李秀鈺，賀付蒙，韓瑛琪，趙瀟璨，武佳文，朱元芳，周 磊，石奇海，馮 哲，李鳳蘭

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

馬鈴薯(Solanumtuberosum)在中國的糧食作物中扮演著重要的角色，出現(xiàn)在人類四季的飲食中。因此，馬鈴薯需要進行較長時間的窖儲，這為真菌、細菌、病毒和線蟲在內(nèi)的病原體提供了侵染馬鈴薯的機會。馬鈴薯的病害主要包括枯萎病、粉痂病、干腐病、青枯病、軟腐病、早疫病、晚疫病、瘡痂病等，這些病害大大降低了馬鈴薯的質(zhì)量[1-2]。對于病害的防治一般選用抗病品種和無病種薯進行合理種植；在病害田間噴灑噻菌靈、戊唑醇和咯菌腈等化學(xué)藥劑進行防治；利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得抗病馬鈴薯[3-4]。

病程相關(guān)蛋白(Pathogenesis related protein，PR蛋白)是指植物在其受到生物或非生物的脅迫后所誘導(dǎo)產(chǎn)生并積累的一類蛋白總稱[5]，在發(fā)生病原體攻擊時在植物中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，被誘導(dǎo)為系統(tǒng)獲得性抗性的一部分。其中一些蛋白質(zhì)是抗菌的，可以攻擊細菌或真菌細胞壁中的分子，并且一些蛋白質(zhì)可作為病菌感染的傳播信號。感染還刺激細胞壁中分子的交聯(lián)和木質(zhì)素的沉積，為反應(yīng)建立了局部路障，減緩了病原體擴散到植物的其他部分[6-8]。

PR基因家族劃分為1～17個家族[9]。在新鮮番紅花柱頭克隆CsPR10基因，發(fā)現(xiàn)其具有抵抗黃萎病菌(Verticilliumdahliae)、青霉菌(Penicillium)和尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)的能力[10]。表達分析表明，花藥和苔蘚組織中存在高轉(zhuǎn)錄水平，這種蛋白質(zhì)似乎通過激活茉莉酸途徑參與主動防御反應(yīng)。在煙草中對PR-la基因進行研究，證明該基因在煙草花葉病毒和水楊酸誘導(dǎo)性中發(fā)揮著重要的作用[11]。在克隆煙草發(fā)病相關(guān)PR1基因及在煙草中的表達研究表明，銅和鋅處理對煙草PR基因表達的誘導(dǎo)，其參與SA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[12]。在煙草感病品種中克隆NtPR10基因，發(fā)現(xiàn)該基因在TMV感染過程發(fā)生上調(diào)，表明其具有重要功能[13]。PR1能夠響應(yīng)各種病原體并誘導(dǎo)該基因表達。它是SAR(系統(tǒng)性獲得抗性)響應(yīng)的有效分子標(biāo)記，該基因的表達是水楊酸響應(yīng)性的[14-16]。

目前，馬鈴薯抗病問題已經(jīng)成為病理學(xué)家研究的重點內(nèi)容，而對于馬鈴薯中PR基因與馬鈴薯抗病的關(guān)系研究較少。本研究以馬鈴薯大西洋品種為研究材料，克隆了StPR1基因，對該基因進行相關(guān)的生物信息學(xué)分析，進而更加明確該基因的功能；應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)，針對該基因在真菌、細菌及毒素脅迫下的表達特異性及差異，進而為馬鈴薯的生物防治奠定堅實的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及處理

植物材料為馬鈴薯(大西洋品種)，由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

菌株材料真菌為接骨木鐮孢(F.sambucinum)、燕麥鐮孢(F.avenaceum)以及導(dǎo)致軟腐病和青枯病等的細菌胡蘿卜軟腐歐文氏菌(E.carotovorasubsp.CarotovoraBorgey，Ecc)、菊歐氏菌(E.chrysanthemiBurkholder.AtrosepticaDye，Ech)、胡蘿卜軟腐歐文氏菌馬鈴薯黑脛亞種(E.carotovorasubsp.McFaddenetDimock，Eca)、茄科雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum，RS)由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物資源與分子生物學(xué)研究室保存并提供。

選取大小均勻、表面光滑、無病斑的馬鈴薯，清水洗凈馬鈴薯表面，隨后將馬鈴薯置于75%的酒精中30 s，然后使用5%的NaClO溶液中浸泡5 min，最后使用無菌水清洗3次，置于超凈工作臺中備用。使用打孔器在馬鈴薯表面打下直徑為1 cm，深度為2 cm的孔洞，將300 μL Ecc、Eca、Ech、RS菌液、接骨木鐮孢及燕麥鐮孢菌餅注入到孔洞中，以無菌水為對照。分別在處理0，4，12 h后進行取樣，沿著孔洞的直徑將馬鈴薯切兩半，取孔洞周圍的組織0.5～0.6 g，重復(fù)3次，用錫箔紙包好，液氮中速凍，置于-80 ℃保存、備用。

