岑超德，張永，羅聰，鄔均，劉福堯，吳聲忠

(1.貴州省骨科醫(yī)院骨科，貴州 貴陽 550000；2.貴陽市第一人民醫(yī)院，貴州 貴陽 550000；3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院骨科，重慶 400014)

由高能量創(chuàng)傷、感染、腫瘤等因素導(dǎo)致的骨缺損，尤其是大段骨缺損，已成為骨科臨床上的一大難題，目前發(fā)生率較高[1]。傳統(tǒng)的治療方法主要有自體及異體骨移植、骨搬移術(shù)、Masquelet技術(shù)、人工植骨材料修復(fù)等[2-4]。然而，自體骨移植存在供體受限的問題，異體骨存在免疫排斥的弊端[5，6]，骨搬移術(shù)存在痛苦大、治療周期長(zhǎng)的缺點(diǎn)[7]，Masquelet技術(shù)被用于各種骨缺損的治療并取得令人鼓舞的成果，但其存在骨量來源有限的困擾[8]。目前常用的人工植骨材料多為降解緩慢甚至不降解的材料，人工骨內(nèi)部常出現(xiàn)成骨死角及骨缺損修復(fù)不全的情況?？梢姡瑢で罄硐氲娜斯す浅蔀橹委煿侨睋p的關(guān)鍵。

隨著材料學(xué)的不斷發(fā)展，應(yīng)用各種技術(shù)制備的納米仿生人工骨為解決這一問題開辟了一條嶄新的途徑，理想的人工骨應(yīng)該盡量仿生天然骨的組成及結(jié)構(gòu)。聚乳酸類材料屬于有機(jī)高分子材料，因其具備良好的組織相容性、可降解等特性而被美國FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床，其中左旋聚乳酸具有良好的力學(xué)性能，其降解產(chǎn)物呈酸性[9]。β-磷酸三鈣具備骨引導(dǎo)性，脆性大，降解產(chǎn)物呈堿性。3D打印又名增材制造，是在計(jì)算機(jī)控制下，按照預(yù)設(shè)數(shù)據(jù)，采用合適的原料層層堆積制作實(shí)物的技術(shù)。本文結(jié)合兩者材料的優(yōu)缺點(diǎn)，基于3D打印技術(shù)仿生構(gòu)建左旋聚乳酸(poly L-lactic acid，PLLA)/β-磷酸三鈣(β-tricalcium phosphate，β-TCP)可生物降解復(fù)合人工骨，對(duì)其性能及組織相容性進(jìn)行研究，探究其作為體內(nèi)組織工程骨材料的可行性。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 左旋聚乳酸(PLLA，Mw=50 000，濟(jì)南姝遠(yuǎn)生物科技有限公司)，β-磷酸三鈣(β-TCP，d50=0.2～5.0 μm，純度99%，南京埃普瑞納米材料有限公司)。C3H10細(xì)胞(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院干細(xì)胞庫)，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司)，PBS緩沖液(碧云天生物技術(shù)研究所)，綠色熒光蛋白腺病毒(Ad-green fluorescent protein，Ad-GFP)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-9腺病毒(Ad-bone morphogenetic protein-9，Ad-BMP9)(芝加哥大學(xué)醫(yī)學(xué)中心何通川教授惠贈(zèng))，茜素紅S、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)定量檢測(cè)試劑盒、萘酚AS-MX堿性磷酸鹽溶液和快速藍(lán)重氮鹽(美國Sigma公司)。C3H10細(xì)胞(小鼠骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院兒科研究所干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室提供)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 3D打印機(jī)(型號(hào)Bio-Architect?-Lite，杭州捷諾飛生物科技股份有限公司)，水銀孔率計(jì)(AutoPore IV 9500，英國Micromeritics)，動(dòng)靜態(tài)疲勞試驗(yàn)機(jī)(型號(hào)3330，美國BOSE公司)，掃描電鏡(型號(hào)S-3000N，日本日立公司)。

