王秋子，徐 普，李 娜，陳明煒，張文柏

中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院 海南省口腔醫(yī)學(xué)中心種植科，?？?570100

骨缺損為臨床較為常見的現(xiàn)象，當(dāng)缺失過大或自我修復(fù)能力下降時(shí)，則需要人為干預(yù)促進(jìn)骨組織再生。骨缺損的修復(fù)是一個(gè)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，常需要昂貴的費(fèi)用及較長(zhǎng)的恢復(fù)時(shí)間，且在復(fù)雜的臨床情況下效果不理想[1]，無論是自體骨還是異體骨在臨床使用上均存在缺陷[2]。因此，骨缺損的修復(fù)成為學(xué)者們的研究熱點(diǎn)[3,4]。

隨著生物材料的發(fā)展，目前骨組織工程中常見的生物支架都存在生物力學(xué)性能不佳的共性。珍珠粉作為天然生物材料，在2000年前已作為中藥成分使用，具有較好的藥用價(jià)值，現(xiàn)代珍珠粉已被添加于化妝品、保健品等外用或內(nèi)服的產(chǎn)品中，得到廣泛認(rèn)可。珍珠內(nèi)部無機(jī)物晶體與有機(jī)基質(zhì)相互交錯(cuò)排列成“磚墻結(jié)構(gòu)”，致密均勻，排列整齊。無機(jī)晶體多為板層狀文石型碳酸鈣，常見的有多邊形或六邊形，多種有機(jī)基質(zhì)分布于碳酸鈣板層間，形成特殊的物理學(xué)特性。

課題組前期研究結(jié)果表明，珍珠粉其微觀結(jié)構(gòu)類似于天然骨組織，有機(jī)-無機(jī)復(fù)合的板層樣結(jié)構(gòu)決定其具有良好的力學(xué)性能[5]，同時(shí)，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均顯示珍珠粉具有良好的促成骨作用[6-8]。然而粉劑材料存在團(tuán)聚、孔隙率不穩(wěn)定、難以維持骨修復(fù)空間等問題，且臨床使用中操作不方便，導(dǎo)致流失較多或充填不均勻。因此課題組進(jìn)一步研制出NPP/C-HA支架，并對(duì)支架物理性能檢測(cè)，其符合骨組織中理想生物支架要求，而體外實(shí)驗(yàn)表明支架可促進(jìn)小鼠前成骨干細(xì)胞增殖分化[9]。本文以此為基礎(chǔ)旨在探討NPP/C-HA復(fù)合支架的體內(nèi)促成骨效果。

1 材料與方法

1.1 材料合成

以蒸餾水為介質(zhì)通過機(jī)械球磨法獲得納米級(jí)珍珠粉(圖1)，過120目篩備用。殼聚糖(4wt%)和透明質(zhì)酸(1wt%)分別溶于1%的醋酸，于攪拌機(jī)中以2 000 rpm攪拌5分鐘，室溫靜置24小時(shí)，將殼聚糖和透明質(zhì)酸混合，再以2 000 rpm攪拌5分鐘，然后加入納米珍珠粉(10wt%)，以2 000 rpm再攪拌5分鐘，澆鑄于96孔板中，置于-20 ℃冷凍24小時(shí)后，冷凍干燥48小時(shí)，取出制備好的復(fù)合支架(支架規(guī)格：7 mm×10 mm圓柱體)，經(jīng)Co-60γ消毒后置于-20 ℃冰箱密封保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 納米級(jí)珍珠粉掃描電鏡圖Fig.1 Scanning electron microscopy of nanometer pearl powder

1.2 骨缺損模型的建立

實(shí)驗(yàn)符合《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》的要求，并通過中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院倫理委員會(huì)審查(2016科研倫審-002)。

取36只6～10月齡新西蘭大白兔(SCXK<湘>2014-0011)，雄兔，2.5～3 kg，適應(yīng)性喂養(yǎng)7天。全麻下進(jìn)行骨缺損制備，隨時(shí)關(guān)注實(shí)驗(yàn)兔麻醉狀態(tài)，待呼吸平穩(wěn)，以腹式呼吸為主、角膜反射消失、肌肉松弛及對(duì)皮膚夾捏無反應(yīng)時(shí)，認(rèn)為麻醉深度良好。

