蔣 莉，付啟明，王 磊，蔡易睿，鐘方旭，鄢又玉

武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，武漢 430023

火棘Pyracanthafortuneana(Maxin.)Li又名救軍糧、火把果、紅子、吉祥果、狀元紅等，是薔薇科蘋果亞科火棘屬的一種常綠植物灌木，主產(chǎn)于云南、貴州、四川、湖南、湖北等地。其中全緣火棘、窄葉火棘、細(xì)圓齒火棘等三個品種在湖北分布較廣，資源豐富。目前已被國家衛(wèi)生部批準(zhǔn)作為新食品資源[1]?；鸺Y源豐富，每年僅在湖北省的年產(chǎn)量就高達(dá)5萬噸[2]。火棘果中含有多種營養(yǎng)成分，如多糖、多酚、果膠、黃酮、原花青素等[3]，其中可溶性多糖的含量占10%～13%左右。在現(xiàn)代科技中，人們將多糖與一些金屬或者非金屬相結(jié)合，產(chǎn)生了意想不到的功能效果[4]。

缺鐵性貧血(IDA)是當(dāng)前發(fā)病率最高的營養(yǎng)素缺乏病之一，同時伴有慢性疲勞、煩躁不安、免疫功能紊亂、情緒或認(rèn)知障礙、記憶力減退等癥狀，嬰幼兒及學(xué)齡前兒童缺鐵更有可能影響兒童腦部發(fā)育[5，6]。鐵補充劑的發(fā)展可分為三代：無機(jī)鐵劑，小分子有機(jī)鐵劑，多糖鐵復(fù)合物。其中一代無機(jī)鐵劑的鐵腥味重，生物利用度低；二代小分子有機(jī)鐵劑吸收易飽和，有游離鐵毒性，治療周期長[7]；第三代于1947年證明靜脈注射多糖鐵復(fù)合物的安全性，多糖鐵復(fù)合物可治療缺鐵性貧血[8]。多糖鐵復(fù)合物作為鐵元素補充劑在體內(nèi)具有多糖的多種生物活性、普遍耐受性與較高的生物利用度，相對可減緩對胃腸道刺激，且吸收率不受胃酸減少及食物成分的影響。作為目前行之有效的缺鐵性貧血補鐵劑[9]，多糖鐵復(fù)合物在應(yīng)用于靜脈補鐵方面取得了較大的發(fā)展[9]。

常見的多糖鐵復(fù)合物的制備方法有氯化鐵共熱合成及硫酸鐵銨化學(xué)合成等[10,11]，制得植物多糖類鐵復(fù)合物一般為棕黑色粉末，易溶于水、無臭無味且不溶于無水甲醇、乙醇及乙醚等有機(jī)溶劑[12]。本文是基于前人對多種植物多糖鐵復(fù)合物的合成工藝優(yōu)化[13-17]，進(jìn)而改良合成火棘多糖鐵復(fù)合物。利用紫外分光光度計檢測多糖鐵復(fù)合物中鐵含量的原理[18]，結(jié)合其他植物多糖鐵中鐵含量的特定檢測條件[19,20]，優(yōu)化得到火棘多糖鐵復(fù)合物中鐵含量檢測的最優(yōu)條件。此方法可應(yīng)用于補鐵劑的制備與檢測，同時也可推廣應(yīng)用于其它植物多糖鐵復(fù)合物的含量測定。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

火棘果：2016年10月下旬采集于湖北省恩施來鳳地區(qū)，經(jīng)華中科技大學(xué)植物學(xué)博士楊悅鑒定為全緣火棘Pyracanthaatalantioides(Hance) Stapf的果實。FeCl3、鄰菲啰啉、抗壞血酸、無水乙醇及氫氧化鈉均為分析純，實驗用水為自制去離子水；UV-5900PC紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；BS系列分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；SB5200DTS雙頻超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；HSJ-6系列恒溫水浴攪拌器，江蘇金壇市科析儀器有限公司；HH-S1數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠；XH-C漩渦混合器，江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠；GR21G高速冷凍離心機(jī)，日本HATACHI公司；DHG-9070A高速冷凍離心機(jī)，日本HATACHI公司；DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 PPC的合成