1.3 PLLA/β-TCP復(fù)合人工骨的制備 先利用三維計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)(Computer aided design，CAD)軟件設(shè)計(jì)支架材料。材料屬性設(shè)置為直徑8 mm、壁厚3 mm、長(zhǎng)2.0 cm的中空?qǐng)A柱狀結(jié)構(gòu)，孔徑為400 μm，孔隙率60%。將設(shè)計(jì)完成的材料轉(zhuǎn)換成STL格式并輸入3D打印機(jī)。具體過程：將適量的PLLA(Mw=50 000)和β-TCP溶于1、4-二氧六環(huán)中，PLLA與1、4-二氧六環(huán)的質(zhì)量體積比為15%，PLLA與β-TCP的質(zhì)量比分別為(4︰1，2︰1及3︰2，分別簡(jiǎn)稱為P/T20，P/T30及P/40)，磁力攪拌器勻速攪拌形成均一膏狀原料備用。調(diào)整3D打印機(jī)相關(guān)屬性參數(shù)進(jìn)行材料打印(噴頭直徑400 μm，速度2 mm/s)。本實(shí)驗(yàn)選用的3D打印技術(shù)是在熔融沉積造型術(shù)(fused deposition modeling，F(xiàn)DM)基礎(chǔ)上選用生物擠壓方法進(jìn)行打印PLLA/β-TCP復(fù)合人工骨，紫外線消毒后備用。

1.4 PLLA/β-TCP復(fù)合人工骨的物理性能檢測(cè)

1.4.1 PLLA/β-TCP復(fù)合人工骨的微觀結(jié)構(gòu) 復(fù)合人工骨試樣經(jīng)噴金后，于掃描電鏡(scanning electron microscopy，SEM)下觀察其微觀結(jié)構(gòu)。

1.4.2 PLLA/β-TCP復(fù)合人工骨的孔隙率 復(fù)合人工骨的孔隙率根據(jù)以下公式進(jìn)行測(cè)定[10]：孔隙率=(1-ρa(bǔ)/ρt)×100%(其中ρa(bǔ)為復(fù)合人工骨的實(shí)際密度，將人工骨浸入水銀液體中根據(jù)阿基米德原理計(jì)算出，而ρt為復(fù)合人工骨的理論密度，PLLA和β-TCP的理論密度分別為1.3 g/cm3和3.07 g/cm3)。

此外，為了比較不同方法對(duì)孔隙率測(cè)量造成的誤差，用水銀孔率計(jì)在壓力414 Pa至3.7 kPa的范圍內(nèi)對(duì)PLLA/β-TCP復(fù)合人工骨進(jìn)行孔隙率的測(cè)定。

1.4.3 PLLA/β-TCP復(fù)合人工骨的力學(xué)性能 人工骨的力學(xué)強(qiáng)度由動(dòng)靜態(tài)疲勞試驗(yàn)機(jī)進(jìn)行測(cè)定。彈性模量檢測(cè)樣品直徑為8 mm，壁厚3 mm，長(zhǎng)9 mm。彈性模量=應(yīng)力/應(yīng)變(EapP=Kh/A，K=F/d，其中F為應(yīng)力，d為壓縮長(zhǎng)度，A為材料橫切面積，h為材料長(zhǎng)度)。將壓縮過程的應(yīng)力作為縱軸、應(yīng)變作為橫軸，通過Matlab軟件(The MathWorks)編程生成應(yīng)力應(yīng)變關(guān)系曲線，較為固定的一段直線區(qū)域的斜率即為人工骨彈性模量[11]。三點(diǎn)抗彎強(qiáng)度為在人工骨的兩支點(diǎn)之間施加載荷，至試件破壞時(shí)的單位面積載荷值，由公式δfmax=8FmaxL/πd3計(jì)算出人工骨的抗彎強(qiáng)度(其中Fmax為最大載荷，L為兩支點(diǎn)跨度，d為人工骨直徑)[12]。其中試驗(yàn)機(jī)加載速度為0.1 mm/s(每組測(cè)試5個(gè)樣品)。

1.5 PLLA/β-TCP復(fù)合人工骨的細(xì)胞培養(yǎng) PLLA/β-TCP復(fù)合人工骨無菌PBS清洗3遍后，于20%血清培養(yǎng)基中提前浸泡2 h取出后放入清潔干燥的培養(yǎng)皿中，將制備好的C3H10細(xì)胞懸液(6×106/mL)滴入人工骨，于37 ℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)3 h后加入含血清培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)3 d后將支架取出，用0.9%生理鹽水沖洗支架，4%戊二醛固定過夜，叔丁醇干燥、噴金行掃描電鏡(SEM)檢測(cè)。