將36只新西蘭大白兔隨機(jī)分為4組，A組為空白對(duì)照組、B組為殼聚糖-透明質(zhì)酸組(C-HA組)、C組為納米珍珠粉組(NPP組)、D組為納米珍珠粉/殼聚糖-透明質(zhì)酸組(NPP/C-HA組)，每組9只。術(shù)區(qū)備皮，消毒，于雙側(cè)股骨髁外側(cè)縱行切口，暴露股骨遠(yuǎn)端，以干骺線為參照制備直徑7 mm，深度10 mm的骨缺損。術(shù)中使用4 ℃無菌0.9%NaCl沖洗降溫。按不同分組于骨缺損區(qū)植入不同材料，空白組不植入任何外來材料。造模過程為單盲實(shí)驗(yàn)。

術(shù)后使用抗生素及鎮(zhèn)痛藥，繼續(xù)飼養(yǎng)。術(shù)后第4周，第8周，第12周對(duì)實(shí)驗(yàn)兔行安樂死，取雙側(cè)股骨髁標(biāo)本進(jìn)行下一步觀察。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 大體觀察

術(shù)后觀察實(shí)驗(yàn)兔活動(dòng)情況、進(jìn)食進(jìn)水情況、排便情況、傷口愈合情況、周圍組織反應(yīng)以及骨缺損區(qū)骨修復(fù)情況等。

1.3.2 影像學(xué)觀察

造模前后，術(shù)后第4周、第8周、第12周行雙側(cè)股骨CBCT檢查。統(tǒng)一拍攝條件，通過掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行三維重建，并進(jìn)行Lane-Sandhu X射線評(píng)分，評(píng)估骨缺損區(qū)骨組織愈合情況及骨化情況。

1.3.3 血清骨堿性磷酸酶含量測(cè)定

于0、2、4、6、8、10、12周抽取兔耳中央動(dòng)脈血，離心后使用Elisa試劑盒檢測(cè)血清中BALP含量。

1.3.4 組織學(xué)觀察

術(shù)后第4周、第8周和第12周每組處死3只實(shí)驗(yàn)兔，取雙側(cè)骨缺損區(qū)標(biāo)本，厚度約4 mm，置于10%福爾馬林，經(jīng)脫鈣、包埋、切片、封片后行HE染色及Masson染色，評(píng)估正常骨組織與缺損區(qū)連接處新生骨組織情況及骨組織成熟度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

所有實(shí)驗(yàn)兔均在2小時(shí)內(nèi)蘇醒，術(shù)后3天活動(dòng)較少，飲食飲水均較差，排便減少。術(shù)后7天拆線，傷口愈合良好，未出現(xiàn)明顯感染現(xiàn)象，飲食飲水等生活習(xí)慣基本恢復(fù)正常。術(shù)后及處死時(shí)，術(shù)區(qū)未見明顯紅腫、溢膿等局部炎癥。骨缺損區(qū)標(biāo)本見軟組織附著，缺損區(qū)被新生組織充填，骨面凹陷。

圖2 術(shù)后第4、8、12周與造模后的CBCT對(duì)比Fig.2 Comparison of CBCT 4,8,and 12 weeks after surgery with after modeling注：A:空白對(duì)照組，B:C-HA組，C:NPP組，D:NPP/C-HA組，1為造模后，2為術(shù)后第4周，3為術(shù)后第8周，4為術(shù)后第12周，箭頭為缺損區(qū)域。Note:A:blank control group,B:C-HA group,C:NPP group,D:NPP/C-HA group,1 is after modeling,2 is the 4th week after surgery,3 is the 8th week after surgery,4 is the 12th week after surgery,the arrow indicates position is defect area.

圖3 不同時(shí)間段的3D重建對(duì)比Fig.3 Comparison of 3D reconstruction in different time注：A:空白對(duì)照組，B:C-HA組，C:NPP組，D:NPP/C-HA組，1為術(shù)后第4周，2為術(shù)后第8周，3為術(shù)后第12周。Note:A:blank control group,B:C-HA group,C:NPP group,D:NPP/C-HA group,1 is the 4th week after surgery,2 is the 8th week after surgery,3 is the 12th week after surgery.

