呂艷艷，魏小春，趙艷艷，原玉香，王志勇，楊雙娟，鄭小蘭，姜 俊，李 艷，張夢園，姚秋菊，張 強，張曉偉

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所, 河南 鄭州 450002; 2.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 河南 鄭州 450001;3.駐馬店市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 駐馬店 463000)

Whirly基因家族的蛋白質(zhì)成員在整個植物界中都存在，主要定位于線粒體和葉綠體中，具有和單鏈DNA結(jié)合的能力[1]。Desveaux等[2]在2000年從馬鈴薯中分離出的PBF-2轉(zhuǎn)錄因子是第一個Whirly基因家族成員，它和cDNA編碼的蛋白質(zhì)都以序列特異性的方式與誘導(dǎo)子響應(yīng)元件 (Elicitor response element)單鏈形式結(jié)合。

Desveaux等[3]在2005年研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥和馬鈴薯中的Whirly轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)節(jié)防御基因表達的作用，其可能在防御反應(yīng)以外的過程中發(fā)揮作用，并可能在葉綠體和核中起作用。Whirly蛋白在細胞核內(nèi)參與水楊酸(SA)依賴的抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，Desveaux等[4]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中StWhy1同源基因AtWHY1的DNA結(jié)合活性由SA誘導(dǎo)，并且是SA依賴的抗病性和SA誘導(dǎo)的系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)響應(yīng)基因表達所需的。Whirly蛋白家族能夠調(diào)節(jié)端粒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，擬南芥AtWHY1被鑒定為一個新的端粒末端結(jié)合蛋白，在調(diào)節(jié)擬南芥端粒的穩(wěn)態(tài)中能夠發(fā)揮作用，主要表現(xiàn)在：在AtWHY1缺陷型植株中端粒延長，端粒酶活性增加；在含有AtWHY1的轉(zhuǎn)基因植物中端粒酶活性降低，端?？s短[5]。Whirly蛋白在質(zhì)體內(nèi)能夠維持質(zhì)體基因組的穩(wěn)定，調(diào)節(jié)質(zhì)體基因的表達。Marechal等[6]發(fā)現(xiàn)，Whirly單鏈DNA結(jié)合蛋白在維持擬南芥質(zhì)體基因組穩(wěn)定方面起到重要的作用。Cappadocia等[7]的研究結(jié)果表明，Whirly蛋白與單鏈DNA的結(jié)合有助于準確修復(fù)斷裂的雙鏈DNA。

辣椒(CapsicumannuumL.)是茄科辣椒屬的1年生或多年生草本植物，是世界上種植面積最廣的香料作物，目前辣椒的全基因組測序和物理圖譜已經(jīng)完成[8]。目前國內(nèi)外對Whirly基因家族的研究主要以擬南芥為對象，針對Whirly蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進行研究，而對于辣椒Whirly基因家族的研究還沒有詳細報道。為此，利用生物信息學(xué)的方法，對辣椒CM334基因組中Whirly基因家族的全部序列進行鑒定分析，并利用熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測了CM334中Whirly基因在逆境脅迫下的表達情況，為進一步研究Whirly基因家族在辣椒生長發(fā)育中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

所用辣椒材料CM334由韓國首爾國立大學(xué)饋贈。辣椒培養(yǎng)條件參考文獻[9-10]。當辣椒幼苗有6～8片真葉展開時按如下方法處理。

脫落酸(ABA)和茉莉酸甲酯(MeJA)處理：用脫落酸(100 μmol/L)和茉莉酸甲酯(200 μmol/L)分別噴灑辣椒葉片的正反面，以噴灑無菌水作為對照。

高溫處理(Heat)：對辣椒葉片進行高溫處理，白天溫度設(shè)置為(42±2)℃，晚上設(shè)置為(35±2)℃。對照組白天溫度設(shè)置為28 ℃，晚上設(shè)置為26 ℃[11]。