1.6 PLLA/β-TCP復(fù)合人工骨浸提液的誘導(dǎo)分化作用 將2 g人工骨加入15 mL的血清培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2條件下孵育7d后離心取上清液，經(jīng)0.22 μm過濾器過濾得到浸提液。按2×103/孔密度將C3H10細(xì)胞接種于12孔板中，每組3個(gè)復(fù)孔，待貼壁后吸去培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組如下：a)GFP陰性對(duì)照組：加入1.5 mL含腺病毒Ad-GFP(20 μg/mL)培養(yǎng)基；b)PLLA組：加入純PLLA人工骨浸提液1.5 mL；c)P/T30組：加入P/T30人工骨浸提液1.5 mL；d)BMP9(Bone Morphogenetic Protein-9)陽性對(duì)照組：加入1.5 mL含腺病毒Ad-BMP9(20 ng/mL)培養(yǎng)基。C3H10細(xì)胞誘導(dǎo)分化至第7天，加入萘酚AS-MX堿性磷酸鹽溶液和快速藍(lán)重氮鹽混合染液250 μL，37 ℃避光孵育30 min，在光鏡下觀察并成像，陽性染色呈藍(lán)紫色。C3H10細(xì)胞誘導(dǎo)分化至第21天，每孔加入300μL的4%多聚甲醛固定10 min，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)洗滌3次。每孔加入300 μL現(xiàn)配的0.4%茜素紅S染液，37 ℃孵育30 min，在光鏡下觀察并成像，陽性染色為桔紅色沉淀。

1.7 PLLA/β-TCP復(fù)合人工骨的組織相容性 選取健康新西蘭大白兔30只，體重2.5～3.0 kg，雌雄不限。待戊巴比妥鈉(30 g/L)耳緣靜脈麻醉生效后制作股四頭肌肌袋及臀肌肌袋，肌袋內(nèi)植入純PLLA人工骨及P/T30組復(fù)合人工骨。植入后1個(gè)月行X線透視觀察復(fù)合人工骨位置及局部炎癥反應(yīng)情況。分別于術(shù)后第1個(gè)月、第2個(gè)月及第3個(gè)月將人工骨連同周圍0.5 cm范圍的組織取出，用10%甲醛固定組織1周，標(biāo)本常規(guī)系列脫水及石蠟包埋固定，常規(guī)切片后行VG染色(Van Gieson染色)，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織對(duì)材料的反應(yīng)情況。按照ISO10993-2007和GB/T16886.1-1997中的組織反應(yīng)分級(jí)方法進(jìn)行評(píng)估。

2 結(jié) 果

2.1 PLLA/β-TCP復(fù)合人工骨的大體觀 臨界骨缺損即骨缺損自身不能愈合，一般認(rèn)為是長(zhǎng)骨長(zhǎng)度的15%或者骨干直徑的1.5～2.5倍[13]。根據(jù)6月齡新西蘭大白兔橈骨的尺寸參數(shù)，得到以下制作人工骨的數(shù)據(jù)。如圖1所示，3D打印的PLLA/β-TCP復(fù)合人工骨為直徑8 mm，長(zhǎng)2 cm的中孔圓柱狀結(jié)構(gòu)，壁厚3 mm，人工骨呈白色，表面粗糙，質(zhì)均勻，人工骨成品的尺寸與3D打印設(shè)計(jì)的幾何模型尺寸基本一致。

a 3D打印模型尺寸 b 樣品大體觀

圖1 PLLA/β-TCP復(fù)合人工骨

2.2 PLLA/β-TCP復(fù)合人工骨的物理性能

2.2.1 PLLA/β-TCP復(fù)合人工骨的微觀結(jié)構(gòu) 如圖2所示，掃描電鏡下可見純PLLA人工骨和含β-TCP人工骨表面粗糙，人工骨內(nèi)部布滿豐富的微孔，微孔直徑分布在20～400 μm之間，孔隙之間存在一定的交通率。隨著β-TCP含量的增加，人工骨粗糙程度增加。豐富的微孔可增加人工骨的表面積，可為細(xì)胞提供足夠的生長(zhǎng)空間。人工骨一定的孔隙交通率有利于細(xì)胞之間的相互作用、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的交換、血管及神經(jīng)的長(zhǎng)入以及鈣鹽的充分沉積。