2.2 影像學(xué)

由CBCT可知(圖2)，造模后四組均可見低密度的骨缺損區(qū)，C組呈現(xiàn)高密度影，D組密度較AB組稍高。術(shù)后第4周，各組缺損區(qū)邊緣不規(guī)則，C組高密度充填影變小，D組缺損區(qū)密度更均勻。術(shù)后第8周，各組缺損區(qū)有所變小。術(shù)后第12周，缺損區(qū)大小進(jìn)一步縮小，A組缺損區(qū)密度略高于造模后，B組缺損區(qū)邊緣密度明顯增高，C組缺損區(qū)邊界難以分辨，中心區(qū)域密度仍較低，D組缺損區(qū)被新生骨組織充填，其密度高于正常骨組織。

三維重建可知(圖3)，每組隨著時(shí)間的增加，同樣缺損區(qū)面積變小，但在觀察期內(nèi)缺損區(qū)未被完全充填。同一時(shí)間各組也存在差別，D組缺損區(qū)面積最小，B組與C組相差無幾，BCD組缺損區(qū)面積較A組均小，且D組缺損區(qū)表面骨質(zhì)更為光滑，其他組骨面凹凸不平。

將CBCT圖像根據(jù)Lane-sandhu X射線評(píng)分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1、圖4。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)Lane-sandhu X射線評(píng)分分析結(jié)果

注:A:空白對(duì)照組，B:C-HA組，C:NPP組，D:NPP/C-HA組，*P< 0.05,**P< 0.01。

Note:A:blank control group,B:C-HA group,C:NPP group,D:NPP/C-HA group,*P< 0.05,**P< 0.01.

第8周和第12周中各組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，組間兩兩比較如圖4，第8周時(shí)，D組AB組比較P<0.05，第12周時(shí)，D組與ABC組比較P<0.05。

圖4 各組不同時(shí)間點(diǎn)Lane-sandhu X射線評(píng)分分析結(jié)果兩兩比較Fig.4 Pairwise comparisons of Lane-sandhu X-ray analysis results at different time points in each group注：A:空白對(duì)照組，B:C-HA組，C:NPP組，D:NPP/C-HA組，*為P<0.05，**為P<0.01。Note:A:blank control group,B:C-HA group,C:NPP group,D:NPP/C-HA group,*P<0.05,**P<0.01).

2.3 BALP含量測(cè)定

四組血清中BALP含量在0周至6周逐漸上升，在第6周時(shí)達(dá)到峰值，隨后開始下降，第12周時(shí)各組血清中BALP含量逐漸降低，接近初始水平(圖5)。

圖5 不同時(shí)間點(diǎn)各組血清中BALP含量變化Fig.5 Changes of BALP levels in serum at different time points in each groups注：A:空白對(duì)照組，B:C-HA組，C:NPP組，D:NPP/C-HA組。Note:A:blank control group,B:C-HA group,C:NPP group,D:NPP/C-HA group.

對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(表2)，第4周、第6周、第8周四組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)。

表2 不同時(shí)間點(diǎn)各組血清中骨堿性磷酸酶含量

注:A:空白對(duì)照組，B:C-HA組，C:NPP組，D:NPP/C-HA組,*P< 0.05；**P< 0.01。

Note:A:blank control group,B:C-HA group,C:NPP group,D:NPP/C-HA group,*P< 0.05,**P< 0.01.

將第4周、第6周、第8周進(jìn)行各組間兩兩比較(圖6)。第4周時(shí)NPP/C-HA組與其他三組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中空白對(duì)照組與NPP組比較也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在第6周時(shí)，NPP/C-HA組與空白對(duì)照組和C-HA組比較具有顯著差異，空白對(duì)照組與NPP組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在第8周時(shí)，僅NPP/C-HA組與空白對(duì)照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖6 不同時(shí)間點(diǎn)各組血清中骨堿性磷酸酶含量?jī)蓛杀容^Fig.6 Pairwise comparisons of bone alkaline phosphatase levels in serum at different time points in each groups注：A:空白對(duì)照組，B:C-HA組，C:NPP組，D:NPP/C-HA組，*為P<0.05，**為P<0.01。Note:A:blank control group,B:C-HA group,C:NPP group,D:NPP/C-HA group,*P <0.05,**P <0.01.

