選

用花絮侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥，將轉(zhuǎn)化得到的種子經(jīng)抗性篩選(圖3-A)，得到T3純合株系，提取純合株系DNA，可以擴(kuò)增出目的條帶(圖3-B)，說明過表達(dá)PH-START1轉(zhuǎn)基因擬南芥創(chuàng)制成功。

2.4 過表達(dá)擬南芥植株中PH-START1的表達(dá)量分析

為了解PH-START1過表達(dá)擬南芥中PH-START1的表達(dá)情況，從得到的陽性植株中選取了2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后對(duì)PH-START1基因進(jìn)行SqRT-PCR分析(圖4)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2個(gè)轉(zhuǎn)基因植株中pH-START1的表達(dá)量均高于野生型植株，表明確實(shí)為PH-START1過表達(dá)株系，將其分別命名為OE1、OE2。

A.潮霉素平板上轉(zhuǎn)基因陽性苗的篩選；B.PCR檢測(cè)35S∶pSN1301-PH-START1轉(zhuǎn)基因陽性純合株系。M.2 kb Marker；1-2.WT對(duì)照；3-4.目的條帶。

A.Screening of transgenic positive seedlings on the hygromycin plate; B.PCR detection of the35S∶pSN1301-PH-START1transgenic positive homozygous lines. M.2 kb Marker;1-2.Control;3-4.Objective stripe.

圖3 過表達(dá)PH-START1轉(zhuǎn)基因陽性苗的篩選與純合驗(yàn)證
Fig.3 Screening and homozygous validation of35S∶pSN1301-PH-START1overexpression transgenic positive seedlings

2.5 PH-START1缺失突變體轉(zhuǎn)基因擬南芥的創(chuàng)制

2.5.1PH-START1T-DNA插入突變體插入位點(diǎn)分析 由ABRC突變體庫購得擬南芥PH-START1的2株不同T-DNA插入位點(diǎn)突變體，其編號(hào)分別為SALK_060171、SALK_120376。通過擬南芥數(shù)據(jù)庫TAIR網(wǎng)站，得到其插入位點(diǎn)(圖5)，箭頭所指的位置及方向就是載體插入的位置及方向。SALK_060171插入位置在起始密碼子ATG后205 bp的位置，將之命名為ph-start1-1，SALK_120376插入位置在起始密碼子ATG前534 bp的位置，將之命名為ph-start1-2，背景為 Col-0 野生型擬南芥。

圖5 ph-start1突變體中T-DNA插入位點(diǎn)示意圖Fig.5 The T-DNA insertion sites in ph-start1 mutant

提取T3不再出現(xiàn)分離比的突變體植株幼苗和野生型擬南芥的DNA，以T-DNA Primer Design設(shè)計(jì)插入位點(diǎn)上下游的引物L(fēng)P、RP，以LBb1作為T-DNA特異引物，通過瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證T-DNA插入位點(diǎn)。結(jié)果表明(圖6)，ph-start1-1和ph-start1-2株系為T-DNA插入突變體純合株系。

M.2 kb Marker；1.以LBb1和RP為引物；2.以LP和RP為引物。M.2 kb Marker; 1.LBb1 and RP as primers; 2.LP and RP as primers.

2.5.2 T-DNA插入突變體中PH-START1的表達(dá)量分析 為了解PH-START1T-DNA插入突變體中PH-START1表達(dá)情況，提取野生型擬南芥和ph-start1突變體幼苗RNA，用SqRT-PCR技術(shù)分析PH-START1基因的表達(dá)情況(圖7)，結(jié)果表明ph-start1-1和ph-start1-2無PH-START1表達(dá)，說明確實(shí)為PH-START1功能缺失突變體。

圖7 SqRT-PCR技術(shù)分析PH-START1 T-DNA插入突變體中PH-START1的表達(dá)量Fig.7 Expression analysis of PH-START1 by SqRT-PCR in PH-START1 T-DNA insertion mutants

2.6 PH-START1 轉(zhuǎn)基因擬南芥表型分析

將收獲的Col-0野生型擬南芥、PH-START1-OE、缺失突變體擬南芥種子播種在培養(yǎng)基中，放置于培養(yǎng)室相同環(huán)境下培養(yǎng)，觀察各時(shí)期生長發(fā)育情況(圖8)。發(fā)現(xiàn)播種12 d，Col-0野生型擬南芥為四葉期而OE轉(zhuǎn)基因擬南芥已到達(dá)六葉期，OE植株明顯較野生型大；播種25 d，OE生長發(fā)育已變得遲緩，植株明顯小于野生型；播種40 d，OE轉(zhuǎn)基因擬南芥各個(gè)器官的生長發(fā)育都明顯小于野生型。ph-start1無論是在四葉期還是在營養(yǎng)生長時(shí)期的生長發(fā)育都略優(yōu)于野生型。綜上所述，PH-START1對(duì)擬南芥的生長發(fā)育起著重要的調(diào)控作用。