2.2.2 PLLA/β-TCP復(fù)合人工骨的孔隙率 人工骨的孔隙交通率和研究者的主觀性可能會(huì)影響孔隙率的測(cè)定，因此孔隙率用兩種不同的方法測(cè)定。如圖3所示，用密度法和孔率計(jì)法所測(cè)得的人工骨孔隙率與3D打印設(shè)計(jì)的孔隙率存在一定的差距，這能為后期批量打印植入體內(nèi)的人工骨提供指導(dǎo)性的信息。隨著β-TCP含量的增高，人工骨的孔隙率呈下降趨勢(shì)，用兩種方法測(cè)得的孔隙率結(jié)果趨勢(shì)一致(P>0.05)。這主要是受生物擠壓的影響，擠壓減小了人工骨整體孔隙的容積。此外，β-TCP固體顆粒的增多不同程度地提高了人工骨孔壁的厚度，人工骨的孔隙交通率下降不利于水銀的滲透，這些因素均對(duì)孔隙率的測(cè)定存在一定的影響。

2.2.3 PLLA/β-TCP復(fù)合人工骨的力學(xué)性能 彈性模量是物體彈性變形難易程度的表征，而抗彎強(qiáng)度是外力施壓時(shí)的強(qiáng)度極限，我們通過測(cè)定復(fù)合人工骨的彈性模量及抗彎強(qiáng)度來評(píng)價(jià)其機(jī)械性能。圖4a所示為人工骨的應(yīng)力/應(yīng)變曲線，骨支架的彈性模量在應(yīng)力/應(yīng)變曲線上表現(xiàn)為一段直線區(qū)域的斜率。圖4b所示，β-TCP的加入增加人工骨的韌性，減小其形變，使得彈性模量及抗彎強(qiáng)度相應(yīng)增加，抗彎強(qiáng)度變化趨勢(shì)與彈性模量基本一致。3D打印過程中當(dāng)β-TCP含量為30%時(shí)PLLA與β-TCP能達(dá)到有效穩(wěn)固的結(jié)合，此時(shí)彈性模量可高達(dá)21.1 MPa，三點(diǎn)抗壓強(qiáng)度可高達(dá)9.9MPa。β-TCP的含量超過30%時(shí)復(fù)合人工骨脆性增加，復(fù)合人工骨的彈性模量及抗壓強(qiáng)度驟降而不利于體內(nèi)的應(yīng)用。

2.3 PLLA/β-TCP復(fù)合人工骨的細(xì)胞培養(yǎng) 人工骨細(xì)胞培養(yǎng)是評(píng)價(jià)其細(xì)胞相容性的重要指標(biāo)，也是人工骨用于體內(nèi)的前提之一。如圖5所示，純PLLA人工骨細(xì)胞培養(yǎng)幾乎未發(fā)現(xiàn)C3H10細(xì)胞的爬行生長(zhǎng)，這可能與材料的疏水性質(zhì)不利于細(xì)胞在材料界面吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而增殖有關(guān)。人工骨掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)P/T 20、P/T 30與P/T 40組復(fù)合支架均可見不同程度的細(xì)胞爬行生長(zhǎng)，β-TCP的摻入改善了人工骨的親水性質(zhì)和骨引導(dǎo)性，且β-TCP顆粒可增加復(fù)合人工骨界面的粗糙度，這些因素是影響細(xì)胞能否黏附生長(zhǎng)的關(guān)鍵。

a PLLA組 b P/T20組 c P/T30組 d P/T40組

圖2 不同組分的PLLA/β-TCP復(fù)合人工骨的微觀結(jié)構(gòu)(×100)

