張曦予，賀 慧，李 禎，邢 蔓，洪 波，官春云

(湖南農(nóng)業(yè)大學，國家油料改良中心湖南分中心，湖南 長沙 410128)

油菜在我國種植歷史悠久，廣泛地分布在全國各地，作為重要的油料作物之一，除了食用植物油之外，其菜用、飼用、旅游觀光及藥用等潛在價值得到了持續(xù)的關注和開發(fā)利用[1]。但目前我國普遍種植的是甘藍型油菜，其生育期過長，影響“三熟制”實施，對農(nóng)民造成了嚴重的經(jīng)濟損失。研究油菜開花基因FT的分子調(diào)控機制[2]，可有效縮短油菜的生育期，為稻稻油“三熟制”的實施提供理論基礎[3]。FT基因是開花關鍵基因，最早是在擬南芥晚花突變體中發(fā)現(xiàn)的[4]。FT基因編碼的蛋白是一種Raf激酶蛋白，屬于PEBP蛋白(磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白)，PEBP蛋白分布廣泛，在動、植物、細菌、真菌中廣泛分布[5]。Abe等[6]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)T基因只在葉片中特異性表達。Samach等[7]研究發(fā)現(xiàn)，光周期途徑的關鍵基因CO在植物葉片中特異性調(diào)控FT基因的表達，特異性表達的FT蛋白被運輸?shù)角o尖分生組織，作用于下游基因調(diào)控植物開花。隨著現(xiàn)代生物分子學的發(fā)展，越來越多的FT基因家族的成員被發(fā)現(xiàn)，比如水稻中的RFT1基因[8]和Hd3a基因[9]、麻風樹中的JcFT基因[10]、短日照植物矮牽牛中的PnFT1基因[11]等。在擬南芥、水稻等模式植物中，大量開花相關基因被分離鑒定[12]。植物的基因表達調(diào)控主要是在轉(zhuǎn)錄水平上進行的，受到多種順式作用元件和逆式作用元件的相互協(xié)調(diào)作用。研究順式作用元件可以探討脅迫誘導基因的表達機制[13]。

隨著對啟動子研究的不斷深入，關于克隆啟動子的技術(shù)越來越多，目前最常用的技術(shù)包括普通PCR、反向PCR、錨定PCR、MADE法、TALL-PCR等。由于條件的限制，普通PCR技術(shù)通常建立在完成全基因組測序的物種上，因為其在啟動子序列是已知的。想要獲得啟動子的全序列，一般只需要設計出合適的引物，便可獲得啟動子的全長。但是目前絕大多數(shù)物種的全基因組測序未完成，因此，利用普通PCR獲得啟動子序列是非常困難的。其余PCR技術(shù)皆是用來擴增已知序列側(cè)翼的未知片段，在分子生物學領域應用較為廣泛[14]。

本研究根據(jù)甘藍型油菜全基因組序列，利用PCR技術(shù)得到甘藍型油菜A7-FT基因啟動子序列。利用啟動子在線預測軟件預測其功能與結(jié)構(gòu)，根據(jù)其預測的順式元件的分布，從5′端開始缺失的方式獲得5個不同片段長度的啟動子序列。構(gòu)建含不同片段長度的啟動子的GUS基因表達載體，利用農(nóng)桿菌介導擬南芥，得到T2幼苗，經(jīng)過GUS染色與脫色，探討A7-FT基因啟動子的功能，為研究甘藍型油菜開花調(diào)控機制提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

甘藍型油菜湘油15由湖南農(nóng)業(yè)大學油料研究所提供。Trans T1大腸桿菌感受態(tài)從北京全式金生物技術(shù)有限公司購買，pMD18-T載體從TaKaRa公司購買，野生型擬南芥種子與農(nóng)桿菌菌株GV3101為國家油料改良中心湖南分中心提供。人工土=蛭石∶珍珠巖∶營養(yǎng)土=1∶1∶1混合。

1.2 A7-FT基因啟動子的克隆

使用全式金DNA提取試劑盒提取油菜基因組DNA。A7-FT基因啟動子序列PCR擴增通過擬南芥信息資源(TAIR)數(shù)據(jù)庫(http://www.arabidopsis.org/)查找擬南芥AtFT基因(AT1G65480)，用擬南芥AtFT基因編號在Brassica Database數(shù)據(jù)庫(http://brassicadb.org/brad/index.php)中Blast，得到甘藍型油菜中BnFT基因序列上游1 600 bp序列信息。根據(jù)上游約1 600 bp序列信息及BnFT-A7基因信息用Primer 5.0設計引物F/R，擴增BnFT-A7啟動子的引物序列F1(ACAGAGTTGTAAAAGTA AAATTATGTG),R1(CTCTGATCTAAAACAAACAG GTTG)，PCR反應體系50 μL：5× PCR Buffer 10 μL，5×PCR Buffer 10 μL，dNTP Mix (2.5 mmol/L) 4 μL，正向引用 (10 μmol/L) 1 μL，反向引物 (10 μmol/L) 1 μL，cDNA 1 μL，PrimeSTAR?GXL DNA 聚合酶 1 μL，ddH2O 32 μL。利用全式金的普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收DNA片段。連接pMD19-T載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌。

