李 靖，涂美艷,，鐘程操,，孫淑霞，陳 棟，宋海巖,，劉 飄，廖明安，江國良*

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所·農(nóng)業(yè)部西南地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610066；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，四川 成都 611130)

【研究意義】獼猴桃潰瘍病是一種毀滅性病害，由于其隱蔽性強(qiáng)、單靠藥劑防治難，近年在國內(nèi)外產(chǎn)區(qū)危害甚重，已成為制約獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要瓶頸[1]。四川是世界紅心獼猴桃發(fā)源地和全球最大紅心獼猴桃種植區(qū)，其中，‘紅陽’品種占全省栽培面積的 65 %，大量研究表明[2-5]，現(xiàn)有獼猴桃栽培品種中，‘紅陽’抗性最弱，但國內(nèi)高抗?jié)儾〖t肉優(yōu)質(zhì)品種選育未見突破性進(jìn)展。因此，短時(shí)間內(nèi)通過品種改良解決潰瘍病問題還無法實(shí)現(xiàn)。而獼猴桃栽培品種間抗病性差異很大，因此，種植抗病品種是降低獼猴桃潰瘍病危害最有效的途徑之一?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Kim等人的研究結(jié)果表明[6]‘紅陽’感病率最高，‘Hort16A’、‘Gold3’、‘Gold9’、‘海沃德’的感病率逐漸降低。李淼、張學(xué)武等人[7-8]研究發(fā)現(xiàn)中華系列獼猴桃在當(dāng)?shù)氐母胁〕潭让黠@高于美味系列獼猴桃品種，‘金魁’為抗病品種，‘早鮮’次之，‘魁蜜’再次之，‘華美2號(hào)’、‘海沃德’中感病，‘秦美’、‘金豐’最感病。【本研究切入點(diǎn)】本研究團(tuán)隊(duì)通過10余年研究，基本明確了四川省獼猴桃潰瘍病發(fā)生、發(fā)展規(guī)律[9-10]，結(jié)合已有研究結(jié)果，開展6個(gè)獼猴桃品種抗?jié)儾〔町惣吧頇C(jī)制研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以期從品種選擇、枝葉形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化指標(biāo)等多方面闡明不同獼猴桃品種抗性差異的生理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)選取了6個(gè)四川省主栽獼猴桃品種作為試驗(yàn)材料(表1)。

健康的獼猴桃枝條、葉片采自成都市新都區(qū)泰興鎮(zhèn)四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新示范園內(nèi)(北緯N30°46′40″ 東經(jīng)E104°13′2″，海拔481 m，年平均氣溫16.1 ℃，年平均無霜期279 d)。

盆栽苗：2014年秋季在控根容器(直徑20 cm、高30 cm)中栽植地徑0.8 cm以上實(shí)生苗(盆土采用草炭和蚯蚓糞1∶2比例混合，高壓滅菌后用于苗木栽植)，2015年6月嫁接不同供試品種。置于四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所網(wǎng)室內(nèi)，備試驗(yàn)使用。

Psa菌劑：由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所劉勇研究員課題組提供，該菌株于2014年從四川省都江堰市獼猴桃園分離獲得，通過PCR擴(kuò)增得到的序列進(jìn)行Blast比對(duì)分析，其DNA片段大小和序列與丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種完全一致。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌菌懸液制取 吸取保存好的Psa菌液于 LB 液體培養(yǎng)基中，250 r/min搖床25 ℃下培養(yǎng)24 h，用無菌水將培養(yǎng)好的菌懸液制成濃度為 3×108cfu/mL 的菌懸液，以備試驗(yàn)使用。

表1 試驗(yàn)所用獼猴桃品種

1.2.2 獼猴桃離體枝條接種方法 2016年10月上旬于田間采集獼猴桃健康的一年生枝條，枝條粗度在0.8 cm左右，剪取其中部15 cm，用石蠟封住枝條兩端防止失水。用70 %酒精對(duì)枝條表面進(jìn)行擦拭消毒，用已消毒的打孔器(直徑6 mm，面積28.3 mm2)在枝條中部造成傷口，傷口深至木質(zhì)部，在傷口處注射20 μl Psa菌懸液，以接種無菌水為空白對(duì)照，接種后置于培養(yǎng)箱20 ℃恒溫保濕。每份材料取10個(gè)枝條，3次重復(fù)。24 h后逐日調(diào)查感病枝條，至20 d，統(tǒng)計(jì)感病枝條數(shù)，參照石志軍[4]的方法，計(jì)算病情指數(shù)，并對(duì)獼猴桃各品種潰瘍病抗性進(jìn)行分級(jí)(表2、3)。