RNA提取選用Bio Teke試劑盒購于恒誠生物公司；DNA膠回收選用OMEGA試劑盒購于賽拓生物公司；RT-PCR的熒光染料SYBR Green、TopTaq酶、pEASY-T3克隆載體、大腸桿菌感受態(tài)DH5α、質(zhì)粒提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于全式金生物公司；試驗所需引物合成于哈爾濱博仕生物公司；試驗結(jié)果測序于庫美生物公司；LB肉湯、LB營養(yǎng)瓊脂、NaClO溶液購于恒誠生物公司；使用Primer Premire 5.0(Premier Biosoft)進行引物設(shè)計。

1.2 RNA提取及cDNA的合成

用Bio Teke試劑盒(RP3301)進行總RNA 的提取，分裝進行UV-240紫外分光光度計濃度測定，OD260/280為1.8～2.0，測定合格后放入-80 ℃保存?zhèn)溆?，瓊脂糖凝膠電泳對RNA的完整性進行檢驗。選用Oligo(DT)為引物，對提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆?，使用?actin對cDNA質(zhì)量進行檢測。

1.3 StPR1基因的克隆

根據(jù)NCBI上公布的馬鈴薯病程相關(guān)蛋白PR1(XM-006367029.2)，找到CDS區(qū)，使用Primer Premire 5.0進行PR1克隆引物的設(shè)計(PR1-F：ATG GGATACTCCAATATTGCCTT；PR1-R：TTAGATATC AGTTGGAAGTTCCAAC)，克隆記憶長度為540 bp。以DON處理12 h的cDNA為模板進行PCR擴增反應(yīng)，將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，進而將目的片段進行膠回收，并于pEASY-T3進行連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)DH5α中，使用含有Amp(氨芐青霉素)(100 mg/mL)的LB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基進行菌落篩選，隨機挑取較圓、大小均勻的單菌落30個，待菌液渾濁進行菌液PCR驗證，將出現(xiàn)目的基因的菌液送公司進行測序。

1.4 StPR1生物信息學(xué)分析

利用以下生物信息學(xué)分析軟件以及在線工具對PR1基因進行相關(guān)分析。①保守結(jié)構(gòu)域分析：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi；②開放閱讀框及氨基酸序列分析：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder；③蛋白質(zhì)信號肽預(yù)測：http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/；④蛋白一級結(jié)構(gòu)的預(yù)測及分析：http://web.expasy.org/protparam/；⑤蛋白質(zhì)疏水性及親水性預(yù)測：https://web.expasy.org/protscale/；⑥蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測：https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html；⑦蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測：https://swissmodel.expasy.org/；⑧蛋白序列亞細胞定位：http://www.softberry.com；⑨系統(tǒng)發(fā)育樹：MEGA 5.0。

1.5 StPR1表達特異性分析

根據(jù)PR1的CDS區(qū)進行表達特異性的qRT-PCR的引物設(shè)計(表1)，將1.1中的6種處理及無菌水為對照的cDNA進行稀釋，并以馬鈴薯肌動蛋白β-actin內(nèi)參基因，進行qRT-PCR擴增反應(yīng)，其中包含3次生物學(xué)重復(fù)，其反應(yīng)體系為上下游引物各0.5 μL，cDNA 1.0 μL，2×Trans Star Top Green Qpcr Super Mix 10 μL，進行實時熒光定量分析。采用比較CT法(ΔΔCT)對熒光定量PCR擴增數(shù)據(jù)進行處理。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)錄入及分析采用Microsoft Excel 2010，作圖采用GraphPad Prism 5。相對表達量計算方法為2-ΔΔCT=2-(ΔCT處理-ΔCT對照)=2-((CT處理-CT內(nèi)參)-(CT對照-CT內(nèi)參))。使用Excel進行數(shù)據(jù)整理及處理。

表1 引物設(shè)計Tab.1 Primers design

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯StPR1基因的克隆

根據(jù)馬鈴薯PR1(GenBank 登錄號：XM-006367029.2)設(shè)計引物，進行PCR擴增，將產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，可以獲得500 bp左右的目的條帶(圖1)，進行該目的基因的測序，獲得540 bp序列，并將其進行生物信息學(xué)分析。

M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)2000；1-2.PCR產(chǎn)物。M.DL2000 DNA Marker；1-2.The PCR production.