A.擬南芥四葉期植株表型對(duì)比(播種12 d)；B.擬南芥四葉期植株表型對(duì)比(播種10 d)；C-D.在同樣正常的環(huán)境條件下，Col-0野生型和OE表型對(duì)比(播種25 d)；E.Col-0野生型和ph-start1表型對(duì)比(播種30 d)；F.Col-0野生型和OE表型對(duì)比(播種40 d)。

A.Phenotypic comparison of 4-leaf stage ofArabidopsis(12 d after sown); B.Phenotypic comparison of 4-leaf stage ofArabidopsis(10 d after sown); C-D.Phenotypic comparison of Col-0 wild type andOE(25 d after sown) under the same normal environmental conditions; E.Phenotypic comparison of Col-0 wild type andph-start1(30 d after sown); F.Phenotypic comparison of Col-0 wild type andOE(40 d after sown).

圖8PH-START1功能獲得和缺失轉(zhuǎn)基因擬南芥表型分析
Fig.8 Phenotypic analysis ofPH-START1transgenicArabidopsiswith functional acquisition and loss

A-B.OE擬南芥葉片的表型； C-D. ph-start1擬南芥葉片的表型；E.OE葉面積統(tǒng)計(jì)；F.ph-start1葉面積統(tǒng)計(jì)。A-B.OE Arabidopsis leaves phenotype; C-D.ph-start1 Arabidopsis leaves phenotype; E.Comparison of leaf area of OE Arabidopsis;F.Comparison of leaf area of ph-start1 Arabidopsis.

觀察相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的OE和ph-start1的全部蓮座葉，選擇同一部位的蓮座葉進(jìn)行葉面積和葉柄長度的測(cè)定(圖9)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，OE的葉片極顯著變小，葉面積為0.11，0.12 cm2，只占對(duì)照的4.89%，5.33%；ph-start1的葉片極顯著變大，葉面積為2.94，3.05 cm2，占對(duì)照的142%，148%。表明PH-START1的過量表達(dá)嚴(yán)重影響了擬南芥葉片的發(fā)育，PH-START1表達(dá)量的下降可以促進(jìn)葉片的發(fā)育。

3 討論

擬南芥中PH-START1含有PH-START結(jié)構(gòu)域，PH結(jié)構(gòu)域首次被鑒定時(shí)認(rèn)為是蛋白質(zhì)結(jié)合域，現(xiàn)多參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞骨架組織、膜轉(zhuǎn)運(yùn)和磷脂修飾[17-18]。START結(jié)構(gòu)域首次被發(fā)現(xiàn)是在急性調(diào)節(jié)蛋白中，它是一個(gè)與脂類和甾醇類物質(zhì)結(jié)合相關(guān)的結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)將急性調(diào)節(jié)蛋白中的膽固醇轉(zhuǎn)移到線粒體內(nèi)膜[19-20]。在擬南芥中含START結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)家族共有35個(gè)成員，其中21個(gè)被融合在同源異型結(jié)構(gòu)域中，此現(xiàn)象表明START結(jié)構(gòu)域在植物的生長發(fā)育過程中起到了重要的作用[21-22]。隨著擬南芥的生長發(fā)育，PH-START1在各個(gè)組織中均有不同程度的表達(dá)，根中主要在幼苗期表達(dá)量較高，蓮座葉中主要在生長的第6片蓮座葉表達(dá)量較高，花中主要在15花期表達(dá)量較高，角果中主要在授粉后5 d表達(dá)量較高，在花器官發(fā)育過程中，相對(duì)萼片、花瓣和雌蕊而言，雄蕊中PH-START1的表達(dá)量最高。

植物的生長周期分為2個(gè)階段即營養(yǎng)生長階段和生殖生長階段。營養(yǎng)生長是生殖生長的基礎(chǔ)，根系的發(fā)達(dá)才能從周圍土壤中吸收大量的水分和營養(yǎng)物質(zhì)，通過軸向和徑向運(yùn)輸傳遞給莖和葉，使其茁壯生長，可以有效地抵制各種生物和非生物脅迫，并且為生殖生長做好準(zhǔn)備。與野生型相比，過表達(dá)PH-START1擬南芥主根短、主莖細(xì)弱、蓮座葉小，ph-start1的主根較長、主莖較粗、蓮座葉大。PH-START1表達(dá)量的升高嚴(yán)重抑制了擬南芥的發(fā)育，說明PH-START1在擬南芥生長發(fā)育中起著負(fù)調(diào)控作用。至于PH-START1負(fù)調(diào)控?cái)M南芥生長發(fā)育的分子機(jī)制，還需要對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組及互作蛋白進(jìn)行分析，建立植物生長發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，闡明植物生長發(fā)育調(diào)控機(jī)制。