稱取一定量已脫色脫蛋白后的PPC凍干粉末，置于錐形瓶中，以去離子水溶解并加入檸檬酸三鈉溶液，控制溶液pH在8.0～9.0之間，在攪拌狀態(tài)下交替滴加FeCl3溶液和NaOH溶液，直到溶液中出現(xiàn)的紅棕色沉淀不再溶解為止。70 ℃水浴1.5 h。待溶液冷卻至常溫后，在15 000 rpm的轉(zhuǎn)速下離心15 min，將離心后的紅棕色上清液轉(zhuǎn)移至2倍體積的無水乙醇中，醇沉過夜。醇沉后的溶液再次離心，取沉淀用無水乙醇洗滌兩次，15 000 rpm離心10 min，將離心后的沉淀冷凍干燥，保存?zhèn)溆?，即為PPC凍干粉。

1.2.2 鐵含量的測定

取凍干PPC粉末0.05 g，以去離子水溶解并定容至100 mL，即為待測樣品溶液。取1.0 mL加入抗壞血酸溶液和鄰菲啰啉溶液，去離子水定容至50 mL，搖勻水浴一定時間后作紫外全波段掃描并確定于510 nm處測吸光度。

1.2.3 單因素實驗

考察了反應(yīng)時間(1.0、1.5、2.0、2.5及3.0 h)、抗壞血酸濃度(2%、4%、6%、8%、10%、12%)和用量(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL)、鄰菲啰啉溶液的濃度(0.05% 、0.10% 、0.15% 、0.20%、0.25%)和用量(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL)以及水浴溫度(20、30、40、50、60、70 ℃)對PPC中鐵含量檢測的影響。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，運用響應(yīng)面軟件中Box-Behnken設(shè)計原則，選擇反應(yīng)時間(A)，水浴溫度(B)和10%抗壞血酸溶液的用量(C)這三個顯著因素進(jìn)一步優(yōu)化，以吸光度值作為響應(yīng)值。設(shè)計如下表1所示。

表1 Box-Behnken 設(shè)計因素水平及編碼值

1.2.5 方法學(xué)驗證

經(jīng)過響應(yīng)面優(yōu)化得到PPC中鐵含量檢測的最優(yōu)條件后，進(jìn)一步對該方法進(jìn)行方法學(xué)驗證，即考察其重復(fù)性、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性及回收率等。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗

圖1 反應(yīng)時間(A)、鄰菲啰啉用量(B)、抗壞血酸用量(C)、鄰菲啰啉濃度(D)、抗壞血酸濃度(E)及水浴溫度(F)對火棘多糖鐵Ⅲ復(fù)合物中鐵含量的測定的影響Fig.1 The influence of reaction time(A),the dosage of O-phenanthroline (B) and ascorbic acid(C),O-phenanthroline concentration(D),ascorbic acid concentration(E)and incubation temperature (F) on the determination of iron content from PPC

