婁宇飛， 魏昌盛， 胡瑞芳， 王洪寶， 昝林森

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

從2013年初歐盟的“馬肉風(fēng)波”開始，國(guó)內(nèi)相繼爆出了“牛肉香精假牛肉”、“鴨肉冒充羊肉”等一系列肉類制品原材料摻假案件。僅2013年3月，內(nèi)蒙古包頭騰達(dá)食品有限公司制售假劣食品案，案值便達(dá)600余萬(wàn)元，其生產(chǎn)的假劣牛肉干、羊肉干銷往全國(guó)15個(gè)省區(qū)市，足可見摻假肉在全國(guó)乃至全世界的“盛行”。現(xiàn)階段，肉類鑒別技術(shù)依舊以普通PCR和熒光PCR為主，但是由于實(shí)驗(yàn)儀器昂貴且體積較大，這些方法只能局限于實(shí)驗(yàn)室中，無(wú)法滿足市場(chǎng)上對(duì)于快速、簡(jiǎn)便鑒別的要求。

2000年，日本榮研株式會(huì)Notomi等人[1]提出了一種名為L(zhǎng)AMP的新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，由于其靈敏度高，特異性強(qiáng)，時(shí)效快，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)迅速應(yīng)用于食源性微生物的檢驗(yàn)。之后經(jīng)過Nagamine等人[2]的改進(jìn)，迅速受到了廣泛的關(guān)注，目前被廣泛應(yīng)用于病原微生物[3-5]、胚胎性別鑒定[6-7]等方面。近年來(lái)，其在肉類源性檢驗(yàn)中的應(yīng)用也越來(lái)越受到重視。

1 LAMP技術(shù)的原理

相關(guān)研究顯示，DNA在65 ℃左右時(shí)，處于一種動(dòng)態(tài)平衡中[8]，DNA在此溫度下利用4條特異性引物依靠一種鏈置換DNA聚合酶，使鏈置換DNA的合成不停地自我循環(huán)。LAMP就是利用這種特性，在Bst DNA聚合酶和特異性引物的作用下以雙鏈DNA為模板，在等溫條件下完成DNA的合成和擴(kuò)增[9]。

最初Notomi等人設(shè)計(jì)的LAMP僅有4條特異性引物，包括2條內(nèi)引物(forward inner primer，F(xiàn)IP和backward inner primer，BIP)和2條外引物(forward outer primer，F(xiàn)3和backward outer primer，B3)，之后Nagamine等人在此基礎(chǔ)上添加了2條環(huán)引物(loop-forward inner primer，L-FIP和loop-backward inner primer，L-BIP)，等溫?cái)U(kuò)增的速度明顯加快(可在10～15 min內(nèi)完成檢測(cè))，并大大提高了檢測(cè)效率(高出7個(gè)數(shù)量級(jí))。

LAMP可分為2個(gè)階段。第一階段，DNA合成：首先FIP和BIP啟動(dòng)鏈置換合成，接著F3和B3先后結(jié)合到靶基因上，形成LAMP擴(kuò)增的初始結(jié)構(gòu)——環(huán)狀啞鈴結(jié)構(gòu)，在此過程中，環(huán)引物的存在加快了核苷酸的延伸速度。第二階段，循環(huán)擴(kuò)增階段：以自身3’末端的Fl 區(qū)域?yàn)槠瘘c(diǎn)，以第一階段形成的環(huán)狀啞鈴結(jié)果為模板開始新的一輪置換反應(yīng)，進(jìn)行DNA擴(kuò)增，最后形成一系列大小不一的結(jié)構(gòu)，因此LAMP的凝膠電泳會(huì)出現(xiàn)多條擴(kuò)增帶，具體原理見圖1。

圖1 LAMP原理圖[9]

