李佳萍，江燕，王豆豆，余方芳，程躍躍，劉哲

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 眼視光學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 超聲影像科，浙江 溫州 325027）

納米級(jí)超聲造影劑具有體積小，可以自由通過(guò)血管內(nèi)皮，在血液循環(huán)中穩(wěn)定性強(qiáng)[1]，較強(qiáng)的高通透性和滯留效應(yīng)（enhanced permeability and retention effect，EPR）的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，這為納米泡靶向診斷和治療血管外病變組織的應(yīng)用提供了理論依據(jù)[2-3]。磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）和超聲成像（ultrasond，US）由于分別具有較高的空間分辨率和較好的實(shí)時(shí)成像能力，被認(rèn)為是2種互補(bǔ)的成像技術(shù)[4]。在本研究中，我們利用聚氰基丙烯酸丁酯（poly butyl cyanoacrylate，PBCA）乳化聚合物和超順磁性氧化鐵（ultrasmall superparamagnetic iron oxide，USPIO）納米粒子為原料，開(kāi)發(fā)了聚合物納米氣泡，并研究了其在超聲下的信號(hào)強(qiáng)度。

1 材料和儀器

1.1 材料 氰基丙烯酸丁酯（butyl cyanoacrylate，BCA）購(gòu)于德國(guó)Sichel Werke公司，三氯化鐵（FeCl3）、四水氯化鐵（FeCl2·4H2O）、Triton X-100和聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidon，PVP）購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司，明膠購(gòu)自德國(guó)Merck公司，氫氧化銨溶液（ammonium hydroxide solution，NH3·H2O，25%）購(gòu)于北京百靈威公司。

1.2 儀器 Heraeus Multifuge離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fischer公司），IKA-T25分散機(jī)（德國(guó)IKA公司），Elan-DRCII電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國(guó)Perkin Elmer公司），Beckmann計(jì)數(shù)器（美國(guó)Beckmann公司），Vevo2100超聲掃描儀（加拿大Visualsonics公司）。

2 方法

2.1 不同粒徑氣泡的制備 在含有0.02%表面活性劑Tri-tonx-100的酸性水溶液（pH=2.5）中加入單體BCA，攪拌1 h后形成微泡懸浮液，合成了PBCA微氣泡。懸浮液經(jīng)過(guò)浮懸過(guò)程，將充滿空氣的微氣泡與無(wú)空氣的微氣泡分離。將充滿空氣的PBCA微氣泡轉(zhuǎn)移到50 mL的離心管中，用離心機(jī)以500～10 000 r/min的速度進(jìn)行離心后得到PBCA納米氣泡。研究不同的離心條件之下得到的氣泡的粒徑大小。

2.2 含鐵聚合物納米氣泡（UPNBs）的制備 取300 mL去離子水和Triton X-100（3 mL，5.0 mmol/mL）放置于燒杯中在室溫下攪拌，向燒杯中滴加鹽酸（1 mol/mL）調(diào)節(jié)pH值至2.5。隨后，將10 mL預(yù)先制備的USPIO納米粒子懸浮液加入混合物中，攪拌2 min后，用注射器滴加28.3 mmol/L BCA 3 mL，然后在室溫下機(jī)械攪拌（4 000 r/min）1 h。混合液靜置至泡沫沉降后，將乳化液轉(zhuǎn)移到1 L分離漏斗中，重力浮選4 d。丟棄底部的清澈溶液，上層固體泡沫被重新懸浮在0.02%的Tritonx-100（pH=7.0）中。該工藝重復(fù)3次后，進(jìn)行離心，純化UPNBs懸浮液。500 r/min離心UPNBs懸浮液20 min，收集上層白色凝固氣泡，再將其分散于0.02% Tritonx-100溶液（pH=7.0，50 mL）中，重復(fù)3次后保存于4 ℃。

2.3 UPNBs的表征 用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測(cè)定不同配料所制備的納米氣泡中鐵的含量，每批測(cè)定一式三份，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1%。用計(jì)數(shù)器分析UPNBs的平均直徑和濃度。