發(fā)病率=發(fā)病枝條數(shù)/試驗(yàn)枝條數(shù)×100 %

病情指數(shù)=Σ(病級(jí)枝條數(shù)×代表級(jí)數(shù)值)/(總枝條數(shù)×發(fā)病最高代表級(jí)數(shù)值) ×100

1.2.3 葉片組織形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察 使用電鏡觀察葉片氣孔的密度、大小。取田間采集長勢(shì)一致的獼猴桃成熟葉片，置于2.5 %的戊二醛固定，保存于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室。用不同濃度酒精進(jìn)行梯度脫水，在臨界點(diǎn)干燥儀中干燥后，將樣品進(jìn)行噴金處理，于電鏡下觀察并拍照。氣孔密度為每平方毫米氣孔個(gè)數(shù)，隨機(jī)測(cè)4個(gè)視野的氣孔個(gè)數(shù)，重復(fù)3次，取平均值。氣孔大小為隨機(jī)測(cè)量的10個(gè)氣孔的長度和寬度的平均值，重復(fù)3次。制作石蠟切片：在采集的葉片上剪取長、寬均為0.5 cm的樣品，置于FAA固定液中固定24 h以上，使用梯度酒精和二甲苯進(jìn)行脫水和透明，制作石蠟切片，用番紅-固綠對(duì)染，封片劑封片，在顯微鏡下觀察、拍照，測(cè)量葉片上表皮厚度、下表皮厚度、海綿組織厚度、柵欄組織厚度，測(cè)定10組數(shù)據(jù)，重復(fù)3次，取平均值。

表2 獼猴桃潰瘍病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

表3 抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.2.4 枝條組織形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察 于獼猴桃成熟期(2016年9月10日左右)剪取6個(gè)獼猴桃品種的當(dāng)年生枝條，選取長勢(shì)相同的結(jié)果母枝上從內(nèi)向外第2～5節(jié)的枝條，重復(fù)5次。

皮孔觀察方法：將枝條直接置于解剖鏡下觀察，用顯微照相機(jī)拍照并測(cè)定各品種皮孔長度、寬度，記錄下皮孔形狀。在枝條上用解剖刀劃出整齊的方格，用游標(biāo)卡尺量出方格的長度、寬度，由此計(jì)算出方格的面積，數(shù)出方格內(nèi)皮孔數(shù)目，從而計(jì)算出各品種枝條的皮孔密度。每個(gè)品種測(cè)定10組數(shù)據(jù)，重復(fù)3次，取平均值。

芽眼觀察方法：選枝條上4～10節(jié)的芽(10個(gè))在顯微鏡下進(jìn)行解剖觀察，用顯微照相機(jī)拍照并測(cè)定各品種皮層厚度，重復(fù)3次。

1.2.5 盆栽苗接種Psa前后枝、葉相關(guān)生理生化指標(biāo)變化 每品種選擇優(yōu)質(zhì)健壯1年生盆栽嫁接苗35株，其中，10株用于接種(重復(fù)3次)，5株作對(duì)照，試驗(yàn)苗與對(duì)照組隔離開，避免病原菌侵染對(duì)照組。10月初選擇晴天下午5：00左右接種制備好的獼猴桃潰瘍病菌懸浮液。選取主干上距土表面15 cm處，接種方法同1.2.2，分別于接種前和接種后20 d，取葉片及枝條韌皮部，測(cè)定POD(過氧化物酶)、SOD(超氧化物歧化酶)、CAT(過氧化氫酶)、PPO(多酚氧化酶)、PAL(苯丙氨酸解氨酶)活性，以及可溶性糖、可溶性淀粉含量，測(cè)定方法均參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同獼猴桃品種潰瘍病抗性差異鑒定

由表4可知，6個(gè)品種獼猴桃枝條接種Psa后的平均病情指數(shù)表明，其抗病性存在一定的差異。其中，‘翠玉’平均病情指數(shù)為35.24，抗性分級(jí)為耐病，‘東紅’、‘伊頓1號(hào)’、金果的平均病情指數(shù)分別為49.52，53.33，61.90，抗性分級(jí)為感病，而‘金艷’、‘紅陽’的平均病情指數(shù)分別為70.47和73.33，抗性分級(jí)為高感。這6個(gè)品種中，‘翠玉’的抗性最強(qiáng)，‘紅陽’的抗性最弱，沒有高抗和抗病型品種。

表4 不同品種獼猴桃枝條離體接種Psa的抗性差異

注：表中同列數(shù)據(jù)后小寫字母不同表示在5 %水平上差異顯著，大寫字母不同表示在1 %水平上差異顯著，下同。

Note： The differences in the lowercase letters of the same column data in the table are significantly different at the 5 % level, with different capital letters indicating significant differences at the 1 % level. The same as below.