2 LAMP在技術(shù)上的優(yōu)勢(shì)

目前，在肉類源性檢驗(yàn)中有兩大方向，一類是基于蛋白質(zhì)水平的檢測(cè)，如酶聯(lián)檢測(cè)法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)[10-11]，但由于蛋白質(zhì)易于變性，易導(dǎo)致檢測(cè)失敗，尤其是在食品加工的過程中，因此這種方法適用范圍較窄，并且需要昂貴的儀器設(shè)備；另一種是基于DNA水平的檢測(cè)，例如：普通PCR[12]、多重PCR(Multiplex PCR)[13-14]、種特異性PCR(species-specific PCR)[15]、實(shí)時(shí)熒光PCR(quantitative real-time PCR)[16]等。與這些方法相比，LAMP法具有以下明顯的特點(diǎn)：

(1)靈敏度高。根據(jù)Li等人的研究表明，LAMP法的準(zhǔn)確性與qPCR相當(dāng)[17]，擴(kuò)增模板可低至10拷貝亦或更少[18]。

(2)特異性強(qiáng)。最初的LAMP僅有內(nèi)引物和外引物4條，改進(jìn)后LAMP增加了2條環(huán)引物，只有當(dāng)模板鏈中6個(gè)特異性區(qū)段全部匹配時(shí)才能擴(kuò)增，因此在提高反應(yīng)速度的同時(shí)極大地提高了鑒別的特異性。

(3)檢測(cè)速度快，結(jié)果直觀可視化。整個(gè)LAMP擴(kuò)增在1 h內(nèi)即可完成，產(chǎn)率可達(dá)0.5 mg/mL，引物進(jìn)一步改進(jìn)下，擴(kuò)增時(shí)間可在原基礎(chǔ)上減少1/3～1/2；DNA合成時(shí)，從脫氧核糖核酸三磷酸底物(dNTPs)中析出的焦磷酸離子與反應(yīng)溶液中的鎂離子反應(yīng)，產(chǎn)生大量焦磷酸鎂沉淀，呈現(xiàn)白色。因此，可以把渾濁度作為反應(yīng)的指標(biāo)，只用肉眼可視化觀察白色渾濁沉淀，就能鑒定擴(kuò)增與否，而不需要繁瑣的電泳和紫外觀察。

(4)成本低，不需特殊儀器。無(wú)論是普通PCR還是多重PCR，都離不開PCR儀，因此只能在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中進(jìn)行，但LAMP僅需要給予恒定的溫度即可反應(yīng)，無(wú)需特殊的儀器，極大地降低了成本，同時(shí)滿足了市場(chǎng)對(duì)于快速、簡(jiǎn)便的需要。

3 LAMP在肉類鑒別中的應(yīng)用

3.1 LAMP在檢測(cè)豬源性成分中的應(yīng)用

豬肉是目前市場(chǎng)上最常見的摻假成分，在羊肉、牛肉等產(chǎn)品中均有檢出。為了更好保護(hù)消費(fèi)者權(quán)益，研發(fā)快速檢測(cè)摻假的方法勢(shì)在必行，原則上說(shuō)，使用鴨肉、豬肉等肉摻假制成的肉制品對(duì)人體沒有太大的危害，但如果來(lái)源不明，攜帶致病菌就有可能危害人類健康。從宗教信仰角度來(lái)看，鑒別清真食品中的豬源性成分也有助于進(jìn)行清真認(rèn)證，更好地保護(hù)宗教信仰。

目前，LAMP技術(shù)在國(guó)內(nèi)外肉源性檢測(cè)方面已有廣泛應(yīng)用。2010年，Ahmed等[19]使用LAMP和disposable electrochemical printed(DEP)芯片來(lái)鑒別加工豬肉、雞肉和牛肉中肉源性。與多重PCR(M-PCR)相比，此法更具特異性，并且檢測(cè)精度更高。

2013年，楊麗霞等人[20]利用LAMP技術(shù)，以豬線粒體COXI基因?yàn)榘袠?biāo)設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳和終點(diǎn)染色，并采用熒光檢測(cè)儀實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)過程，證實(shí)了LAMP可以特異的檢測(cè)出牛羊肉中的豬源性成分。在此基礎(chǔ)之上，張英等人[21]對(duì)LAMP的反應(yīng)溫度和反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)表明在三磷酸脫氧核苷酸 (dNTPs) 濃度為1.2 mmol/L，MgSO4濃度為4.0 mmol/L，甜菜堿濃度為0.8 mol/L，反應(yīng)溫度為72 ℃，反應(yīng)時(shí)間為55 min時(shí)，LAMP反應(yīng)效率最高，熒光效果最好。

