趙 元，高 雅，陳新梅，徐愛萍，丁志遠(yuǎn)

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355)

雪菊是菊科金雞菊屬兩色金雞菊(CoreopsistinctoriaNutt.)的干燥頭狀花序[1]，含有300多種成分[2]，總黃酮為主要活性成分，具有降血脂、降血壓、抗衰老等作用?？傸S酮含量測定多采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法，該法不僅黃酮類在堿性環(huán)境下能顯色，而且含有鄰二酚羥基的酚酸類也能顯色，使結(jié)果偏高[3]。因此選擇適合的顯色法具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法、AlCl3-KAc顯色法、三乙胺顯色法分別測定總黃酮含量，優(yōu)選最佳方法。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

UV-5100紫外可見分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)；FA1004電子分析天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司) 。

1.2 藥品與試劑

藥材：雪菊(新疆華草醫(yī)藥科技有限公司，批號：20171026)，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院徐凌川教授鑒定為菊科金雞菊屬兩色金雞菊(CoreopsistinctoriaNutt.)的頭狀花序。

試劑：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉，批號：Y06J8S37439，純度≥98%)。三乙胺(天津科密歐，批號：20150420)；亞硝酸鈉(國藥集團(tuán)，批號：20160509)；硝酸鋁(天津科密歐，批號：20131107)；氫氧化鈉(天津福晨化學(xué)試劑廠，批號：20161008)；三氯化鋁(國藥集團(tuán)，批號：20141215)；乙酸鉀(天津科密歐化，批號：20170710)。

2 方法與結(jié)果

2.1 蘆丁對照品溶液的配制

精密稱取蘆丁對照品10.20 mg，甲醇微熱溶解，冷卻至室溫，加入甲醇至刻度，配制成0.19996 mg/mL的對照品溶液。

2.2 雪菊樣品溶液的制備

稱取1.00 g雪菊，加入純化水40 mL，100 ℃浸漬20 min，浸漬3次，濾過，合并濾液，置100 mL容量瓶中，定容至刻度。

2.3 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法

精密吸取蘆丁對照品溶液與樣品溶液各1 mL，按照NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法顯色[3]，紫外分光光度計(jì)于350～800 nm進(jìn)行掃描，確定509 nm為檢測波長[3]。回歸方程為A=0.0134C-0.0144，r=0.9997，蘆丁對照品溶液在8.00～47.99 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。精密度(RSD為3.81%)、3 h內(nèi)穩(wěn)定性(RSD為1.86%)、重復(fù)性均良好(RSD為3.59%)，平均加樣回收率為102.04%，RSD為2.38%。

2.4 AlCl3-KAc顯色法

精密吸取蘆丁對照品溶液與樣品溶液各1 mL，按照AlCl3-KAc顯色法顯色[4]，紫外分光光度計(jì)于350～800 nm進(jìn)行掃描，確定431 nm作為檢測波長[4]。回歸方程為A=0.0401C-0.0216，r=0.9999，蘆丁對照品溶液在4.00～24.00 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。精密度(RSD為1.34%)、重復(fù)性均良好(RSD為2.23%)，3 h內(nèi)穩(wěn)定性較差(RSD為9.70%)，平均加樣回收率為100.46%，RSD為3.40%。

2.5 三乙胺(TEA)顯色法

精密吸取蘆丁對照品溶液與樣品溶液各1 mL，按照三乙胺顯色法顯色[5]。紫外分光光度計(jì)350～800 nm進(jìn)行掃描，確定415 nm作為檢測波長[5]。回歸方程為A=0.0272C-0.0028，r=0.9996，蘆丁對照品溶液在4.00～24.00 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。精密度(RSD為2.32%)、3 h內(nèi)穩(wěn)定性(RSD為2.30%)、重復(fù)性均良好(RSD為2.86%)，平均加樣回收率為102.28%，RSD為2.82%。

2.6 雪菊總黃酮含量的測定

吸取2.2項(xiàng)下樣品溶液1 mL，分別按2.3、2.4、2.5項(xiàng)下測定，結(jié)果見表1。

表1 總黃酮含量(n=3)

3 討論

(1)NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法的原理是亞硝酸鈉先還原黃酮，被還原的黃酮與 Al3+絡(luò)合，加入NaOH造成堿性環(huán)境使C環(huán)開環(huán)生成查爾酮顯紅橙色[6]，含有鄰二酚羥基的酚酸類、木脂素類成分也能被顯色，使結(jié)果偏高。但采用該法測定時顯色明顯，并且趙美等[7]采用該法測定金蓮花總黃酮時的精密度、重現(xiàn)性、加樣回收率較好，可能是目前此法運(yùn)用較多的原因。本實(shí)驗(yàn)采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法測得的總黃酮含量為19.67%，與王家妮[8]利用此法測定的新疆昆侖雪菊總黃酮含量(20.39%)基本一致。

(2)AlCl3-KAC顯色法原理為Al3+與黃酮的3-羥基4-羰基、5-羥基4-羰基及B環(huán)鄰二酚羥基發(fā)生絡(luò)合，使黃酮的紫外吸收譜帶Ⅱ紅移至420 nm，對于含有鄰二酚羥基的酚酸類化合物顯色前后在420 nm處無吸收[9]。本實(shí)驗(yàn)采用AlCl3-KAc顯色法測得的總黃酮含量為3.17%，避免了酚酸類化合物的影響。但是，180 min內(nèi)穩(wěn)定性的RSD為9.70%，穩(wěn)定性較差，隨時間的延長有結(jié)晶析出，推測可能是此原因影響了穩(wěn)定性。60 min內(nèi)穩(wěn)定性的RSD為0.92%，90 min內(nèi)穩(wěn)定性的RSD為3.71%，在采用本法時應(yīng)在60 min內(nèi)完成。

(3)三乙胺顯色法主要是以芹菜素為母核的黃酮及其苷類成分顯色，因此雪菊中部分黃酮不能被顯色。本實(shí)驗(yàn)采用三乙胺顯色法測得總黃酮的含量與AlCl3-KAc顯色法測得總黃酮含量相近。三乙胺顯色法測定總黃酮含量時，只需加入一種顯色劑，具有操作簡單、誤差小的優(yōu)點(diǎn)，同時方法學(xué)結(jié)果均優(yōu)于其他兩種方法。綜上所述，建議在測定雪菊總黃酮含量時使用三乙胺顯色法。