姜之歆，王從容

(上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院內分泌代謝科，上海市糖尿病研究所，上海市糖尿病重點實驗室，上海市糖尿病臨床醫(yī)學中心，上海 200030)

隨著組織工程相關研究與日俱增，干細胞治療越來越被關注[1,2]。干細胞自我更新及體外多向分化能力旺盛，可間接分泌多種細胞因子和調節(jié)免疫，常被用來作為治療疾病的種子細胞，其中用于神經細胞移植療法的主要有胚胎干細胞(embryonic stem cell，ESC)、神經干細胞(neural stem cell，NSC)以及其他來源的間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)[3-5]。ESC取材不易和倫理問題限制了其廣泛應用，NSC需自體有創(chuàng)取材，提取與培養(yǎng)均十分不易。目前已有研究證實骨髓來源的MSC可在體外成功分化為神經細胞[6,7]，在細胞治療中被廣泛研究。人尿源干細胞(human urinary stem cells,hUSC)因便于取材、來源簡易、安全無創(chuàng)等特點，臨床應用前景廣闊[8-10]。Zhang等[11]首次報道從人尿液中分離獲得一種具有多向分化潛能的干細胞，并鑒定了其 MSC的生物特性，表達CD29、CD44、CD73、CD90等MSC標志物，并可體外成功分化為脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞等。目前對hUSC分化為神經細胞的相關報道較少，且結果不一。為進一步研究hUSC分化為神經細胞(包括NSC、膠質細胞、神經細胞)的可行性，本研究對既往文獻中報道的經典MSC成神經誘導液，以及hUSC成神經誘導液成分做了整合調整，對hUSC向神經類細胞定向分化潛能進行了研究，以期為hUSC在中樞神經系統(tǒng)疾病方面的應用提供新依據。

1 材料與方法

1.1 hUSC的培養(yǎng)和傳代

我們收集了3例健康成人無菌新鮮中段尿液200 ml，加入5 ml青鏈霉素混勻，分裝至4管50 ml離心管，400轉/min離心10 min后棄上清，加入20 ml磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)吹打混勻，繼續(xù)400轉/min離心10 min，棄上清，hUSC培養(yǎng)基重懸后接種于0.1%明膠包被的6孔板中(2 ml/孔)，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。hUSC培養(yǎng)基成分包括：含F(xiàn)12 Dulbecco改良型基礎培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified eagle medium/nutrient mixture F-12,DMEM/F12)、2%胎牛血清、10 ng/ml表皮細胞生長因子(epidermal growth factor，EGF)、2 ng/ml血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、1 ng/ml轉化生長因子(transforming growth factor，TGF)、2 ng/ml重組人成纖維細胞生長因子(recombinant human fibroblast growth factor,hFGF)、0.5 mmol/L氫化可的松、24 mg/ml胰島素、20 mg/ml轉鐵蛋白、549 ng/ml腎上腺素、125 ng/ml三碘甲狀腺原氨酸。原代細胞培養(yǎng)3 d后觀察細胞生長情況，并添加培養(yǎng)基1 ml/孔，經7～10 d培養(yǎng)，待hUSC融合率80%～90%時，使用0.25%胰蛋白酶消化傳代，用于后續(xù)實驗。本研究經上海市第六人民醫(yī)院倫理委員會審核各項通過。

1.2 hUSC表面標志物檢測

選取P4 hUSC，PBS洗滌2遍，加入0.25%胰蛋白酶消化，1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)洗滌后重懸細胞計數(shù)，調整細胞密度至106/ml。取細胞懸液200 μl加入藻紅蛋白(phycoerythrin,PE)標記的單克隆抗體CD29、CD73、CD90、CD34和HLA-DR，以及異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標記的單克隆抗體 CD44、CD31、CD45至各流式管，并以相應的熒光標記的IgG抗體為同型對照組。冰上避光孵育30 min, 孵育后200轉/min 離心5 min，使用PBS清洗游離抗體，200轉/min 再次離心5 min，最終用1%BSA重懸細胞至200 μl，經Guava easyCyte (Millipore, USA)流式細胞儀檢測。