如圖1(A)所示，當(dāng)反應(yīng)時間小于2.0 h時，隨著時間延長，吸光度先急劇上升再漸趨平緩，至2.0 h時吸光度最大。因為鄰菲啰啉不能和Fe3+直接絡(luò)合或與Fe3+形成的配合物穩(wěn)定性差，說明此過程中抗壞血酸正不斷將Fe3+還原為Fe2+，F(xiàn)e2+與鄰菲啰啉發(fā)生直接絡(luò)合，反應(yīng)時間接近2.0 h時，F(xiàn)e3+全部被還原為Fe2+，吸光度達(dá)到極值。隨反應(yīng)時間繼續(xù)延長，抗壞血酸在還原Fe3+時會使溶液酸性增強，一定程度上部分破壞鄰菲啰啉與Fe2+的絡(luò)合物，使吸光度值逐漸減小。由此可知，鄰菲啰啉檢測PPC中鐵含量的最佳反應(yīng)時間為2.0 h。由圖1(B)可知，隨著鄰菲啰啉溶液用量增加，吸光度先增加并于添加量3.0 mL時達(dá)到極值，后趨于平緩，說明鄰菲啰啉用量達(dá)3.0 mL時，已足夠與體系中Fe2+完全反應(yīng)。繼續(xù)增加其用量吸光度無明顯變化，故確定鄰菲啰啉溶液的最佳用量為3.0 mL。由圖1(C)可知，當(dāng)抗壞血酸溶液的用量增加至1.0 mL期間，吸光度先增至極值，說明1.0 mL抗壞血酸已基本將體系中Fe3+完全還原為Fe2+，繼續(xù)增加用量，體系酸性增強且體系含水量增加，反而破壞了絡(luò)合物的穩(wěn)定，因此抗壞血酸溶液用量取1.0 mL最適。同理，由圖1(D)可知，隨著鄰菲啰啉溶液濃度增加，吸光度先升后漸趨平緩，鄰菲啰啉為0.1%時吸光度達(dá)到極值，說明此時體系中已經(jīng)有足量的鄰菲啰啉可與Fe2+充分反應(yīng)，選此濃度較為合適。由圖1(E)可知，隨抗壞血酸溶液濃度增加，吸光度先急劇上升，于10%時達(dá)到極值，而后趨于平緩。說明一定量10%抗壞血酸已足夠?qū)PC中的Fe3+還原成Fe2+，繼續(xù)增加用量已無現(xiàn)實意義，故抗壞血酸溶液濃度10%最佳。由圖1(F)可知，隨著水浴溫度升高，吸光度總體呈先升后降趨勢。說明一定范圍內(nèi)升高溫度有助于加快進(jìn)行，但溫度過高易使絡(luò)合物分解，故選40 ℃較適。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實驗

在單因素實驗基礎(chǔ)上，確定10%抗壞血酸、3.0 mL 0.1%鄰菲啰啉溶液前提下，進(jìn)一步以響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計優(yōu)化了反應(yīng)時間、水浴溫度和10%抗壞血酸溶液用量3個顯著因素對含量檢測的影響，具體如表2所示。

優(yōu)化實驗完成后，以Design Expert8.06軟件對結(jié)果進(jìn)行二次多項式擬合，得到回歸方程：Y=0.43+0.006 25A+0.023B+0.013C-0.003AB-0.002AC+0.005 75BC-0.003 375A2-0.068B2-0.023C2。對其進(jìn)行方差與顯著性分析，結(jié)果如下表3所示。

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果

表3 方差分析

注：*表示差異性顯著 (0.01

Note：*indicated significant difference,0.01

圖2 火棘多糖鐵Ⅲ復(fù)合物中鐵含量測定響應(yīng)面及等高線圖Fig.2 Response surface and contour plot of iron content from PPC注：A.水浴溫度與反應(yīng)時間；B.抗壞血酸用量與反應(yīng)時間；C.抗壞血酸用量與水浴溫度。Note:A Reaction time and incubation temperature,B Reaction time and ascorbic acid dosage,C Incubation temperature and ascorbic acid dosage

由圖2結(jié)合表3分析可知，水浴溫度與反應(yīng)時間交互作用較顯著，吸光度隨溫度升高先增后減，在45 ℃左右達(dá)到極值，水浴溫度對結(jié)果的影響比反應(yīng)時間更為顯著。反應(yīng)時間與抗壞血酸溶液用量交互作用不顯著，相對而言，水浴溫度與抗壞血酸溶液用量交互作用最顯著。