2.4 組織學(xué)觀察結(jié)果

2.4.1 HE染色

圖7，術(shù)后第4周，各組可見炎細(xì)胞浸潤(rùn)，A組缺損區(qū)邊緣見新生纖維組織，靠缺損中心區(qū)域纖維組織疏松，B組見新生纖維組織長(zhǎng)入材料間隙，有少量無規(guī)則結(jié)構(gòu)的不成熟類骨質(zhì)，C組未降解的珍珠粉成團(tuán)分布于新生纖維間，D組缺損區(qū)邊緣致密的纖維組織與植入材料相互融合，纖維間見新生類骨質(zhì)，B、C兩組新生骨周圍見成骨細(xì)胞。

術(shù)后第8周，各組未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，A組纖維間有少量新生類骨質(zhì)，B組致密的纖維組織間見新生類骨質(zhì)，內(nèi)部含豐富的骨細(xì)胞，周圍見成骨細(xì)胞，C組不成熟的類骨質(zhì)間見新生血管，D組缺損區(qū)纖維間同樣見新生類骨質(zhì)，周圍見成骨細(xì)胞，且植入材料間有塊狀類骨質(zhì)形成。

術(shù)后第12周，A組致密的纖維間有類骨質(zhì)，但缺損區(qū)中心區(qū)域仍未被填滿，B組材料未完全降解，靠近缺損區(qū)中心的材料間隙新生組織較少，C組植入材料難以分辨，大量不成熟的類骨質(zhì)周圍見成骨細(xì)胞，有新生血管存在，D組纖維由缺損區(qū)邊緣向植入材料移行，材料逐漸被不成熟的類骨質(zhì)取代，大量新生的類骨質(zhì)周圍見成骨細(xì)胞及新生血管。

2.4.2 Masson染色

圖8，術(shù)后第4周，A組缺損區(qū)邊緣正常骨組織呈紅藍(lán)相間，靠近缺損區(qū)的為藍(lán)染，B組見少量藍(lán)染的新生類骨質(zhì)，其他多為紅藍(lán)相間的正常骨組織，C組未見明顯的新生類骨質(zhì)，D組見明顯不規(guī)則的藍(lán)染類骨質(zhì)。

術(shù)后第8，A組缺損區(qū)邊緣見不定型的藍(lán)染類骨質(zhì)，B組新生藍(lán)染類骨質(zhì)出現(xiàn)少許紅染，材料間隙未被新生組織填滿，C組見藍(lán)染的類骨質(zhì)具有一定的形態(tài)，靠近缺損區(qū)一側(cè)的類骨質(zhì)含較多骨細(xì)胞，先形成的類骨質(zhì)出現(xiàn)紅染，D組藍(lán)染的類骨質(zhì)具有規(guī)則的形態(tài)，內(nèi)含大量骨細(xì)胞，早期形成的類骨質(zhì)有紅染。

術(shù)后第12周，各組視野內(nèi)均為藍(lán)染的新生類骨質(zhì)，A組缺損區(qū)中心缺乏新生類骨質(zhì)，B組致密的纖維間見不規(guī)則的藍(lán)染類骨質(zhì)，C組見大量藍(lán)染類骨質(zhì)，排列疏松，D組連接區(qū)有大量藍(lán)染的不規(guī)則的類骨質(zhì)，早期形成的類骨質(zhì)形態(tài)規(guī)則。

圖7 術(shù)后不同階段各組HE染色對(duì)比圖(x100，x200)Fig.7 Comparison of HE staining at different time after surgery in each group (x100,x200)注：A:空白對(duì)照組，B:C-HA組，C:NPP組，D:NPP/C-HA組，abcd為局部放大圖，箭頭為成骨細(xì)胞，B為骨組織，F(xiàn)為纖維組織，NB為新生骨組織，1為術(shù)后第4周，2為術(shù)后第8周，3為術(shù)后第12周。Note:A:blank control group,B:C-HA group,C:NPP group,D:NPP/C-HA group,a、b、c and d is partial enlarged drawing,B is bone tissue,F is fibrous tissue,NB is new bone tissue.

圖8 術(shù)后不同階段各組Masson染色對(duì)比圖(x100，x200)Fig.8 Comparison of Masson staining at different time after surgery in each group (x100,x200)注：A:空白對(duì)照組，B:C-HA組，C:NPP組，D:NPP/C-HA組，abcd為局部放大圖，箭頭為成骨細(xì)胞，B為骨組織，F(xiàn)為纖維組織，NB為新生骨組織，1為術(shù)后第4周，2為術(shù)后第8周，3為術(shù)后第12周。Note:A:blank control group,B:C-HA group,C:NPP group,D:NPP/C-HA group,a、b、c and d is partial enlarged drawing,B is bone tissue,F is fibrous tissue,NB is new bone tissue.