2.4 US檢測(cè) 將不同粒徑氣泡（40個(gè)/mL）分散于2.5%（w/v）明膠水溶液中制備成超聲體模，明膠固定在成像面板上，換能器（中心頻率為25 MHz）垂直定位于明膠體模。首先在一個(gè)預(yù)定好的4.5 s連續(xù)成像模式中運(yùn)行超聲成像，然后用一個(gè)破壞性脈沖（高機(jī)械指數(shù)）來(lái)測(cè)量背景信號(hào)。在凝膠體模上隨機(jī)選取5個(gè)不同位置（15 mm×15 mm）作為感興趣區(qū)域（region of interest，ROI），分別測(cè)量PBCA-納米氣泡、PBCA微泡和UPNB聚合氣泡被破壞前后的信號(hào)強(qiáng)度（signal intensity，SI）變化趨勢(shì)。對(duì)比強(qiáng)度（contrast intensity，CI）是通過(guò)從總SI（氣泡破壞前）中扣除背景信號(hào)（氣泡被破壞后）來(lái)計(jì)算的。

3 結(jié)果和討論

3.1 氣泡制備方法的優(yōu)化 前期報(bào)道指出由于材料和制備工藝的不同，氣泡在粒徑和成像效果上有很大的差異[5-6]。在本研究中，我們首先采用一鍋乳化聚合法把PBCA制備成氣泡，然后采用簡(jiǎn)單的機(jī)械攪拌法制備納米氣泡[7]。如表1所示，隨著攪拌速度從500 r/min增加到10 000 r/min，氣泡的尺寸從納米級(jí)（45 nm）變?yōu)槲⒚准?jí)（2.34 μm），因此可以通過(guò)調(diào)整攪拌速度來(lái)制備不同尺寸的氣泡，以滿足超聲造影的不同需求。通過(guò)對(duì)攪拌所形成的氣泡進(jìn)行再離心，氣泡尺寸從2.34 μm減小到900 nm，且隨著離心時(shí)間的增加，氣泡尺寸呈現(xiàn)出一個(gè)平臺(tái)，這說(shuō)明用這種方法獲得更小的氣泡是不可行的，見(jiàn)表2。重要的是，納米氣泡和微泡都表現(xiàn)出長(zhǎng)期穩(wěn)定性，微泡的大小在12個(gè)月內(nèi)從2.34 μm變化到2.11 μm，納米氣泡的大小在4個(gè)月內(nèi)從197.2 nm變?yōu)?09.2 nm。此結(jié)果也與VAN EETEN等[8]的發(fā)現(xiàn)相符合，即氣泡的平均尺寸受旋轉(zhuǎn)速度、氣體流量、流體密度和黏度的影響。納米氣泡于2004年首次應(yīng)用于超聲波，OEFFINGER等[2]開(kāi)發(fā)出一種含有全氟丙烷的納米級(jí)造影劑，其粒徑大小為380 nm至780 nm，并有良好的超聲波對(duì)比度。這些具有納米級(jí)尺寸的氣泡被定義為納米氣泡。它可以向腫瘤組織內(nèi)滲出。由于腫瘤血管缺乏緊密連接，納米氣泡可在腫瘤組織中積累從而實(shí)現(xiàn)被動(dòng)靶向成像[9-10]。另一方面，通過(guò)表面修飾，納米氣泡也可以識(shí)別腫瘤表面的特定分子，并與其結(jié)合，實(shí)現(xiàn)主動(dòng)靶向成像或腫瘤特異性成像。因此，納米氣泡在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[11]。微泡作為超聲分子成像的造影劑和載體，它被用作血池造影劑難以通過(guò)病變組織的血管壁，因此盡可能減少微泡大小使之能夠透過(guò)血管壁到達(dá)組織是非常必要的[12]。