通過軟件(Design Expert8.0.6)分析得到檢測PPC中鐵含量的最佳條件是反應(yīng)時間為2.01 h，水浴溫度為44.4 ℃，10%抗壞血酸溶液用量為1.5 mL，在此條件下測得吸光度值應(yīng)為0.464。為了驗證該響應(yīng)面結(jié)果的可行性，對所得最佳條件進(jìn)行了優(yōu)化和驗證實驗。在反應(yīng)時間2.0 h，水浴溫度45 ℃，抗壞血酸溶液用量1.5 mL條件下進(jìn)行了5組平行試驗，平均值為0.449，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差3.23%，在誤差允許范圍內(nèi)，說明該響應(yīng)面優(yōu)化出的結(jié)果比較可靠。

2.3 測定方法評價

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線關(guān)系考察

配制不同濃度的PPC溶液(0.30、0.40、0.50、0.60、0.70 mg/mL)置于容量瓶中，按優(yōu)化得到的最佳檢測條件測定其中鐵的含量。以吸光度為縱坐標(biāo)，PPC溶液濃度為橫坐標(biāo)。得出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=0.728X+ 0.015 4 (R2=0.999 5)，在濃度0.30～0.70 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 重復(fù)性實驗

按最佳檢測條件，配制PPC濃度為0.30及0.70 mg/mL的樣品兩份。由同一實驗操作人員在510 nm波長下平行測定5組數(shù)據(jù)，計算標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果如表4。

分析可知，兩份樣品測出的吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.001和0.002，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別是0.64%和0.37%，重復(fù)性良好。

表4 重復(fù)性實驗

2.3.3 重現(xiàn)性實驗

同上，配制PPC濃度為0.30及0.70 mg/mL的樣品兩份。在不同實驗室環(huán)境下，由不同的實驗操作人員在510 nm波長下平行測定5組數(shù)據(jù)，計算標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果如下表5。

分析可知，兩份樣品測出的吸光度值得標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.002 8和0.003 2，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.27%和0.59%，重現(xiàn)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性實驗

同上，配制PPC濃度為0.30及0.70 mg/mL的樣品兩份。待反應(yīng)完全后，每隔10分鐘取樣品測吸光度，連續(xù)測6次，計算標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果如表6。

表5 重現(xiàn)性實驗

表6 穩(wěn)定性實驗

由表中數(shù)據(jù)可知，兩份樣品測出的吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.001和0.003，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.51%和0.59%，說明此樣品在1.0 h內(nèi)測定吸光度較穩(wěn)定。

2.3.5 回收率實驗

同上，配制PPC濃度為0.30及0.70 mg/mL的樣品5份，每份1 mL，分別加入0.20 g鐵標(biāo)準(zhǔn)品，同上操作，反應(yīng)完全后在510 nm波長測定吸光度并計算總鐵含量。計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)方差，結(jié)果如表7。經(jīng)分析可知，此方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.320%，回收率可達(dá)99.93%。

3 結(jié)論

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面軟件優(yōu)化建立火棘多糖鐵復(fù)合物中鐵含量檢測條件。結(jié)果表明，最佳檢測條件為：1.0 mL適宜濃度的PPC溶液，加1.5 mL 10%抗壞血酸溶液以及3.0 mL 0.1%的鄰菲啰啉溶液后，定容至50 mL并于45 ℃水浴2.0 h，反應(yīng)完全后以冰水快速冷卻，于510 nm測定吸光度值。此方法的重復(fù)性和重現(xiàn)性良好，且在1.0 h內(nèi)檢測穩(wěn)定，回收率高達(dá)99.93%。測定的體系中，雖然抗壞血酸溶酸性較大，對測定吸光度存在一定影響，但因加完試劑后定容稀釋處理，基本可忽略pH對檢測的影響。此方法操作簡單，結(jié)果可靠，可推廣至其他多糖鐵復(fù)合物中鐵含量的測定。

表7 回收率實驗(n=5)