1.3 成神經分化檢測

取P4代hUSC，以5×104/ml濃度接種于6孔板，待其融合度達90%～100%時，按預處理、分化誘導兩個階段進行實驗。(1)預處理階段，使用低糖DMEM、10%胎牛血清、100 ng/ml hFGF 預誘導24 h，之后各孔分別更換成對應的誘導液。(2)分化階段采用不同成分的成神經誘導液誘導14 d。A成神經誘導液是使用經典誘導方案[12]：DF-12培養(yǎng)基，添加50 ng/ml hFGF、50 ng/ml EGF、10 ng/ml 腦源性神經營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，bDNF)。B成神經誘導液參照既往文獻報道的hUSC成神經誘導液成分[13]：DF-12培養(yǎng)基，添加50 ng/ml hFGF、50 ng/ml EGF、2% B27神經細胞培養(yǎng)添加劑、1% 非必需氨基酸(non-essential amino acids，NEAA)、1% L-谷氨酸、1%胰島素-轉鐵蛋白-硒(insulin-transferrin-selenium,ITS)溶液。C成神經誘導液在經典誘導方案(A)基礎上添加了其他促成神經分化成分，包括0.1%的二甲基亞砜、0.1 mmol/L丁基羥基茴香醚。D成神經誘導液除將DF-12培養(yǎng)基更換為低糖DMEM培養(yǎng)基，其他成分和C成神經誘導液相同。對照組不進行成神經誘導分化。誘導液隔天換液，誘導至第14天時，熒光倒置顯微鏡下觀察各誘導液中細胞形態(tài)變化。

1.4 逆轉錄-聚合酶鏈反應檢測

我們檢測了神經干細胞特異性標志物Nestin, 成熟神經細胞特異性標志物β3-tublin與NF-200，膠質細胞前體特異性標志物S100的表達情況。Trizol法常規(guī)提取細胞總RNA，cDNA 提取參照Superscript Ⅲ Fast-Strand Synthesis System(Invitrogen) 試劑盒說明。逆轉錄-聚合酶鏈反應參照 Powerup Sybr Green Master Mix (Thermo Fischer Scientific) 反應體系，終CT值上機由LightCycler 480 system測得。引物定量標準依據內參GAPDH。引物序列由Primer-BLAST 在線設計獲得，由上海生物工程有限公司合成,正反引物如下(表1)。

表1 Nestin、S100、β3-tublin、NF-200、GAPDH基因引物序列

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 hUSC原代培養(yǎng)鑒定

正常人尿液經離心、重懸、接種至6孔板后7～10 d開始出現(xiàn)克隆微團，貼壁生長(圖1A)。 細胞緊密排列，形態(tài)均一，呈短梭形或米粒樣，14 d左右克隆融合率達90%～100%，此時對其進行傳代，即得到P1代hUSC(圖1B)。細胞增殖迅速，經多次傳代，細胞形態(tài)未見明顯改變(圖1C)。

2.2 hUSC的MSC特性

P4代hUSC表面標志物流式細胞術鑒定結果顯示，hUSC高表達CD29(99.64%)、CD44(97.22%)、CD73(99.44%)、CD90(71.14%)，不表達CD31(2.66%)、CD34(0.62%)、CD45(2.22%)、HLA-DR(0.60%)，提示其MSC來源具備多向分化潛能 (圖2)。

2.3 hUSC細胞誘導分化為神經細胞檢測

誘導至第14天時，A成神經誘導液中細胞形態(tài)緊密，未發(fā)現(xiàn)明顯改變(圖 3A)，Nestin、S100、β3-tublin、NF-200基因不表達(圖 4)。B成神經誘導液中細胞胞體回縮飽滿、折光度變強，呈現(xiàn)神經細胞樣突起(圖 3B)，C成神經誘導液中細胞形態(tài)飽滿，折光度變強(圖 3C)，D成神經誘導液中細胞形態(tài)亦出現(xiàn)類似神經細胞樣改變(圖 3D)。相比A成神經誘導液，B、C和D成神經誘導液中細胞Nestin、S100基因表達水平增高，B和D成神經誘導液中細胞β3-tublin、NF-200基因表達水平降低。其中C成神經誘導液中細胞Nestin基因表達水平高于B和D成神經誘導液中細胞，B成神經誘導液中細胞S100基因表達水平高于C和D成神經誘導液中細胞，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05；圖 4)。