圖3 不同組分PLLA/β-TCP a 應(yīng)力-應(yīng)變曲線 b 復(fù)合人工骨的力學(xué)強(qiáng)度復(fù)合人工骨的孔隙率測(cè)定 圖4 不同組分的PLLA/β-TCP復(fù)合人工骨的力學(xué)性能

a PLLA組 b P/T20組 c P/T30組 d P/T40組

注：圖中箭頭所示為C3H10細(xì)胞

圖5 不同組分的PLLA/β-TCP復(fù)合人工骨的細(xì)胞培養(yǎng)(×400)

2.4 PLLA/β-TCP復(fù)合人工骨的細(xì)胞誘導(dǎo)分化 由于P/T 30復(fù)合人工骨具備優(yōu)良的物理性能，我們選擇其作為后續(xù)的研究材料。目前公認(rèn)的能誘導(dǎo)細(xì)胞成骨分化的因子是骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)，包括BMP2、BMP9等。β-TCP的摻入能否改善人工骨的細(xì)胞骨誘導(dǎo)性，我們將表達(dá)BMP9的腺病毒Ad-BMP9感染的細(xì)胞作為陽性對(duì)照，而將表達(dá)綠色熒光蛋白的腺病毒Ad-GFP感染的細(xì)胞作為陰性對(duì)照(如圖6a及圖6b)。堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)是細(xì)胞成骨分化的早期檢測(cè)指標(biāo)，堿性磷酸酶在堿性環(huán)境下將體系中的α-磷酸萘酚鈉水解為α-萘酚，它與重氮鹽偶聯(lián)后形成難溶性藍(lán)紫色沉淀，沉積于表達(dá)酶的細(xì)胞處。如圖6c所示，各組C3H10細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化至第7天行ALP染色，Ad-GFP組及PLLA組幾乎未見藍(lán)染細(xì)胞，P/T30組及Ad-BMP9組可見部分紫藍(lán)染細(xì)胞，其中Ad-BMP9組較P/T30組有較多的藍(lán)染細(xì)胞(P<0.05)。這說明單純的PLLA人工骨不能誘導(dǎo)C3H10細(xì)胞表達(dá)堿性磷酸酶，而β-TCP能誘導(dǎo)C3H10細(xì)胞表達(dá)堿性磷酸酶，此結(jié)果一定程度地說明β-磷酸三鈣具有一定的成骨誘導(dǎo)活性。

鈣鹽沉積是細(xì)胞成骨分化較晚期的檢測(cè)指標(biāo)，茜素紅是陰離子染料，可與晚期沉積的鈣離子以螯合方式形成桔紅色復(fù)合物。如圖6d所示，各組永生化C3H10細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化至第21天行茜素紅染色，Ad-GFP組及PLLA組幾乎未見桔紅色沉淀，P/T30組及Ad-BMP9組可見部分桔紅色沉淀，其中Ad-BMP9組較P/T30組明顯(P<0.05)，此結(jié)果與堿性磷酸酶染色結(jié)果一致，更進(jìn)一步提示β-磷酸三鈣具有一定程度的骨誘導(dǎo)活性。

a 熒光顯微鏡圖

b 光學(xué)顯微鏡圖

c ALP染色

d 茜素紅S染色

2.5 PLLA/β-TCP復(fù)合人工骨植入肌袋試驗(yàn) 人工骨的最終研究目的是應(yīng)用于體內(nèi)，雖然PLLA的最終降解產(chǎn)物為CO2和H2O，而磷酸三鈣降解后釋放的鈣、磷離子能成為機(jī)體鈣磷庫的成分，單一的成分均已被證實(shí)安全而廣泛應(yīng)用于臨床，其安全性可靠。但PLLA/β-TCP復(fù)合人工骨植入體內(nèi)后是否存在炎癥反應(yīng)是我們重點(diǎn)關(guān)注的問題，因此我們進(jìn)行了體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)。X線透視可見人工骨與兔子股骨顯影效果相當(dāng)，這可為支架植入體內(nèi)后降解及新骨沉積的體外攝片評(píng)估提供便利(見圖7a)。如圖7b所示，植入后3個(gè)月，純PLLA人工骨周圍可見充血水腫的組織包裹，組織與人工骨關(guān)系疏遠(yuǎn)，較易分離。而P/T30復(fù)合人工骨周圍組織未見明顯充血水腫，組織與人工骨關(guān)系密切，不易分離(見圖7c)。