1.3 啟動子序列分析及缺失載體構(gòu)建

利用PLACE和PlantCARE植物基因序列分析的網(wǎng)站對A7-FT基因啟動子上的順式作用元件進行生物信息學分析預測。根據(jù)對順式作用元件分析的結(jié)果，對啟動子進行逐段缺失，缺失片段及名稱依次為-1 549～+57(M1)、-1 162～+57(M2)、-824～+57(M3)、-429～+57(M4)、-238～+57(M5)。對這些缺失片段進行高保真擴增，分別設計帶有Hind Ⅲ酶切位點的正向引物和帶有NcoⅠ酶切位點的反向引物。擴增這5個片段所需引物見表1。

表1 載體構(gòu)建所需的引物Tab.1 Primer required for vector construction

啟動子缺失片段的克隆是通過質(zhì)粒DNA提取不同片段長度啟動子表達載體的構(gòu)建，使用農(nóng)桿菌浸染擬南芥花序，利用MS培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子，進行陽性苗的鑒定，待陽性苗植株較大，取部分葉片，提取DNA，參考劉芳[15]已設計的引物(表1)，F(xiàn)2：GTCGCGCAAGACTGTAACCA，R2：ACATACCATCC GTAATAAC，進行PCR檢測，片段長度為842 bp，將檢測為陽性的植株繼續(xù)培養(yǎng)，并收集種子，篩選至得到T2種子。將T2種子鋪于MS培養(yǎng)基中(含潮霉素B 50 mg/L)，10 d后取出陽性苗用于下一步試驗。GUS活性的組織化學檢測，參照Jefferson 等[16]的GUS組織化學檢測方法。

圖1 A7-FT基因啟動子序列上順式作用元件預測Fig.1 cis-acting element prediction on A7-FT gene promoter sequence

2 結(jié)果與分析

2.1 啟動子上順式作用元件預測

通過PlantCARE和PLACE在線軟件對啟動子序列進行序列分析(圖1)，結(jié)果表明，A7-FT基因啟動子序列上存在多種不同功能的順式作用元件。除了啟動子-141，-30 bp處分別存在核心啟動子必備的元件CAATbox和TATAbox，在啟動子的其他核心元件有激素應答元件如ABRE/G-box/circadain(脫落酸應答元件)、TCA-element(水楊酸應答元件)；光應答元件AE-box、ATCT-motif、Box4、Box I、GT1-motif/chs-CMA1a、TCT-motif/TC-rich repeats；抗逆性應答元件如Box-W1/W box(真菌應答元件)、ARE(缺氧應答元件)。另外，還發(fā)現(xiàn)了其他順式作用元件，如分生組織表達相關的順式元件CAT-box、參與胚乳表達的順式元件GCN4_motif和Skn-1_motif、熱激蛋白順式作用元件HSE。

2.2 不同片段長度啟動子的克隆及PCR檢測

以湘油15苗期葉片基因組DNA為模板，F(xiàn)1/R1為引物，進行PCR擴增，得到一條約1 600 bp的片段(圖2-A)。

M.Trans 2kb? DNA Marker；M1.1 606 bp；M2.1 219 bp；M3.914 bp；M4.486 bp；M5.295 bp。

為了深入了解甘藍型油菜A7-FT基因啟動子的功能，基于預測順式作用元件的分布設計帶有酶切位點的特異性引物，以PCR擴增湘油15苗期葉片基因組DNA后得到的1 600 bp片段為模板，分別切膠回收加“A尾”并連接pMD-19T載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過菌落PCR鑒定，獲得陽性克隆并測序，保留所含啟動子序列與已知目的序列一致的菌液，放置-80 ℃保存。把不同長度的啟動子分別命名為M1、M2、M3、M4、M5,長度分別為1 606，1 219，914，486，295 bp(圖2-B)。

2.3 啟動子缺失載體的構(gòu)建

全長啟動子連接pCAMBIA1303載體，啟動子依然能使GUS基因正常表達，為了深入了解甘藍型油菜A7-FT基因啟動子的功能，探索A7-FT基因啟動子不同區(qū)段的功能，因此，從5′端逐段缺失，構(gòu)建M1、M2、M3、M4、M5表達載體。5′端缺失載體構(gòu)建模型(圖3)，含CAMV35S啟動子及去除CAMV35S啟動子的pCAMBIA1303載體分別為陽性、陰性對照。

將含有不同片段長度啟動子和pCAMBIA1303載體的大腸桿菌于37 ℃活化過夜，按照EasyPure Plasmid MiniPrep Kit試劑盒說明書提取質(zhì)粒DNA，分別利用FlyCutNcoⅠ/FlyCutHind Ⅲ對質(zhì)粒進行雙酶切，使用T4連接酶分別將相對應的目的片段連接至載體，構(gòu)建含不同片段長度啟動子的表達載體。將構(gòu)建好的表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過LB培養(yǎng)基(含Kan 50 μg/mL)篩選陽性菌落，提取質(zhì)粒，通過菌落PCR和雙酶切檢測(圖4)，結(jié)果說明含目的片段表達載體構(gòu)建成功。