Roy等[22]于2016年LAMP與電化學(xué)發(fā)光(ECL)技術(shù)整合用于檢測(cè)皮克級(jí)別不同肉種的序列特異性DNA，通過利用該技術(shù)，檢測(cè)到豬肉的靶DNA低至1 pg/μL。此外，該技術(shù)應(yīng)用于枯草芽孢桿菌DNA樣品的檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了10 pg/μL的檢測(cè)限。2018年，唐善虎等人[23]進(jìn)一步對(duì)豬的12S rRNA-tRNA Val基因進(jìn)行分析并設(shè)計(jì)特異性引物，確定了LAMP體系中豬肉的檢出上限為0.125%。

3.2 LAMP在檢測(cè)牛源性成分中的應(yīng)用

2016年，徐淑菲等[24]建立了牛源性成分LAMP檢測(cè)方法。試驗(yàn)結(jié)果表明：LAMP方法的靈敏度比PCR方法高100倍，可達(dá)到5.408×10-2μg/μL，最快在10 min即可完成，反應(yīng)迅速。同年，冼鈺茵等[25]建立了肉及肉制品中牛源性成分的LAMP檢測(cè)技術(shù)，對(duì)市售的9種生牛肉及3種熟肉類制品進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)，結(jié)果表明對(duì)我國(guó)南方主要食用牛肉-水牛、北方地區(qū)主要食用牛肉-黃牛及高原地區(qū)牛肉源牦牛均具有較高特異性，靈敏度均高達(dá)0.1%。

2017年，Li等[26]采用LAMP進(jìn)行物種特異性靶基因擴(kuò)增，并在免疫層析條帶(ICS)上進(jìn)行分析，以快速直觀地鑒定肉類。基于LAMP的ICS方法顯示出良好的特異性，可重復(fù)，對(duì)于肉類混合物中的牛肉靈敏度達(dá)0.1%，整個(gè)檢測(cè)過程可在50 min內(nèi)完成。

3.3 LAMP在檢測(cè)羊源性成分中的應(yīng)用

2014年，朱珠等[27]根據(jù)羊線粒體中物種特異性序列設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用可視化環(huán)狀等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(vLAMP)對(duì)羊源性成分進(jìn)行快速擴(kuò)增及可視化判斷，建立羊源成分人工污染的飼料模型，考察檢測(cè)方法的靈敏度。結(jié)果表明，羊源性引物僅能夠?qū)ρ蛟葱猿煞之a(chǎn)生特異性擴(kuò)增，靈敏度高達(dá)0.001%。所建立的牛、羊源性成分現(xiàn)場(chǎng)可視化篩查方法用于飼料中牛、羊源性成分污染和食品摻偽的現(xiàn)場(chǎng)可視化檢測(cè)。

2015年，李向麗等[28]建立肉制品羊源性成分的LAMP檢測(cè)方法，對(duì)市售羊肉片、羊肉卷、羊肉串進(jìn)行羊源性成分檢測(cè)分析，對(duì)肉制品中羊源性成分的檢測(cè)靈敏度達(dá)0.5%。SYTO-9熒光染料的熒光實(shí)時(shí)檢測(cè)結(jié)果與SYBR Green I染料肉眼觀察結(jié)果一致。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該批市售羊肉及制品中存在摻假現(xiàn)象，摻假率為34.5%。

2017年，宋濤平等[29]根據(jù)羊cyt B特異性基因分別設(shè)計(jì)LAMP引物，反應(yīng)時(shí)加入熒光染料SYTO-9，在63 ℃條件下反應(yīng)45 min，通過實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光強(qiáng)度判斷反應(yīng)結(jié)果，并進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。實(shí)時(shí)熒光LAMP方法對(duì)羊源性成分的檢測(cè)靈敏度為10 pg。對(duì)熟肉制品中摻雜肉檢測(cè)時(shí)，摻雜羊肉的檢出限為0.01%。