低溫處理(Cold)：預(yù)先將光照培養(yǎng)箱的溫度降至5 ℃(晝)/0 ℃(夜)，隨后將辣椒苗放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對照組培養(yǎng)溫度與高溫處理對照組相同。

疫病(YB)處理：將辣椒幼苗的根置于用Hoagland′s培養(yǎng)液配制的病原菌(來自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)毛莊實驗基地)孢子懸浮液中，以無菌水作對照。28 ℃保濕24 h后，在溫度28 ℃、相對濕度70%～90%條件下培養(yǎng)。

上述處理的辣椒植株在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的光照強度均為160 μmol/(m2·s)，光周期均為12 h光/12 h暗。

1.2 辣椒Whirly基因家族成員的鑒定

將Whirly(pfam:PF08536)(http://pfam.xfam.org/)[12]的保守結(jié)構(gòu)域在辣椒基因組數(shù)據(jù)庫PGP(http://peppergenome.snu.ac.kr/，CM334蛋白)中進行Blast比對，獲得的所有候選序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information)中進行Blast 比對。利用在線分析工具ProtParam (http://web.sxpasy.org/protparam/)分析候選氨基酸序列的等電點及分子質(zhì)量[13]。

1.3 基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)基序分析

以候選Whirly家族成員的CDS序列和基因序列為參照，通過在線GSDS 2.0(Gene Structure Display Server，http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)進行基因結(jié)構(gòu)分析[14]。分析時將CDS序列和基因序列都轉(zhuǎn)換成FASTA格式，還要保持同一基因2種序列的對應(yīng)。用MEME Suite 4.12.0在線軟件(http://meme-suite.org/tools/meme)對Whirly家族蛋白質(zhì)基序進行鑒定。

1.4 系統(tǒng)進化樹分析

Whirly家族蛋白質(zhì)全長序列用ClustalW進行多序列比對，ClustalW比對參數(shù)如下?？瘴涣P分：10；空位延伸罰分：0.2；蛋白質(zhì)重量矩陣：gonnet；殘留特定的罰分：開；親水罰分：開；間隙分隔距離：4；末端間隙分割：關(guān)閉；負矩陣：關(guān)閉；延伸分歧截止：30%。比對后Whirly蛋白序列用MEGA 7.0軟件，使用鄰近法構(gòu)建進化樹，其中校驗參數(shù)Bootstrap值設(shè)置為1 000次重復(fù)。

1.5 辣椒Whirly基因組織表達模式分析

在辣椒參考基因組(https://www.nature.com/articles/ng.2877)中獲取CM334 RNA-seq數(shù)據(jù)，利用HemI繪制Whirly基因在辣椒不同組織和果實發(fā)育中的表達熱圖。

1.6 辣椒總RNA的提取及cDNA第1鏈的合成

總RNA提取采用TaKaRa MiniBeST Plant RNA Extraction Kit (TaKaRa, Inc., Dalian, China)試劑盒，按照說明書進行操作。cDNA第1鏈合成采用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa, Inc., Dalian, China)。

1.7 辣椒Whirly基因家族表達分析

采用qRT-PCR分析，引物見表1。反應(yīng)體系為20.0 μL，其中cDNA為2.0 μL，上、下游引物均為1.0 μL，2×SYBR?Premix Ex TaqTM(TliRNaseH Plus) 10.0 μL以及ddH2O 6.0 μL。設(shè)置程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)40次[9]。采用2-ΔΔCT法計算基因相對表達量[15]。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 qRT-PCR primer sequences

表2 Whirly基因家族成員鑒定結(jié)果Tab.2 Whirly family member identification list

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒Whirly基因家族成員的鑒定

以擬南芥的Whirly蛋白氨基酸序列為查詢序列進行BlastP相似性檢索，共鑒定了26個單子葉(短柄草、谷子)和雙子葉(辣椒、擬南芥、甘藍、黃瓜、大豆、番茄、葡萄)的Whirly基因家族成員(表2)，其中辣椒CM334的Whirly基因有2個，分別為CaWHY1和CaWHY2。從表2可知，除了BdWHY1(pI=8.98)、CaWHY1(pI=6.84)、GmWHY1.c(pI=5.54)外，其他Whirly蛋白的等電點均在9.50左右。除CaWHY1和GmWHY1.c的分子質(zhì)量分別為17.35,14.27 ku之外，其余Whirly蛋白的分子質(zhì)量均在24.08～38.97 ku。