a X線透視體內(nèi)復(fù)合人工骨(箭頭所示)

b PLLA人工骨連同周圍0.5 cm組織大體觀

c P/T30復(fù)合人工骨連同周圍0.5 cm組織大體觀

2.6 PLLA/β-TCP復(fù)合人工骨的組織相容性 為了進(jìn)一步研究人工骨的組織相容性，我們對(duì)植入的純PLLA人工骨以及P/T30復(fù)合人工骨連同周圍1 cm的組織進(jìn)行了組織學(xué)評(píng)價(jià)。如圖8所示，人工骨植入后1個(gè)月：PLLA組人工骨初步形成疏松水腫的纖維包囊，包囊組織內(nèi)可見有大量的中性粒細(xì)胞和纖維母細(xì)胞浸潤(rùn)。而P/T 30組人工骨周圍纖維包囊較疏松，纖維包囊有部分中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。人工骨植入后2個(gè)月：PLLA組人工骨表面纖維包囊致密且較厚，纖維包囊有部分中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，周圍組織見少量點(diǎn)狀充血。而P/T30組人工骨周圍纖維包囊致密，纖維包囊有少量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。人工骨植入后3個(gè)月：PLLA組人工骨表面纖維包囊囊壁有變薄趨勢(shì)，包囊內(nèi)仍可見淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，偶見部分炎癥細(xì)胞。而P/T30組人工骨表面局部纖維包囊變薄，由1-2膠原纖維和少量纖維細(xì)胞組成，包囊內(nèi)僅見少許淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。人工骨與周圍組織結(jié)合密切，界限模糊(圖中單向箭頭所示為炎癥細(xì)胞，雙向箭頭所示為纖維包囊厚度)。依照國際及國家醫(yī)療器械的植入后局部反應(yīng)試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)(2003年)，PLLA/β-TCP復(fù)合人工骨在體內(nèi)無反應(yīng)或僅有輕度的組織反應(yīng)，是一種組織相容性良好的支架材料。

注：圖中單向箭頭示炎癥細(xì)胞，雙向箭頭示纖維包囊厚度

3 討 論

自1995年Crane等提出骨組織工程的概念以來，組織工程骨的發(fā)展為人類骨組織缺損的修復(fù)重建帶來了全新的希望。而3D打印技術(shù)的興起，為組織工程骨的構(gòu)建提供了優(yōu)越的條件。利用電腦進(jìn)行輔助設(shè)計(jì)3D生物打印制作的仿生組織工程骨結(jié)構(gòu)更加近似天然骨結(jié)構(gòu)，并可進(jìn)行個(gè)性化定制[14]。

聚乳酸類材料及β-TCP因具備良好的生物學(xué)性能常被研究者利用不同的3D打印技術(shù)來制作組織工程骨。李樹祎等[15]利用低溫快速成型技術(shù)制備了PLGA/TCP的骨修復(fù)支架，其孔隙豐富，生物相容性良好。許國軍等[16]采用3D打印直寫成型技術(shù)制備了不同成分的β-TCP/HA/PLA復(fù)合支架，支架表面粗糙而具有通孔，細(xì)胞骨誘導(dǎo)性明顯。本實(shí)驗(yàn)所選用的PLLA/β-TCP復(fù)合人工骨是在常用組織工程骨材料的基礎(chǔ)上，在熔融沉積造型術(shù)基礎(chǔ)上選用生物擠壓方法制備的新型可生物降解人工骨。

自然骨是無機(jī)納米羥基磷灰石與有機(jī)膠原纖維規(guī)律結(jié)合的產(chǎn)物，具有典型的骨小梁結(jié)構(gòu)，其孔隙率為50%～80%，允許骨母細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在孔隙里的增殖分化及血管的長(zhǎng)入[17]。人體皮質(zhì)骨的彈性模量和抗彎強(qiáng)度分別為1.0～2.5 GPa及100～200 MPa，松質(zhì)骨的彈性模量和抗彎強(qiáng)度分別為50～250 MPa及2～20 MPa[18]。PLLA具備良好的力學(xué)性能，β-TCP的加入可增加其韌性，本研究中3D打印的PLLA/β-TCP復(fù)合人工骨所測(cè)得的彈性模量及壓縮強(qiáng)度接近松質(zhì)骨水平。PLLA/β-TCP復(fù)合人工骨的孔徑分布于20～400 μm。Zhao等[19]研究證實(shí)多孔材料有利于血管化和新骨沉積的最佳孔徑是400 μm，大于該尺度的孔徑對(duì)血管的新生無顯著影響，反而降低材料的機(jī)械性能。Kapat等[20]研究表明孔徑大于50 μm的支架有利于氧氣與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的交換并排除代謝廢物，但細(xì)胞的黏附率及細(xì)胞之間信號(hào)傳遞會(huì)因此降低，而孔徑小于10 μm時(shí)可取得相反的效果。因此，大徑與小徑微孔的結(jié)合更能促進(jìn)血管的新生和骨的生成。