3.4 LAMP在檢測(cè)禽源性成分中的應(yīng)用

2014年， Cho等[30]設(shè)計(jì)了針對(duì)物種特異性線粒體DNA的LAMP測(cè)定，并根據(jù)退火曲線分析產(chǎn)生的獨(dú)特退火溫度區(qū)分靶基因。因?yàn)橥嘶饻囟葘?duì)于物種識(shí)別是有效的，并且它與每個(gè)靶基因位點(diǎn)的核苷酸組成有關(guān)[31]。生肉和熟肉中LAMP測(cè)定的檢測(cè)限(LOD)由10 pg/μL至100 fg/μL水平確定，并且原料和熟肉混合物中的LOD測(cè)定為0.01%～0.0001%水平。測(cè)定在30 min內(nèi)進(jìn)行，并顯示出比PCR測(cè)定更高的靈敏度。這些新型LAMP分析為肉類的鑒別提供了一種簡(jiǎn)單，快速，準(zhǔn)確和靈敏的技術(shù)。

4 LAMP在檢測(cè)其他肉源性源性成分中的應(yīng)用

4.1 LAMP鴕鳥肉源檢測(cè)

2014年，出現(xiàn)了利用鴕鳥線粒體細(xì)胞色素b基因，將LAMP與實(shí)時(shí)熒光計(jì)結(jié)合的測(cè)定方法。該方法可用于直接在餐廳或零售層識(shí)別鴕鳥肉，而且可以使用煮熟的，油炸的和加香料的樣品。該LAMP測(cè)定對(duì)于檢測(cè)鴕鳥肉具有極好的靈敏度和特異性，開發(fā)的系統(tǒng)允許檢測(cè)0.01%的鴕鳥肉產(chǎn)品，并且取樣鑒定時(shí)間為15～20 min。

4.2 馬肉源檢測(cè)

2015年，Zahradnik等[32]開發(fā)了一種LAMP方法，用于特定檢測(cè)加工食品中的馬肉。該方法對(duì)馬和驢肉顯示出極高的特異性，該方法靈敏度為0.1 ng。在加工肉制品(香腸)中，該方法在26 min內(nèi)檢測(cè)到0.1%的馬肉含量。值得注意的是，在各種商業(yè)馬肉產(chǎn)品中，該方法未檢測(cè)到血樣品中的馬肉，甚至PCR也無(wú)法檢測(cè)到這些樣品中的馬源性成分，因此作者認(rèn)為血中的mtDNA含量可能不足以支持LAMP反應(yīng)。

4.3 狐貍?cè)庠礄z測(cè)

2016年，劉少寧等[33]優(yōu)化LAMP反應(yīng)體系檢測(cè)羊肉中的狐貍源性成分，檢測(cè)靈敏度達(dá)到1.0%，即最低檢測(cè)濃度為2×10-4ng/μL。

為了更加清晰地展示LAMP技術(shù)在各肉源性食品檢測(cè)中的應(yīng)用情況，筆者將已有研究匯總整理形成表1。

表1 LAMP在肉源性檢測(cè)上的應(yīng)用分析

5 小結(jié)與展望

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是一門新興的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、快速省時(shí)、易于檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)也存在著其原理復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求高、引物設(shè)計(jì)復(fù)雜、擴(kuò)增的靶序列長(zhǎng)度需控制在300 bp以下等缺點(diǎn)。

其已廣泛用于細(xì)菌、病毒和轉(zhuǎn)基因食品等各種檢測(cè)當(dāng)中，在動(dòng)物肉源性檢測(cè)當(dāng)中的應(yīng)用逐漸受到關(guān)注，技術(shù)也不斷地被優(yōu)化和完善，有望開發(fā)出一系列肉類檢測(cè)的便攜試劑盒，用于識(shí)別和檢測(cè)新鮮生肉、熱處理和加工過的肉類、肉制產(chǎn)品和動(dòng)物飼料中肉的種類和含量，成為識(shí)別肉類品種的快速、可靠、非常適合定量且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的檢測(cè)方法，為我國(guó)食品檢測(cè)試劑盒的發(fā)展開辟新的方向，應(yīng)用前景廣闊。