2.2 辣椒Whirly基因結(jié)構(gòu)分析

通過GSDS基因結(jié)構(gòu)分析可知，辣椒Whirly基因家族中CaWHY1有5個外顯子、4個內(nèi)含子，CaWHY2有7個外顯子、6個內(nèi)含子，CaWHY2和SlWHY2的基因結(jié)構(gòu)完全一樣(圖1)。從圖1還可以看出，除GmWHY1.c有2個內(nèi)含子外，其他Whirly基因都有多個內(nèi)含子(4～8個)。

圖1 26個Whirly家族基因結(jié)構(gòu)分析Fig.1 Structure analysis of 26 Whirly family genes

圖2 26個Whirly蛋白保守基序分布Fig.2 Motif distribution of 26 Whirly proteins

2.3 辣椒Whirly蛋白保守基序分析

為了研究Whirly轉(zhuǎn)錄因子之間結(jié)構(gòu)的多樣性，利用MEME Suite 4.12.0 在線工具對26個不同物種的Whirly蛋白進行保守基序分析[16]。如圖2所示，在Whirly家族中鑒定出3個保守基序。之前有研究報道表明，Whirly蛋白有3個結(jié)構(gòu)域：N末端結(jié)構(gòu)域、Whirly結(jié)構(gòu)域和C末端多變區(qū)[17]。通過基序分析發(fā)現(xiàn)，Whirly基因家族在進化上結(jié)構(gòu)具有保守性。

2.4 辣椒Whirly蛋白系統(tǒng)進化樹分析

為更好地分析辣椒Whirly基因家族的進化，構(gòu)建了辣椒、擬南芥、短柄草、甘藍、黃瓜、大豆、谷子、番茄和葡萄的Whirly蛋白系統(tǒng)進化樹(圖3)。根據(jù)進化樹的聚類結(jié)果，26個不同物種的Whirly蛋白明顯分為3類：Class Ⅰ、 Class Ⅱ、Class Ⅲ。幾乎所有的Whirly1屬于Class Ⅰ，Whirly2屬于Class Ⅱ，Whirly3屬于Class Ⅲ。CaWHY1和SlWHY1聚在一起，CaWHY2和SlWHY2聚在一起，辣椒和番茄都屬于茄科植物，其基因在功能上也有相似之處。同時，可以明顯看出單子葉植物和雙子葉植物分別聚在一起，表明單子葉和雙子葉植物的Whirly基因在進化上有差異。

●.雙子葉植物；□.單子葉植物?！?Dicotyledon;□.Monocotyledon.

2.5 辣椒Whirly基因時空表達分析

為了探究Whirly基因在辣椒不同組織及果實發(fā)育中的作用，利用CM334的RNA-seq數(shù)據(jù)繪制了Whirly基因家族在4個組織(根、莖、葉和果實)以及7個果實發(fā)育時期的熱圖(圖4)。結(jié)果顯示，CaWHY1和CaWHY2在不同組織中的表達量有差異，CaWHY2在根、莖和葉中均表達，CaWHY1在根、莖、葉中表達量卻很低。同時，在果實發(fā)育中CaWHY1表達量也很低。

圖4 Whirly基因在辣椒不同組織和果實發(fā)育中的表達模式Fig.4 Expression analysis of pepper Whirly genes in different tissues and fruit development

