王 勤 莊秀妹 何杰玉 張 葉 彭雪珍

牙周膜成纖維細胞(periodontal ligament cells，PDLCs)是牙周韌帶的主要功能細胞，PDLCs數(shù)量減少與結構破壞導致牙周支持組織損傷，誘導或加重牙周組織疾病[1，2]。厭氧菌、咬合創(chuàng)傷、炎癥以及吸煙均可造成牙周微環(huán)境的局部缺血和低氧狀態(tài)，低氧可抑制人PDLCs增殖并促進其凋亡[3]。牙周炎患者牙周組織中的低氧標志蛋白——低氧誘導因子 -1α(Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)水平相比正常人顯著升高[4]。我們前期研究已證實，低氧可以通過激活HIF-1α調(diào)控PDLCs的增殖與凋亡[5]。

p53是關鍵的腫瘤抑制基因，能夠抑制腫瘤細胞的增殖[6]。最新研究發(fā)現(xiàn)，p53在牙周炎組織中升高，并與局部組織的低氧狀態(tài)相關[7]。然而，p53是否參與低氧抑制PDLCs增殖并促進其凋亡？p53與HIF-1α作用關系如何？這些均不清楚？本研究分析常氧和低氧(1%O2)下PDLCs中p53與HIF-1α表達，通過小干擾RNA敲低技術探討p53在低氧環(huán)境下PDLCs增殖及凋亡的作用。

1.材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 FBS、胰酶、DMEM培養(yǎng)基均購自Gibco公司。小鼠抗人HIF-1α、p53、GAPDH單克隆抗體、HRP標記的山羊抗小鼠二抗購于Proteintech公司；反轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自Takara公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自Sigma-Aldrich公司；細胞凋亡試劑盒購自聯(lián)科生物；其余化學試劑為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。常氧組CO2細胞培養(yǎng)箱(5%CO2)購自Thermo，低氧組CO2細胞培養(yǎng)箱(5%CO2、1%O2)為英國New Brunswick生產(chǎn)的GALAXY 48R型號CO2培養(yǎng)箱。

1.2 PDLCs的原代培養(yǎng) 選擇15～22歲患者因正畸需要拔出的前磨牙，拔出時牙根完整，且無牙周、牙體、牙髓、根尖病變，取得患者知情同意。具體方法如下：去除根端血跡，刮取根中1/3牙周膜組織，采用組織塊法以含20%胎牛血清(FBS)、1∶100雙抗的DMEM培養(yǎng)基原代培養(yǎng)PDLCs。約第6天細胞生長達80%，胰酶消化傳代，后繼續(xù)在含10%FBS、1∶100雙抗的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，前5代PDLCs用于實驗。

1.3 四甲基偶氮唑鹽(MTT)細胞活性檢測 將5×103個PDLCs接種于96孔板中，按實驗分組分別于常氧或低氧培養(yǎng)，加入20μL/孔MTT溶液繼續(xù)孵育4h，去除培養(yǎng)液，加入150μL/孔DMSO后低速振蕩10 min使結晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD 490nm處測量各孔的吸光值。該實驗重復三次。

1.4 細胞凋亡實驗 收集經(jīng)低氧及siRNA處理后PDLCs上清液及細胞，PBS洗2次，用1×binding buffer調(diào)整細胞濃度為1×106-7個/mL，取200μL細胞懸液，加入5μL Annexin V-APC后避光孵育15 min，再加入10μL PI，混勻后上機檢測。

1.5 Western免疫印跡 按分組收集PDLCs裂解蛋白進行抽提并定量。取等量總蛋白沸水中煮7min，8%SDS-PAGE電泳分離后，將凝膠上蛋白經(jīng)轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉2h，加入一抗4℃孵育過夜，之后轉入HRP標記的二抗室溫孵育2h，ECL化學發(fā)光顯影掃描。

1.6 實時定量PCR 收集的細胞用Trizol裂解，提取總RNA，紫外分光光度計測量RNA含量。取 1μg RNA合成 cDNA，按 Takara公司Quant SYBR Green PCR kit試劑操作說明進行擴增。應用Primer Premier 5.0軟件設計Real-time PCR引物，HIF-1α引物序列為：Forward 5’-GTGCCACATCATCACCATA-3’，Reverse 5’-CAAAGCGACAGATAACACG-3’；p53 引物序列為：Forward 5’-CAGCACATGACGGAGGTTGT-3’，Reverse 5’-TCATCCAAATACTCCACACGC-3’；內(nèi)參GAPDH序列為：Forw ard 5’-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3’，Reverse 5’-CTGGACTGGACGGCAGATCT-3’。按公式計算求得各樣品基因相對表達量。對照組基因相對表達量為1。

