劉媚娜，蘇看看，張海月，金艷慧，楊麗紅，李小龍，王明山

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗中心，浙江 溫州 325015）

蛋白C（protein C，PC）是由肝臟合成的一種維生素K依賴性糖蛋白，為機(jī)體PC抗凝系統(tǒng)中的中心成分，其本身是無活性的酶原，在體內(nèi)被水解成活化蛋白C（activated protein C，APC）。APC具有抗凝、促纖溶和維持血管內(nèi)皮屏障穩(wěn)定等功能[1]。PC缺乏可使機(jī)體處于高凝狀態(tài)，易導(dǎo)致血栓形成。遺傳性PC缺陷癥通常為常染色體顯性遺傳，與蛋白C基因（PROC）的突變有關(guān)[2]。本研究對1例遺傳性PC缺陷癥家系進(jìn)行實驗室表型檢測和基因突變分析，發(fā)現(xiàn)了導(dǎo)致該家系致病的PROC基因突變位點，并采用生物信息學(xué)軟件對突變位點進(jìn)行分析，初步探討其分子致病機(jī)制。

1 對象和方法

1.1 對象 先證者，女，39歲，5年前患有“下肢深靜脈血栓形成”，之后長期不規(guī)則口服華法林進(jìn)行抗凝治療。2周前，由于自行停用華法林5 d，后因下肢疼痛而入院。輔助檢查顯示，左腿深靜脈血栓形成，抗核抗體（antinuclear antibody，ANA）陽性，血漿PC活性（PC∶A）為39%（70%～130%），其他凝血相關(guān)指標(biāo)均在參考范圍內(nèi)，被診斷為“PC缺乏、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）、下肢深靜脈血栓形成和疑似鼻竇血栓形成”。住院后期，頭顱MRI顯示靜脈竇血栓形成和腦梗死，尿激酶溶栓治療后死于顱內(nèi)出血。共調(diào)查先證者及家系其他成員3代6人，肝、腎功能均無異常。先證者的父親在47歲時死于腦靜脈竇血栓形成，哥哥在44歲時因肺靜脈栓塞而死亡。家系遺傳圖譜見圖1。選擇100名健康體檢者建立本次實驗室凝血表型指標(biāo)正常參考值和用于突變多態(tài)性的篩查。年齡22～56歲，男53名、女47名，無肝、腎功能異常且無其他基礎(chǔ)性疾病。本通過本院倫理委員會審查，實驗前所有受檢者均簽署知情同意書。

圖1 遺傳性PC缺陷癥家系圖

1.2 方法

1.2.1 樣本采集及處理：采集受檢者外周靜脈血2.7 mL，以109 mmol/L枸櫞酸鈉1∶9抗凝，3 000 r/min離心10 min，上層血漿用于凝血指標(biāo)檢測，2 h內(nèi)檢測完畢；下層血細(xì)胞用于提取基因組DNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測序。

1.2.2 血漿表型指標(biāo)檢測：在Stago STA-R全自動血凝儀（法國Stag公司）上用發(fā)色底物法檢測血漿PC∶A、蛋白S活性（PS∶A）和抗凝血酶活性（AT∶A），免疫比濁法檢測D-二聚體（D-D）。采用ELISA法檢測蛋白C抗原（PC∶Ag）（試劑盒均購自溫州長風(fēng)公司）。

1.2.3 PROC基因檢測：基因組DNA提取試劑盒提取先證者及家系成員外周血基因組DNA。參照文獻(xiàn)[3]設(shè)計合成PCR引物（由上海桑尼生物科技有限公司合成）。在ABI Thermalcycler 2720上PCR擴(kuò)增PROC基因所有外顯子及側(cè)翼序列。PCR體系為25 μL。PCR反應(yīng)程序為：①在95 ℃變性5 min；②變性（95 ℃）、退火和延伸（72 ℃）各30 s，共30個循環(huán)；③72 ℃再延伸10 min?；蚪MDNA提取及PCR擴(kuò)增試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司。純化后的PCR產(chǎn)物送上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行正、反向測序。在Blast上比對測序結(jié)果與美國NCBI基因文庫的PROC基因序列，找尋突變位點。選擇100個個體以排除多態(tài)性。家系成員基因檢測僅限先證者基因突變區(qū)域。

1.2.4 FV Leiden突變和凝血酶原20210G＞A突變檢測：對先證者的F5基因第10外顯子和F2基因第14外顯子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序分析。

1.2.5 蛋白質(zhì)生物學(xué)特性分析：用ClustalX-2.1-win判斷突變氨基酸在物種進(jìn)化過程中的保守性。用PolyPhen-2評估突變氨基酸對PC功能和/或結(jié)構(gòu)的可能影響。通過Swiss-PdbViewer軟件和PIC程序分析突變引起蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的改變。

2 結(jié)果

2.1 凝血指標(biāo)檢測結(jié)果 先證者、其兒子和二姐的血漿PC∶A與PC∶Ag均平行下降，為39%～58%。先證者的D-D為20.0 mg/L。先證者的母親、大姐和丈夫的PC和D-D均在正常范圍內(nèi)。所有家庭成員的PS∶A和AT∶A都正常。見表1。