3 討 論

hUSC的來源方式簡易，可對同一供體進行多次取材，是理想的自體種子細胞來源。既往研究中對hUSC體外誘導多能干細胞后進行成神經分化研究較多，或是通過轉導內源性基因建立hUSC來源的NSC模型，進而再向神經細胞分化[12-14]。然而， 直接對hUSC進行體外成神經分化的研究較少,且結果不盡一致。Guan等[15]的研究結果表明hUSC體外成神經分化時NSC特異性標志物Nestin、Sox2表達水平增高，而終末成熟神經細胞標志物如β3-tublin表達水平未增高,提示hUSC可向神經前體細胞分化。Bharadwaj等[16]的研究表明hUSC體外成神經誘導可成功表達NSC特異性標志物Nestin及成熟神經細胞標志物NF-200，但膠質細胞特異性標志物S100表達水平未增高，提示特定培養(yǎng)條件下hUSC可向神經細胞定向分化。

圖1 hUSC原代培養(yǎng)

圖2 原代hUSC表面標志物流式細胞術鑒定

hUSC: human urinary stem cells. hUSC was identified by flow cytometry using the surface markers CD29,CD44,CD73,CD90,CD31,CD34,CD45 and HLA-DR. White solid peaks represent the isotype controls and the grey solid peak represents the marker indicated.

圖3 hUSC 分別在4種成神經誘導液中誘導至第14天時的形態(tài)變化

圖4 hUSC經4種成神經誘導液誘導至第14天時Nestin、S100、 β3-tublin、NF-200的相對表達水平

本研究結果表明，我們成功從健康成人尿液中提取出hUSC，并鑒定了其MSC來源。在體外成神經分化研究中，A成神經誘導液誘導過程中未見任何細胞形態(tài)改變及神經細胞相關基因表達，可能由于MSC來源不同，該誘導液最多報道用于人臍帶MSC的成神經分化[13，17]，可能并不適合用于hUSC。成神經誘導液14 d后，B、C、D誘導液中細胞胞體均出現(xiàn)回縮、折光度增加，呈現(xiàn)類似神經樣細胞的改變，提示開始向神經細胞轉變。逆轉錄-聚合酶鏈反應結果顯示hUSC經過B、C、D成神經誘導液誘導14 d后，NSC特異性標志物Nestin表達水平均顯著上調，其中C成神經誘導液中細胞Nestin表達水平最高(P<0.05)，提示C成神經誘導液最有利于hUSC向NSC分化。B、C、D成神經誘導液中膠質細胞前體標志物S100表達量亦均顯著上調，其中B成神經誘導液中細胞S100表達水平最高(P<0.05)，提示B成神經誘導液最有利于hUSC向膠質前體細胞分化。而成熟神經元細胞特異性標志物β3-tublin與NF-200基因在4種成神經誘導液中表達水平未增高，β3-tublin在B、D成神經誘導液中反而有所降低。以上結果初步表明B、C、D成神經誘導液均有助于誘導hUSC向神經類細胞分化，分化的細胞表達NSC特異性標志物Nestin，以及膠質細胞亞群的前體標志物S100，但未能形成成熟的神經細胞。

本研究hUSC成功分化為神經前體細胞，后續(xù)實驗將從神經前體細胞向成熟神經細胞或成熟神經膠質細胞入手，通過細胞超微結構、神經電生理特性、分子生物學功能等角度進一步驗證，hUSC極有可能成為干細胞治療神經系統(tǒng)疾病的重要“種子細胞”。