β-磷酸三鈣具有骨引導(dǎo)性，但對(duì)其是否具有骨誘導(dǎo)性的觀點(diǎn)目前還不統(tǒng)一[21-22]。有研究認(rèn)為磷酸三鈣的骨誘導(dǎo)性是由于支架材料的孔隙結(jié)構(gòu)及交通率等幾何因素促進(jìn)了骨形態(tài)發(fā)生蛋白等成骨因子的吸附及沉積導(dǎo)致的[23]。Tsukanaka等[24]認(rèn)為酸性磷酸酶陽性細(xì)胞的募集是高純?chǔ)?磷酸三鈣骨支架具有骨誘導(dǎo)性的關(guān)鍵所在。Syed-Picardl[25]研究證實(shí)磷酸三鈣是一種具有骨誘導(dǎo)性的材料，它通過釋放鈣離子來改變?nèi)S細(xì)胞支架的分化模式，釋放的鈣離子可以調(diào)節(jié)CD43(跨膜蛋白)介導(dǎo)的縫隙連接，增加胞外鈣離子的濃度，誘導(dǎo)細(xì)胞的成骨分化。本研究避免材料界面等因素干擾，利用人工骨浸提液培養(yǎng)細(xì)胞，早期成骨分化后的ALP染色和晚期成骨分化后的茜素紅S染色結(jié)果陽性，提示PLLA/β-TCP復(fù)合人工骨具備一定的骨誘導(dǎo)作用。但其作用是有限的，浸提液中鈣離子濃度可能是主要的影響因素之一，復(fù)合支架中鈣離子的釋放受人工骨結(jié)構(gòu)強(qiáng)度及浸泡時(shí)間的影響。要使人工骨具有明顯的骨誘導(dǎo)性，可以在人工骨中加入骨形態(tài)發(fā)生蛋白等成分。

對(duì)生物相容性的研究常用體外細(xì)胞培養(yǎng)法和體內(nèi)直接植入法(1988年)。本研究中體外細(xì)胞培養(yǎng)可見人工骨中細(xì)胞生長(zhǎng)良好，偽足伸展充分，未見細(xì)胞萎縮溶解現(xiàn)象。體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)組織學(xué)檢測(cè)提示PLLA/β-TCP復(fù)合人工骨早期存在一定的炎癥反應(yīng)。炎癥反應(yīng)是活體組織對(duì)損傷因子所作出的防御反應(yīng)，引起可降解支架材料炎癥反應(yīng)的因素較多，如植入手術(shù)引起創(chuàng)傷的范圍、支架的形狀、支架的表面自由能及表面電荷、支架材料的中間降解產(chǎn)物等[26-27]。PLLA/β-TCP復(fù)合人工骨在體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)后的組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果符合國家醫(yī)療器械的植入后局部反應(yīng)試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

由此可見，3D打印的PLLA/β-TCP復(fù)合人工骨具備優(yōu)良的三維多孔結(jié)構(gòu)，力學(xué)強(qiáng)度佳，具備良好的細(xì)胞相容性及組織相容性，β-TCP的摻入使得復(fù)合人工骨具備一定的骨誘導(dǎo)性，是一種理想的可降解組織工程骨材料。然而，3D打印的組織工程骨仍存在諸多問題，如其孔隙率及孔徑精確度有待提高；3D打印可生物降解材料后期的降解速度與生物力學(xué)、與成骨成血管匹配的關(guān)系有待研究。