圖3 5′端缺失載體構(gòu)建模型Fig.3 The pattern digaram of 5′deleted vecter

圖4 不同片段長度啟動子雙酶切電泳Fig.4 Electrophoresis of different fragments of promoters by two restriction enzymes

2.4 5′端缺失載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌結(jié)果分析

將含有不同片段長度啟動子的表達載體分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，通過含有利福平(Rif 50 μg/mL)、卡那霉素(Kan 50 μg/mL)雙抗YEB培養(yǎng)基進行篩選，挑選陽性菌落進行菌落PCR檢測，結(jié)果如圖5，凝膠電泳結(jié)果與預期一致，結(jié)果表明，5′端缺失載體成功轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。

圖5 轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌落PCR檢測結(jié)果Fig.5 The colony PCR detection of transformed Agrobacterium

2.5 擬南芥轉(zhuǎn)化結(jié)果

利用花序浸染法將含不同片段長度啟動子的表達載體轉(zhuǎn)化至野生型擬南芥后，于植物生長箱中培養(yǎng)至收獲T0種子。通過MS培養(yǎng)基(含潮霉素B 50 mg/L)從T0種子中篩選出轉(zhuǎn)化子。篩選過程中陽性幼苗主根和側(cè)根的生長、發(fā)育正常；陰性幼苗發(fā)育遲緩，主根無法正常生長，且沒有側(cè)根形成。挑選主根和側(cè)根的生長、發(fā)育正常的陽性苗，用無菌水洗凈黏附的凝膠，移入已滅菌的人工土中覆蓋白色薄膜3～4 d，置于植物生長培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待T1擬南芥生長較大時，取部分葉片，參照DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA，通過PCR再一次鑒定轉(zhuǎn)化子，鑒定結(jié)果如圖6所示。

待T1擬南芥開花后15 d依次收獲成熟的T1種子。通過MS培養(yǎng)基(含潮霉素B 50 mg/L)篩選T1種子，從而得到T2種子。繼續(xù)通過MS培養(yǎng)基(含潮霉素B 50 mg/L)進行篩選，待陽性苗在MS培養(yǎng)基中生長10～15 d，進行下一步試驗。

圖6 轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR鑒定電泳(部分鑒定結(jié)果)Fig.6 PCR identification of transgenic Arabidopsis(Partial identification results)

2.6 GUS染色結(jié)果檢測

含有不同片段長度啟動子的表達載體經(jīng)過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后得到T2幼苗，約10 d的T2幼苗經(jīng)過GUS染色與脫色處理后(圖7)，GUS基因在不同片段長度啟動子的啟動下均能表達，但是隨著啟動子5′端的逐漸缺失，GUS染色程度也有所變化，這說明啟動子5′端的逐漸缺失影響了GUS基因的表達。從染色結(jié)果上看，M1、M2、M3、M4均比M5淺，說明在-1 549～-238可能存在一些負調(diào)控元件的結(jié)合位點，而M5啟動GUS基因的表達情況與陽性對照CAMV35S相同,這說明-238～+1區(qū)域是該啟動子的核心區(qū)段。

3 結(jié)論與討論

通過PCR技術(shù)獲取甘藍型油菜A7-FT基因啟動子并驗證啟動子的功能，對研究甘藍型油菜開花調(diào)控具有重大意義。本試驗克隆獲得了295 bp甘藍型油菜A7-FT基因啟動子序列，該序列與甘藍型油菜基因組FT基因上游序列比對，同源性100%，說明在同物種不同品種之間的A7-FT基因啟動子高度保守。通過啟動子在線預測軟件分析甘藍型油菜A7-FT基因啟動子，預測結(jié)果表明，在啟動子上分布許多光應答元件，說明光照能調(diào)控A7-FT基因的表達，這與鄭小一[17]在光照條件下，蘋果FT基因啟動子才有活性的研究結(jié)論一致；預測結(jié)果顯示，在啟動子上還有一個與生理控制相關的順式作用元件Circadian，這也表明，A7-FT基因的表達受晝夜的影響，間接地證明了該基因也受光周期調(diào)控；在啟動子上還發(fā)現(xiàn)了各種激素元件，包括TAC-element(水楊酸應答元件)和ABRE(脫落酸應答元件)，Wada等[18]用外源水楊酸處理日本牽?；?，發(fā)現(xiàn)FT基因高效表達，進而促進開花,這就表明植物開花也受生物壓力影響；在啟動子上發(fā)現(xiàn)W-box元件，該元件在植物開花上也扮演著重要的角色，因為轉(zhuǎn)錄因子WRKY特異性識別W-box，前者參與許多植物生理與發(fā)育過程[19]，Miao等[19]在擬南芥中過表達WRKY53、WRKY6均使植株開花提前，Robatzek等[20]利用RNAi技術(shù)干擾WRKY表達，發(fā)現(xiàn)植株開花延遲，從這些研究推測W-box是A7-FT基因啟動子上調(diào)控植物開花的重要順式元件。

圖7 不同片段長度啟動子GUS染色結(jié)果Fig.7 The GUS staining of different fragments of promoters