表5 不同獼猴桃品種葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)比較

2.2 不同獼猴桃品種葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)差異比較

由表5可知，6個(gè)品種獼猴桃葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)存在差異，葉片氣孔密度、氣孔長度與離體枝條接種病原菌的平均病情指數(shù)分別呈極顯著或顯著的線性正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r分別為0.9636和0.8858)，海綿組織厚度與平均病情指數(shù)呈極顯著的線性負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r為-0.9442)。耐病型‘翠玉’的氣孔密度最低為245.92個(gè)/mm2，海綿組織厚度最大為76.27 μm，氣孔長度最小為14.79 μm。各品種葉片上表皮、下表皮、柵欄組織厚度、氣孔寬度之間有一定的差異，但與平均病情指數(shù)的線性相關(guān)系數(shù)r分別為-0.1587、-0.3221、0.0316和0.5042，沒有表現(xiàn)出顯著的相關(guān)性。

2.3 不同獼猴桃品種枝條形態(tài)結(jié)構(gòu)比較

由表6可知，各品種獼猴桃的皮孔長度、寬度、密度、芽眼皮層厚度與平均病情指數(shù)的線性相關(guān)系數(shù)r分別為0.2037、0.2653、-0.020和0.4565，這幾個(gè)指標(biāo)均與抗性未表現(xiàn)出明顯的相關(guān)性。依據(jù)各品種獼猴桃皮孔形狀，尚無法總結(jié)出明顯的規(guī)律。

表6 不同獼猴桃品種枝條形態(tài)結(jié)構(gòu)比較

表7 不同獼猴桃品種接種Psa前后葉片SOD、POD活性的變化

表8 不同獼猴桃品種接種Psa前后葉片CAT、PPO、PAL活性的變化

2.4 不同獼猴桃品種接種Psa前后葉片保護(hù)酶活性差異比較

由表7～8可知，盆栽苗接種Psa后，各品種葉片的SOD、POD、CAT、PPO、PAL活性均表現(xiàn)出了不同程度的升高，說明接種Psa能引起葉片中保護(hù)酶的活性的提高。其中健康的‘東紅’葉片中SOD、POD酶活性最高，接種Psa后SOD、POD酶活性更是顯著高于其他3個(gè)品種，說明‘東紅’接種病原后葉片保護(hù)酶系統(tǒng)反應(yīng)更強(qiáng)。不同獼猴桃品種接種前后，葉片中SOD、POD活性均與平均病情指數(shù)均呈線性負(fù)相關(guān)。而不同獼猴桃品種CAT、PPO、PAL活性與平均病情指數(shù)并無顯著的相關(guān)性。

2.5 不同獼猴桃品種接種Psa前后枝條保護(hù)酶活性差異比較

由表9～10可知，盆栽苗接種Psa后，各品種枝條韌皮部的SOD、POD、CAT、PPO、PAL活性均表現(xiàn)出了不同程度的升高，說明接種Psa能提高枝條韌皮部保護(hù)酶的活性。其中健康的‘東紅’枝條中SOD、POD酶活性最高，接種Psa后SOD、POD酶活性更是顯著高于其他品種。接種Psa前后，韌皮部中的SOD、POD活性與平均病情指數(shù)均呈線性負(fù)相關(guān)。它們均與葉片中相關(guān)酶活性變化保持一致。但不同獼猴桃品種接種前后PPO活性與平均病情指數(shù)呈線性負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r分別為-0.9850、-0.9380)。而不同獼猴桃品種接種前后CAT、PAL與平均病情指數(shù)無顯著的相關(guān)性。

2.6 不同獼猴桃品種接種Psa前后可溶性糖含量變化

由表11可知，盆栽苗接種Psa后，各品種葉片和枝條韌皮部的可溶性糖含量均表現(xiàn)出了不同程度的升高。其中健康的‘紅陽’葉片、枝條韌皮部中可溶性糖含量均最低，但接種Psa后變化率均顯著高于其他品種。不同獼猴桃品種接種Psa后葉片與枝條韌皮部中的可溶性糖含量與平均病情指數(shù)呈線性正相關(guān)。