1.7 細胞轉染 HIF1α-siRNA、p53、NC-siRNA均購自上海吉瑪生物科技公司，HIF1α-Si1 靶序列為 5’-CTGATGACCAGCA ACTTGA-3’，HIF1α-Si2 靶序列為：5’-GGAAATGAGAGA AATGCTTAC-3’，p53-Si1 靶序列為5’-CCACUΜGAΜGGAGAGUAUU-3’，p53-Si2靶序列為：5’-TGCGTGTGGAGTATTTGGAT-3’，NC-siRNA 靶序列為：5’-AATTCTCCGAACGTGTCACGT-3’。

根據(jù)說明在六孔板中使用Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent 轉染 PDLCs，并設計陰性對照siRNA為NC-Si組，終濃度為50nM，培養(yǎng)48h，提取蛋白、RNA并進行后續(xù)研究。

1.8 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)以表示。各實驗至少重復3次，采用SPSS13.0軟件包分析結果。對兩組實驗數(shù)據(jù)進行校正t檢驗，若P＜0.05則差異被視為有統(tǒng)計學意義。

2.結果

2.1 低氧促進PDLCs中p53表達 在本研究中，Western免疫印跡證實低氧培養(yǎng)48h后PDLCs的HIF-1α相較常氧組顯著上調(diào)(灰度值：常氧組(56.65±4.35)；低氧組(101.63±10.98)；t=3.888，P=0.018)，與此同時，低氧組PDLCs的p53表達也明顯升高(灰度值：常氧組(81.36±10.93)；低氧組(142.52±7.784)；t＝4.561，P=0.011)；此外，實時定量PCR也在mRNA水平進一步證實低氧狀態(tài)下PDLCs中HIF-1α表達上升3.89倍(t=6.260，P=0.003)，p53表達上升3.07倍(t=6.963，P=0.002)(圖 1)。

圖1 低氧培養(yǎng)48h后PDLCs中HIF-1α與p53蛋白和mRNA水平變化(*：P＜0.05)

2.2 敲低HIF-1α可下調(diào)低氧下PDLCs中p53表達 w estern免疫印跡證實PDLCs中HIF1α-Si1、Si2轉染組相比NC-Si陰性組中HIF-1α分別下降 51.86%(t=4.747，P=0.009)與 53.81%(t=5.355，P=0.006)，而 p53表達分別下降28.54%(t=2.849，P=0.046)與 34.01%(t=3.105，P=0.036)(圖 2)。

2.3 敲低p53不影響低氧下PDLCs中HIF-1α表達 為進一步探討p53是否為HIF-1α的下游因子，PDLCs轉染p53-siRNA，w estern免疫印跡證實PDLCs中p53-Si1、Si2組相比NC-Si陰性組中p53表達分別下降66.52%(t=10.69，P=0.0004)與 71.84%(t=10.79，P=0.0004)，差異具有統(tǒng)計學意義；然而，HIF-1α表達均無明顯變化(t-Si1=0.1793，P=0.866；t-Si2=0.4364，P=0.685)，無統(tǒng)計學差異(圖3)。

圖2 敲低HIF-1α后低氧下PDLCs中HIF-1α與p53蛋白水平變化(*：P＜0.05，與NC-Si組比較)

圖3 敲低p53后低氧下PDLCs中HIF-1α與p53蛋白水平變化(*：P＜0.05)

2.4 敲低p53促進PDLCs增殖 將各轉染組細胞在低氧下培養(yǎng)48h，MTT檢測發(fā)現(xiàn)p53-Si1、Si2組PDLCs吸光度值較NC-Si組分別升高2.04倍(t=5.138，P=0.0068)與 1.87 倍(t=4.112，P=0.0147)，差異具有統(tǒng)計學意義(圖4)。

圖4 敲低p53后低氧對PDLCs細胞活性的影響(*：P＜ 0.05)