2.2 基因突變檢測結(jié)果 先證者、其兒子和二姐均在PROC基因的9號外顯子攜帶c.997G＞A雜合錯義突變，導(dǎo)致p.Ala291Thr，家系其他成員均為野生型（見圖2及表1）。該基因型結(jié)果與血漿PC表型結(jié)果一致。在100個對照個體中未檢測到此突變，初步排除基因多態(tài)性可能，經(jīng)查閱文獻(xiàn)和人類基因突變數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)其為新的突變。

表1 遺傳性PC缺陷癥家系成員表型及基因型檢測結(jié)果

圖2 PROC基因第9外顯子測序結(jié)果

2.3 蛋白質(zhì)生物學(xué)特性分析 同源序列比對結(jié)果表明Ala291在9種同源物種中不是高度保守。Poly-Phen-2軟件評分為0.850，提示“可能有害的”。蛋白質(zhì)模型分析顯示：在野生型PC中，非極性疏水的Ala291不與其他氨基酸連接。突變?yōu)闃O性親水的Thr291后，Thr291與Pro327之間新增一氫鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變（見圖3）。

圖3 PC蛋白質(zhì)模型圖

3 討論

PC系統(tǒng)是體內(nèi)重要的生理性抗凝系統(tǒng)，PC活化后與輔助因子蛋白S結(jié)合，滅活活化的凝血因子V（FVa）和活化的凝血因子V III（FV IIIa），限制凝血酶的產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗凝作用。PC缺陷癥常導(dǎo)致血栓形成，通常表現(xiàn)為靜脈血栓，而且PC水平越低，血栓形成的趨勢越高[4]。國外研究表明雜合子PC缺陷癥在有遺傳性血栓形成傾向的家庭和健康人口中的發(fā)生率分別為6%和0.2%[5-6]。在中國，PC缺陷癥在靜脈血栓患者的患病率約為8%[7]。本研究中，先證者因左腿深靜脈血栓入院，輔助檢查發(fā)現(xiàn)血漿PC∶A為39%，PC∶Ag為45%?；蚍治鲲@示PROC基因第9號外顯子存在c.997G＞A雜合突變，導(dǎo)致p.Ala291Thr突變。其兒子和二姐亦存在該雜合突變。排除FV Leiden突變和凝血酶原20210G＞A突變等其他因素，診斷為I型遺傳性PC缺陷癥。根據(jù)家系圖的顯示，推測此突變遺傳自其父親，由于先證者父親已故未能采集到樣本。家系成員中，先證者、其兒子和二姐均攜帶p.Ala291Thr雜合突變，兒子和二姐無靜脈血栓形成臨床表現(xiàn)，而先證者具有嚴(yán)重的復(fù)發(fā)性靜脈血栓栓塞，可能原因是先證者同時患有SLE，APC抵抗加劇了血栓形成[8]。PROC基因缺陷患者是否出現(xiàn)血栓形成臨床癥狀可能是多種環(huán)境因素（如妊娠、外傷、服用避孕藥、吸煙、長期制動等）與基因突變共同作用的結(jié)果[9]。

PC缺陷癥按照產(chǎn)生的原因不同可分為遺傳性PC缺陷癥和獲得性PC缺陷癥。遺傳性PC缺陷癥通常由PROC基因突變所致。PROC基因位于2號染色體2q13-q14，包括9個外顯子和8個內(nèi)含子。外顯子9區(qū)由886個堿基組成，前590個堿基編碼PC第224至第419位氨基酸，均在重鏈區(qū)，主要為C端絲氨酸蛋白酶區(qū)域，是PC的活性區(qū)域[10]。該家系攜帶的p.Ala291Thr雜合錯義突變位正發(fā)生于此區(qū)，可能影響PC活性。進(jìn)一步研究表明，Ala291位于PROC基因的催化結(jié)構(gòu)域（催化三聯(lián)體：H211-D257-S360），其主要包括Ca2+結(jié)合環(huán)（殘基225-235）和自溶環(huán)（殘基302-317）[11]。自溶環(huán)有助于穩(wěn)定蛋白質(zhì)的活化肽，在APC的抗凝血功能中起關(guān)鍵作用，在Ca2+結(jié)合環(huán)的共同作用下水解滅活FVa[12]。蛋白質(zhì)模型分析顯示Ala291位于自溶環(huán)附近的催化區(qū)域。Ala291被Thr291取代后，Thr291與Pro327形成額外的氫鍵，形成的超強(qiáng)分子間力可能會擾亂催化活性，導(dǎo)致PC活性的降低。

綜上所述，本研究中我們對1個遺傳性PC缺陷癥家系進(jìn)行實驗室表型和基因型進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)了p.Ala291Thr雜合錯義突變，并通過生物學(xué)分析軟件初步探討了其可能的分子致病機(jī)制，認(rèn)為該家系PC水平減低與p.Ala291Thr雜合錯義突變有關(guān)，但其確切的分子致病機(jī)制有待進(jìn)一步研究。