表9 不同獼猴桃品種接種Psa前后枝條韌皮部SOD、POD活性的變化

表10 不同獼猴桃品種接種Psa前后枝條韌皮部CAT、PPO、PAL活性的變化

表11 不同獼猴桃品種接種Psa前后可溶性糖含量變化

表12 不同獼猴桃品種接種潰瘍病菌前后枝條韌皮部、葉片可溶性淀粉含量變化

2.7 不同獼猴桃品種接種Psa前后可溶性淀粉含量變化

由表12可知，盆栽苗接種Psa后，各品種葉片和枝條韌皮部的可溶性淀粉含量均表現(xiàn)出了不同程度的升高，但變化率不同。不同獼猴桃品種接種Psa前后葉片、枝條中可溶性淀粉含量與平均病情指數(shù)無顯著相關(guān)性。

3 討 論

3.1 抗?jié)儾～J猴桃品種選擇

獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病是威脅獼猴桃生長的首要病害，篩選和種植抗病品種是預(yù)防和控制病害流行最為有效的方法之一[12]，因此選擇抗病品種進(jìn)行栽培尤為重要。離體枝條接種試驗(yàn)明確了6個(gè)四川省獼猴桃主栽品種對(duì)潰瘍病的抗性，分別是‘翠玉’為耐病型(T)，‘東紅’、‘伊頓1號(hào)’、金果為感病(S)，‘金艷’、‘紅陽’為高感(HS)。其中‘紅陽’作為優(yōu)質(zhì)的紅心獼猴桃品種，深受消費(fèi)者的喜歡，市場價(jià)值巨大，但實(shí)際生產(chǎn)以及前人試驗(yàn)多次表明‘紅陽’對(duì)潰瘍病的抗性極弱，本試驗(yàn)也得到了相同的結(jié)果。相比較而言，‘翠玉’品種的抗性要強(qiáng)于‘紅陽’，這為四川地區(qū)品種搭配提供了一定的參考依據(jù)。

3.2 抗性評(píng)價(jià)指標(biāo)篩選

本試驗(yàn)中獼猴桃葉片氣孔長度、密度、海綿組織厚度與各品種抗性呈極顯著或顯著的線性相關(guān)，這與李淼[7]對(duì)9個(gè)獼猴桃品種葉片組織結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果一致。葉片上表皮厚度、下表皮厚度、柵欄組織厚度、氣孔寬度與抗病性不存在明顯的相關(guān)性。這可能由于病原菌是通過下表皮氣孔而非上表皮氣孔進(jìn)入獼猴桃組織中。潰瘍病菌通過下表皮氣孔進(jìn)入植物體內(nèi)，葉片下表面氣孔越少，病原菌進(jìn)入的通道越少；氣孔長度越小，通道越窄；葉片海綿組織越厚，其進(jìn)入植物組織的通道越長，阻力越大，因而其抗性越強(qiáng)。因此，氣孔長度、密度、海綿組織厚度可作為篩選抗病品種的形態(tài)結(jié)構(gòu)指標(biāo)。

皮孔的大小、形狀、密度及芽眼皮層厚度均與抗病性不存在明顯的相關(guān)性。這與張小桐[13]的研究結(jié)果有所不同，其認(rèn)為皮孔與抗逆性具有較大的相關(guān)性，這可能與試驗(yàn)選材有關(guān)，兩個(gè)試驗(yàn)材料品種完全不同，且取材時(shí)間以及觀察方法也不同，因此皮孔與獼猴桃潰瘍病抗性的相關(guān)性有待增加供試樹種，進(jìn)行深入研究。