2.6 辣椒Whirly基因家族脅迫響應(yīng)表達分析

利用qRT-PCR分析了辣椒CM334中的Whirly基因家族在逆境脅迫下的表達情況(圖5)。辣椒的CaWHY1基因表達量在疫病脅迫下變化最為明顯， 0～2 h急劇上升，2 h時達到最大值，為對照的4.5倍，隨后表達量逐漸下降，24 h時下降到最小值，24～48 h又逐漸上升，48 h時其表達量為對照的1.8倍。CaWHY1在高溫處理條件下，24 h時表達量達到最大值。在脫落酸、低溫處理、茉莉酸甲酯脅迫下CaWHY1的表達量變化幅度相對不大。

CaWHY2在疫病和高溫處理條件下的表達量變化最為明顯，其中疫病脅迫下，在2 h 時其表達量達到最高值，為對照的2.3倍，隨后逐漸降低，在12 h之后緩慢降低有趨于穩(wěn)定之勢，但最后表達量較對照有所下降。CaWHY2在高溫處理條件下，2 h時其表達量上升至對照的1.7倍，6 h時又顯著下降，之后逐漸上升，在24 h時表達量達到最大值，為對照的2.1倍，之后又逐漸下降，48 h時下降至對照的1.6倍。CaWHY2在脫落酸和低溫處理條件下的表達模式相反，即當脫落酸脅迫下的表達量上升時，低溫處理條件下的表達量下降，但脫落酸和低溫處理條件下表達量的變化幅度不同。CaWHY2在茉莉酸甲酯處理條件下，0～2 h有不明顯的上升，之后逐漸下降，24 h時降至最低值，約為對照的1/2，24～48 h逐漸上升，48 h時達到最大表達量，為對照的1.7倍。

圖5 辣椒Whirly基因家族響應(yīng)脅迫的qRT-PCR分析Fig.5 qRT-PCR analysis of pepper Whirly gene family reacting to stress

3 結(jié)論與討論

Whirly基因家族在雙子葉和單子葉植物中均有發(fā)現(xiàn)。本研究在辣椒CM334中鑒定了CaWHY1和CaWHY22個Whirly基因，其中CaWHY2和番茄SlWHY2的基因結(jié)構(gòu)完全一樣，均有7個外顯子、6個內(nèi)含子，在進化樹中CaWHY2和SlWHY2也是聚在一起，這可能是由于辣椒和番茄均屬于茄科，親緣關(guān)系較密切[18]。對蛋白質(zhì)基序分析發(fā)現(xiàn)，Whirly蛋白在植物中高度保守，含有3個保守的基序。Whirly基因表達模式分析表明，CaWHY1和CaWHY2在不同組織和果實發(fā)育時期的表達水平存在差異。在脫落酸、低溫處理、高溫處理、茉莉酸甲酯和疫病處理條件下，CM334的Whirly基因均有表達。在疫病處理下，CaWHY2和CaWHY1表達量均增加，其中CaWHY1基因的表達量較CaWHY2增加更明顯。CaWHY2基因在脫落酸和低溫處理條件下表達量的變化趨勢相反。

Whirly轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長發(fā)育過程中起到很重要的作用[19]。另有研究證明，Whirly轉(zhuǎn)錄因子在葉綠體和細胞核中也發(fā)揮一定作用[20]。本研究對辣椒Whirly基因表達模式分析表明，Whirly基因家族在辣椒的生長發(fā)育中起調(diào)控作用。植物需要適應(yīng)不利的環(huán)境條件，包括生物和非生物脅迫[21-22]。楊洋等[23]研究發(fā)現(xiàn)，Whirly轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)對低溫脅迫中發(fā)揮作用。本研究中，Whirly基因在各種脅迫處理下的表達量變化再次證明，Whirly基因在多種生物和非生物抗性反應(yīng)中起重要作用。

Whirly基因在植物界中廣泛存在，在其他物種尤其是擬南芥中Whirly基因的研究較為詳細，但是有關(guān)辣椒Whirly基因的報道卻較少。本研究鑒定了辣椒CM334中的Whirly基因，對其結(jié)構(gòu)、進化關(guān)系、保守基序和表達模式進行了初步分析，并對其在逆境脅迫下的表達量變化進行了分析，為進一步研究Whirly基因在辣椒中的功能奠定了基礎(chǔ)。