3 討論

目前骨組織工程中常見的羥基磷灰石吸收非常緩慢[10]，人工合成高分子聚合物的降解產(chǎn)物呈弱堿性，可能會(huì)引起不良反應(yīng)[11]，并且生物力學(xué)均不佳。生物材料如殼聚糖[12]、透明質(zhì)酸[13,14]等受到人們的歡迎，也都存在一定缺陷。為了完善材料性能，學(xué)者們常對(duì)其進(jìn)行改性處理[15]。

本實(shí)驗(yàn)中所用復(fù)合材料包括透明質(zhì)酸、殼聚糖和納米珍珠粉。透明質(zhì)酸自身性能不穩(wěn)定，其中的陰離子基團(tuán)(-COOH)可與殼聚糖中的陽離子基團(tuán)(-NH2)發(fā)生反應(yīng)生成穩(wěn)定的聚合物[16]。在復(fù)合材料中再添加納米珍珠粉，珍珠粉顆?？删鶆蚍稚⒂趶?fù)合支架中，使支架獲得理想的孔隙結(jié)構(gòu)和強(qiáng)度，所形成的三維支架更有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)及礦化，促成骨效果也得到進(jìn)一步提升[17-19]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示機(jī)體與材料相互融合，組織細(xì)胞逐漸長(zhǎng)入材料孔隙，隨著材料緩慢降解，新生組織也慢慢代替缺損區(qū)材料，表明植入材料具有良好的生物相容性。

影像學(xué)研究結(jié)果提示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，缺損區(qū)骨密度逐漸增高，骨組織逐步修復(fù)。骨修復(fù)的過程不僅有新生骨組織充填缺損區(qū)，也包括周圍組織的改建，隨著密度增高形成更為成熟更適應(yīng)自身需求的骨結(jié)構(gòu)。

研究報(bào)道常用堿性磷酸酶來評(píng)價(jià)成骨細(xì)胞的活性[20,21]，但目前發(fā)現(xiàn)的6種同工酶中，僅有1種來源于成骨細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)中選用特異性的BALP，更精確的體現(xiàn)了成骨細(xì)胞活性[22]，隨著骨形成的相對(duì)增強(qiáng)而骨吸收相對(duì)減弱，成骨細(xì)胞活性增強(qiáng)，分泌大量BALP進(jìn)入血液循環(huán)，表現(xiàn)為血清中BALP含量升高，更好的反應(yīng)材料的促成骨作用。

NPP/C-HA組植入材料間隙中見未成熟的類骨質(zhì)更多，隨著成骨細(xì)胞的分化成熟，形成成骨中心，進(jìn)而逐漸有類骨質(zhì)出現(xiàn)，體現(xiàn)其良好的成骨作用，且比其他組更能促進(jìn)骨組織再生，說明其良好的骨傳導(dǎo)作用[23]，但在骨質(zhì)成熟度方面并沒有明顯的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)各組缺損區(qū)邊緣存在致密規(guī)則的纖維組織，而有研究表明纖維細(xì)胞可分泌與成骨細(xì)胞一樣的Ⅰ型膠原，促進(jìn)骨愈合過程中的鈣鹽沉積，具有成骨潛能[24]。同時(shí)中心區(qū)域血供較差，細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖所需的營(yíng)養(yǎng)難以很好的供給，所產(chǎn)生的代謝廢物也不能及時(shí)排出，成骨稍困難，因此缺損區(qū)邊緣成骨優(yōu)于缺損區(qū)中心區(qū)域。

本實(shí)驗(yàn)通過影像學(xué)、組織學(xué)和分子生物學(xué)分析了NPP/C-HA組復(fù)合支架對(duì)骨組織缺損的修復(fù)效果。該天然生物支架材料利用較低的成本可達(dá)到良好的成骨效果，符合理想支架材料的特性，在骨組織工程領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

本研究也存在一定的局限，實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)間為3個(gè)月，觀察期間各組缺損區(qū)均未完全修復(fù)，骨的完全修復(fù)或許需要更長(zhǎng)時(shí)間，實(shí)驗(yàn)中未對(duì)新生骨組織的機(jī)械性能做詳細(xì)檢測(cè)等。