接種Psa后葉片、枝條中POD、SOD、CAT、PPO、PAL活性均出現(xiàn)了不同程度的升高，表明Psa能使植株產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，刺激保護(hù)酶的生成，健康的葉片、枝條中POD、SOD活性均與各品種抗性呈線性相關(guān)，這與石志軍等[4]的研究結(jié)果一致。但PPO、CAT、PAL活性與抗性不存在明顯的相關(guān)性。植物遭受病原菌侵染之后，細(xì)胞內(nèi)自由基代謝平衡被破壞致使植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的自由基，SOD能催化自由基生成H202和O2，是減少自由基對(duì)組織產(chǎn)生損害的最關(guān)鍵的保護(hù)酶，而POD是廣泛存在于植物中的保護(hù)酶，在多數(shù)的生理反應(yīng)中，它不僅能與SOD協(xié)同作用參與活性氧的清除，催化酚類物質(zhì)形成醌類物質(zhì)，同時(shí)參與合成木質(zhì)素前體，形成了對(duì)抗病原菌的物理屏障，因此POD能通過多種途徑減少病原菌對(duì)植物體的損害。本試驗(yàn)中枝條、葉片接種潰瘍病菌后，SOD、POD活性出現(xiàn)了不同程度的升高，且變化量存在顯著性差異，這與石志軍等[4]的研究結(jié)果一致，但與李淼[7]的研究結(jié)果有所不同，獼猴桃植株內(nèi)保護(hù)酶對(duì)潰瘍病病菌的應(yīng)激反應(yīng)仍有待進(jìn)一步研究。

健康的獼猴桃葉片、枝條中可溶性糖含量與各品種潰瘍病抗性呈線性相關(guān)，抗性越弱，可溶性糖含量越低，但接種潰瘍病菌后，可溶性糖含量出現(xiàn)了不同程度的增長，且抗性越弱，增量越大。而獼猴桃植株可溶性淀粉含量與抗病性并無明顯的相關(guān)性。

3.3 接種方法

本試驗(yàn)采用了離體枝條接種來鑒定獼猴桃品種的抗性，這是一種廣泛運(yùn)用于各種果樹抗病性鑒定的方法[14-15]。因?yàn)楂J猴桃潰瘍病的病原菌Psa在生產(chǎn)中具有極強(qiáng)的傳播特性，為了避免對(duì)田間造成損失，使用離體接種的方法更科學(xué)、方便、快速。但另一方面，前人的研究中，田間實(shí)際的發(fā)病情況與離體接種發(fā)病情況仍有差異[4,7]。本試驗(yàn)考慮使用離體枝條接種與盆栽苗接種相結(jié)合來對(duì)比相應(yīng)的結(jié)果，但盆栽試驗(yàn)未出現(xiàn)發(fā)病癥狀，只是部分生理指標(biāo)發(fā)生了明顯的變化。因此在以后的試驗(yàn)中，盆栽苗接種致病菌方法仍值得繼續(xù)研究。

4 結(jié) 論

綜上所述，本試驗(yàn)以6個(gè)四川省主栽獼猴桃品種為試材，通過枝條離體接種和盆栽苗接種，鑒定其對(duì)潰瘍病的抗病能力，并從枝葉形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化指標(biāo)上剖析了抗性差異的生理機(jī)制。結(jié)果表明：① 6個(gè)獼猴桃品種潰瘍病抗性由強(qiáng)到弱依次為‘翠玉’、‘東紅’、‘伊頓1號(hào)’、‘金果’、‘金艷’、‘紅陽’。②6個(gè)獼猴桃品種枝、葉形態(tài)結(jié)構(gòu)存在明顯差異，葉片氣孔密度、氣孔長度與潰瘍病離體接種試驗(yàn)病情指數(shù)呈極顯著或顯著正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)分別為0.9636和0.8858)，葉片海綿組織厚度與潰瘍病離體接種試驗(yàn)病情指數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)為-0.9442)，而葉片上表皮厚度、下表皮厚度、柵欄組織厚度、氣孔寬度，枝條皮孔長度、皮孔寬度、皮孔密度、皮孔形狀、芽眼皮層厚度與潰瘍病離體接種病情指數(shù)無顯著相關(guān)性。③盆栽苗接種病原菌后枝條、葉片中SOD、POD、CAT、PPO、PAL活性均出現(xiàn)了不同程度升高。健康葉片、枝條韌皮部SOD、POD活性與潰瘍病病情指數(shù)呈極顯著或顯著負(fù)相關(guān)。而葉片CAT、PPO、PAL、枝條韌皮部CAT、PAL活性與潰瘍病病情指數(shù)無顯著性關(guān)系。枝條韌皮部PPO活性與潰瘍病病情指數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)為-0.9850)。潰瘍病病菌接種前葉片、枝條韌皮部可溶性糖含量均與潰瘍病病情指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)分別為-0.9220和-0.8452)，但葉片、枝條韌皮部可溶性淀粉與潰瘍病病情指數(shù)無顯著相關(guān)性。