2.2 馬鈴薯StPR1基因生物信息學(xué)分析

對已經(jīng)克隆的StPR1基因進行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該基因具有一個SCP_PR-1_like結(jié)構(gòu)域，位于79-480 bp(圖2)；該基因序列的起始密碼子ATG位于1 bp處，終止密碼子位于540 bp處，共編碼179個氨基酸，該基因全長540 bp；其開放閱讀框ORF1可翻譯蛋白質(zhì)序列；對其進行蛋白質(zhì)信號肽預(yù)測，發(fā)現(xiàn)PR1蛋白含有信號肽，屬于分泌蛋白；對PR1蛋白進行一級結(jié)構(gòu)預(yù)測及分析、PR1蛋白氨基酸含量預(yù)測及蛋白質(zhì)疏水性及親水性預(yù)測，PR1蛋白序列的GRAVY值在+4～-3，含有親水區(qū)及疏水區(qū)；蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測其屬于混合型蛋白；蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)其為緊密復(fù)雜的螺旋結(jié)構(gòu)(圖3)；預(yù)測蛋白質(zhì)存在的位置，發(fā)現(xiàn)StPR1基因編碼的蛋白在細胞膜以及細胞外基質(zhì)，在細胞質(zhì)、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、過氧化物酶體、高爾基體、葉綠體有分布。

圖2 StPR1基因保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.2 Analysis of conserved domain of StPR1 gene

圖3 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Protein tertiary structure prediction

2.3 馬鈴薯StPR1基因的系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

使用MEGA 5.0進行StPR1基因的系統(tǒng)進化樹構(gòu)建，結(jié)果表明馬鈴薯與辣椒PR1基因在一個進化分支上，相似性較高(圖4)。

2.4 馬鈴薯StPR1基因表達特異性分析

利用已經(jīng)獲得的RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄，使用qRT-PCR進行熒光定量分析。該基因的表達在茄科雷爾氏菌侵染下呈先下調(diào)后上調(diào)的趨勢；該基因的表達在接骨木鐮孢侵染下無明顯波動，而在燕麥鐮孢的侵染下呈逐漸上調(diào)的趨勢，12 h該基因的表達量顯著高于0 h；該基因的表達在軟腐病致病菌Ecc侵染下顯著高于Ech、Eca侵染下該基因的表達，并且在Ech、Eca侵染條件下StPR1基因呈下調(diào)趨勢，且此3組處理各個時間點的表達量均低于對照組。StPR1在參與馬鈴薯抗病過程中，抗真菌的能力可能強于抗細菌的能力(圖5)。

圖4 StPR1與其他物種的PR1基因系統(tǒng)發(fā)生分析Fig.4 Analysis of PR1 gene system in StPR1 and other species

圖5 不同脅迫下StPR1基因的表達差異Fig.5 Differential expression of StPR1 gene under different stresses

3 結(jié)論與討論

近年來，馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展受到了各種病害的嚴(yán)重制約，化學(xué)防治已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用到馬鈴薯的種植以及儲存過程中，與此同時生物防治也得到了廣泛的關(guān)注。楊德翠等[17]在以牡丹為研究材料，對PsPR1進行克隆及抗病研究，發(fā)現(xiàn)該基因受牡丹柱枝孢葉斑病病原菌(C.canadense)和信號物質(zhì)SA的顯著誘導(dǎo)，其與抗真菌的關(guān)系比較密切，分別在處理的12,24 h達到最高峰，這一研究表明，PsPR1可能參與了牡丹的抗病防御過程。張青等[18]對大薯中的PR1進行克隆，并對該基因進行生物信息學(xué)分析，表明該基因編碼的蛋白具有典型SCP_PR-1_like保守結(jié)構(gòu)域,Blast比對表明，DaPR1蛋白與多種植物的PR1蛋白高度同源。王樂等[19]在東方百合的相關(guān)研究中獲得了LhSorPR1，并證明PR1蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上與其他植物中的PR1蛋白具有較強的保守性。馬立功等[20]在以向日葵為研究材料，成功克隆了向日葵PR1基因，對該基因進行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),開放閱讀框為489 bp,編碼162個氨基酸,經(jīng)比較HaPR1與多種物種PR1高度同源并預(yù)測其具有抗核盤菌的功能。本試驗成功地從馬鈴薯大西洋品種中克隆出StPR1基因，在對其核苷酸序列進行生物信息學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)，雖然該基因與NCBI上公布的StPR1存在幾處差異，但其保守結(jié)構(gòu)域沒有受到任何影響，該蛋白典型的SCP_PR-1_like結(jié)構(gòu)域仍然存在。

病程相關(guān)蛋白的抗細菌以及真菌的能力也成為相關(guān)研究的熱點。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)CpPR4基因植株對蛙眼病病菌有一定抗性[21]。肖棟等[22]、李雪姣等[23]在對不結(jié)球白菜病程相關(guān)蛋白基因研究表明，BcPR5在IPTG誘導(dǎo)4 h后能實現(xiàn)融合蛋白的高效表達，證明該基因在抗霜霉病防御反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，并且推測這些PR蛋白質(zhì)參與水稻白葉枯病菌抗病過程。ABA和SA處理后強烈誘導(dǎo)TcLr19PR1，其中TcLr19PR1的表達水平顯著增加并在12，72 h達到最大值，發(fā)現(xiàn)TcLr19PR1基因在小麥發(fā)育和抗葉銹病病原體攻擊中起重要作用[24-25]。PR1蛋白具有抗真菌能力和免疫抑制能力[26]。根據(jù)本試驗的結(jié)果預(yù)測StPR1基因?qū)垢筛〉哪芰赡軓娪谲浉『颓嗫莶　?/p>