2.5敲低p53后可抑制PDLCs凋亡 流式細胞凋亡檢測結果顯示，將各轉染組細胞在低氧下培養(yǎng)48h后，p53-Si1、Si2組PDLCs凋亡細胞數(shù)目比NC-Si組分別減少57.53%(t=12.58，P=0.0002)與54.72%(t=9.798，P=0.0006)，具有統(tǒng)計學差異(圖 5)。

圖5 敲低p53后低氧對PDLCs細胞凋亡的影響(*：P＜ 0.05)

3.討論

PDLCs是牙周組織中含量最豐富的間質細胞，對牙周組織的形成與再生有重要影響。慢性牙周炎組織中毒性物質堆積、毛細血管供血不足，造成牙周微環(huán)境中局部低氧狀態(tài)[9，10]。一般情況下，低氧誘導細胞內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子上升、同時進行無氧代謝，可增加局部氧供給并降低氧消耗，產(chǎn)生適應性調(diào)節(jié)[11，12]。然而，持續(xù)性低氧可導致PDLCs數(shù)量減少和結構破壞，引起牙周組織損傷，誘導或加重牙周組織疾病[13]。

研究發(fā)現(xiàn)，牙周炎患者的牙周組織中低氧標志蛋白——HIF-1α較正常人顯著升高，提示低氧局部牙周微環(huán)境可能與牙周炎的發(fā)生和發(fā)展密切相關[4]。我們前期研究已證實，低氧可以通過激活HIF-1α 調(diào)控 PDLCs的增殖和凋亡[5，14]。Song 等[3]通過鐵螯合劑氯化鈷阻斷氧信號傳遞，建立低氧模型，證實氯化鈷化學建立的低氧環(huán)境可抑制人PDLCs增殖并促進其凋亡。我們前期研究直接通過低氧培養(yǎng)箱建立低氧微環(huán)境，發(fā)現(xiàn)PDLC在低氧下培養(yǎng)48h、72h時細胞增殖活力下降、凋亡增加，隨著低氧處理時間的增加，細胞存活率逐漸降低，進一步提示了長時間低氧環(huán)境是慢性牙周炎發(fā)展的重要原因。此外，低氧促進PDLC中HIF-1α的表達上升，小干擾RNA敲低HIF-1α可逆轉低氧抑制PDLCs增殖與促進其凋亡，說明低氧通過HIF-1α 對 PDLCs的增殖和凋亡起作用[5，14]。

p53是關鍵的腫瘤抑制基因，其編碼的p53蛋白主要分布于細胞核漿，與DNA特異結合，其活性受磷酸化、乙?；?、甲基化以及泛素化等翻譯后修飾調(diào)控。p53好似“基因組衛(wèi)士”，在G1期檢查DNA損傷點，監(jiān)視基因組的完整性，能夠抑制腫瘤細胞的增殖[6]。研究證實，p53在牙周炎組織中升高，并與局部組織的低氧狀態(tài)相關[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，PDLCs在低氧培養(yǎng)后p53協(xié)同HIF-1α一起表達升高，通過小干擾RNA敲低HIF-1α后發(fā)現(xiàn)p53表達也隨之降低，提示p53可能是受低氧與HIF-1α調(diào)控表達；進一步敲低p53表達發(fā)現(xiàn)HIF-1水平無明顯變化，再次說明p53可能是HIF-1α的下游基因。此外，敲低PDLCs中p53表達后，低氧環(huán)境中PDLCs的增殖能力增強、凋亡比例降低，進一步說明p53是低氧抑制PDLCs增殖、促進其凋亡的重要節(jié)點，并受HIF-1α調(diào)控。還研究發(fā)現(xiàn)，低氧可通過HIF-1α介導BNIP與mTOR表達，促進PDLCs發(fā)生自吞噬與凋亡[3]。因此，p53與HIF-1α介導低氧促PDLCs凋亡與牙周炎進展的具體機制仍有待進一步探討。

綜上，本研究在PDLCs中證實低氧能通過上調(diào)p53抑制PDLCs增殖并促進其凋亡，并且p53受HIF-1α調(diào)控。低氧是促進牙周炎發(fā)生與發(fā)展的重要因素，靶向降低PDLCs中HIF-1α和p53表達可能是防治牙周炎的研究重點。