表1 不同攪拌速度下氣泡粒徑的大小

表2 不同離心時(shí)間下氣泡粒徑的大小

3.2 不同粒徑氣泡在超聲成像中的信號(hào)強(qiáng)度 采用超聲體模成像技術(shù)，研究了超聲場(chǎng)中不同大小氣泡的增強(qiáng)效果。通過(guò)計(jì)算CI來(lái)定量評(píng)價(jià)它們?cè)诔暡ㄖ挟a(chǎn)生背向散射信號(hào)的能力。結(jié)果顯示，粒徑為45 nm的氣泡具有極弱的信號(hào)，隨著氣泡粒徑增加，超聲信號(hào)逐漸增加，當(dāng)氣泡粒徑增加至312.2 nm時(shí)，其產(chǎn)生的信號(hào)與微泡（2.34 μm）產(chǎn)生的信號(hào)相當(dāng)，見(jiàn)圖1。這證實(shí)了氣泡粒徑尺寸越小，背向散射信號(hào)越弱[13]，同時(shí)說(shuō)明了適當(dāng)粒徑的納米氣泡可具有微泡成像信號(hào)強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。對(duì)比增強(qiáng)超聲是利用造影劑增強(qiáng)病變與周圍組織之間的超聲回波信號(hào)，檢測(cè)和診斷疾病的技術(shù)[14]。

圖1 不同尺寸納米氣泡在超聲體模實(shí)驗(yàn)中的成像對(duì)比強(qiáng)度

3.3 不同含鐵濃度的UPNBs的表征 為了實(shí)現(xiàn)MRI/US雙重成像，必須為MRI和US模式開(kāi)發(fā)一種對(duì)比劑[15-16]。SONG等[17]構(gòu)建了具有MR T2成像功能和US圖像對(duì)比度的超順磁性自組裝微泡（superparamagnetic self-assembled microbubbles，SAMBs）作為MRI/US雙重造影劑，新型造影劑在體內(nèi)具有良好的生物相容性。因此，構(gòu)建一種應(yīng)用于MRI/US的混合造影劑是可以實(shí)現(xiàn)的，但大多數(shù)研究[18]都使用微米級(jí)的氣泡作為雙重造影劑的基礎(chǔ)，而后者僅限于血液池。因此，制備納米級(jí)別的雙重造影劑是必要且可行的[19]。

本研究結(jié)果顯示了4 000 r/min攪拌速度制備的不同鐵含量的UPNBs的性質(zhì)。當(dāng)雜化氣泡中鐵的含量越高，水溶液顏色越暗。雜化氣泡里鐵的含量為3.76 mg/L時(shí)，其粒徑為342 nm，當(dāng)鐵含量增加至44.92 mg/L時(shí)，其粒徑為346 nm，只有小幅度的變化，這說(shuō)明了鐵的含量對(duì)聚合氣泡粒徑大小沒(méi)有明顯的影響。把含鐵量不同的雜化氣泡制備成成像體模，在相同超聲成像條件下，與單純的PBCA納米氣泡相比，鐵含量不同的納米氣泡產(chǎn)生了相似的背向散射信號(hào)。這表明純納米氣泡是超順磁性氧化鐵合適的載體，含鐵的雜化氣泡有良好的背向散射能力，這使得UPNBs可以作為核磁共振與超聲雙模態(tài)成像的造影劑。見(jiàn)圖2。

表3 不同批次納米氣泡粒徑大小和鐵含量

圖2 不同含鐵量的聚合物鈉米氣泡在超聲體模中的成像對(duì)比強(qiáng)度

綜上所述，本研究提出了一種適用于不同尺寸納米氣泡的機(jī)械攪拌方法，并對(duì)其超聲成像性能進(jìn)行了表征，在4個(gè)多月的時(shí)間里，納米氣泡在溶液中表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。體模實(shí)驗(yàn)證明單純納米氣泡與聚合納米氣泡均適用于超聲成像，更重要的是，UPNBs作為混合成像劑，可能是MRI引導(dǎo)下的藥物和基因傳遞的潛在載體。