任 杰，張 曉，梁瓊月，董蒙蒙，李 立，肖 未， 何 冰

(廣西大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣西 南寧 530005)

【研究意義】木薯(ManihotesculendaCrantz)屬于世界三大薯類作物之一。人們對淀粉及酒精等能源材料的潛在需求使木薯擁有更廣闊的經(jīng)濟價值和市場潛力。木薯種植管理粗放，化肥施用過量等問題制約了我國木薯種植產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1-2]。挖掘木薯本身的生物固氮潛能可減少化肥施用。固氮酶在生物固氮過程中扮演著極重要的角色，固氮菌的固氮能力受植株營養(yǎng)水平影響，也受外界環(huán)境影響。因此，開展不同培養(yǎng)條件對內(nèi)生固氮菌固氮能力的影響的研究，可為進一步揭示固氮菌的生物固氮機制提供參考[2]?！厩叭搜芯窟M展】內(nèi)生固氮菌最佳固氮條件的研究主要集中在單一培養(yǎng)條件因素的影響及選擇[2-7]等方面，葛江麗[4]等通過不同溫度、不同pH和不同NH4Cl濃度確定了水稻根際固氮菌G3的最適培養(yǎng)條件；王琦[6]等從鰻草(Zosteramarina)根際中分離出兩個固氮菌，分別為海旋菌 (Thalassospira)3A和芽孢桿菌 (Bacillus)4G，通過在不同溫度、不同pH培養(yǎng)條件下，確定了2個菌株的最佳培養(yǎng)條件；許沛冬等[8]從草地早熟禾根際所篩選的8株固氮菌株，在不同溫度、不同pH的培養(yǎng)條件下對固氮酶活性進行了測定分析，確定了幾個菌株的最適固氮條件；杜宇等[9]通過不同溫度和不同pH對水稻根際固氮菌NX-2進行培養(yǎng)，確定了其最適培養(yǎng)條件；邢永秀[2]等通過不同溫度、不同pH、不同KNO3濃度和不同NH4Cl濃度的培養(yǎng)條件，確定了幾個甘蔗內(nèi)生固氮菌的最適固氮條件；羅霆等[10]通過不同溫度、不同通氣量確定了從甘蔗根系分離出的克雷伯氏菌(Klebsiellaplantica)L03的最適培養(yǎng)條件。【本研究切入點】在實際培養(yǎng)過程中，固氮酶活性受多種因素共同影響，直到目前為止，尚未見有關(guān)培養(yǎng)條件對木薯內(nèi)生菌固氮酶活性的研究報道。并且，目前關(guān)于木薯產(chǎn)量的研究主要集中在不同施肥條件、不同耕作方式等對產(chǎn)量的影響[11-13]，未見內(nèi)生菌對木薯產(chǎn)量影響的研究。前人從木薯根部中分離出兩個具有高固氮酶活性的內(nèi)生菌A02和A08，通過形態(tài)觀察、生理生化試驗、16S rRNA 基因相似性序列分析，確定A02 屬于短小桿菌屬(Curtobacterium,專利號201610278612.6)，A08 屬于微桿菌屬(Microbacterium，專利號201610274597.8)。同時通過nifH基因鑒定分析，確定兩個菌株為固氮菌，但未研究不同培養(yǎng)條件對A02和A08固氮酶活性的影響。【擬解決的關(guān)鍵問題】以固氮酶活性為考核指標，對不同培養(yǎng)條件對木薯內(nèi)生菌A02，A08固氮酶活性的影響進行研究，首次對A02，A08固氮酶活性影響的最優(yōu)組合進行確定，以期獲得A02和A08較高的固氮酶活性，為木薯固氮菌的培養(yǎng)及應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株菌株A02，A08 從廣西南寧市青秀區(qū)南陽鎮(zhèn)種植的木薯體內(nèi)分離并純化得到，分離純化方法參考邢永秀[2]。

1.1.2 培養(yǎng)基及配置 D?bereiner無氮培養(yǎng)基：蔗糖10 g，K2HPO4·H2O 0.1 g，MgSO4·H2O 0.2 g，CaCl2·H2O 0.02 g，Na2MoO4·H2O 0.002 g，Malic acid 5.0 g，KH2PO40.4 g，NaCl 0.1 g，F(xiàn)eCl 0.01 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0。LB肉湯培養(yǎng)基(購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 5 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0。1×105Pa高溫高壓滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株A02、A08種子液的制備 將-80 ℃保存的菌株A02，A08在LB瓊脂培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，然后挑選單菌落，接種于裝有1.5 mL LB肉湯培養(yǎng)基的離心管中，37 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，到OD600達到0.6時，即為備用種子液。

1.2.2 固氮酶活性測定 取0.1 mL上述種子液放入裝有D?bereiner無氮培養(yǎng)基三角瓶中，培養(yǎng)固氮菌24 h后，采用注射器注入5 mL乙炔氣體，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，從三角瓶中抽取1000 μl氣體注入氣相色譜儀(島津GC2014，島津企業(yè)管理有限公司)中，測定乙烯的含量。按下列公式計算固氮酶活性大小[14]：

N=(Hx×C×V)/(24.9×hs×t)

N：產(chǎn)生的C2H4濃度為nmol/(mL·h)；Hx：樣品峰面積值；hs：標準C2H4峰面積值；C：標準C2H4濃度(nmol·mL-1)；V：培養(yǎng)容器體積(mL)；t：樣品培養(yǎng)時間(h) 。

1.2.3 菌株A02、A08固氮酶活性的單因素影響試驗 pH、溫度、KNO3，NH4Cl及O2的單因素設(shè)計水平如表1。在D?bereiner無氮培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，分別按表1配制各處理培養(yǎng)基，每小瓶分裝20 mL培養(yǎng)液和0.l mL種子液，置于25 ℃，160 r/min的搖床上培養(yǎng)24 h，然后注入5 mL乙炔氣，培養(yǎng)24 h后用氣相色譜儀測定乙烯的生成量。

1.2.4 菌株A02、A08固氮酶活性的5因素正交試驗 正交實驗設(shè)計：選取pH、溫度、KNO3，NH4Cl及O2水平這5個影響因素進行正交實驗。按照L25(55)正交實驗表來設(shè)置每組實驗各影響因素的組合(表2)。培養(yǎng)基的配制及乙烯生成量的測定方法同上。

1.3 統(tǒng)計分析

用Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)的基本處理，IBM SPSS Statistics 23.0進行顯著性分析，設(shè)計正交試驗。

表1 單因素實驗各影響因素和水平

表2 正交實驗各影響因素和水平

2 結(jié)果與分析

2.1 pH和溫度對內(nèi)生固氮菌A02和A08固氮酶活性的影響

試驗結(jié)果表明，菌株A02和菌株A08固氮酶活性隨pH值的升高均呈先升后降的變化趨勢(圖1)。菌株A02固氮酶活性與pH變化的關(guān)系可用拋物線方程：(y=-143.02x2+2021.1x-6681.9，R2=0.906 5，y=固氮酶活性，x=pH值)模擬，在pH=7.07時，固氮酶活性達最大，為458.44 nmol/(mL·h)。菌株A08固氮酶活性與pH變化的關(guān)系可用拋物線方程：(y=-87.809x2+1215.3x-3807.6，R2=0.5244，y=固氮酶活性，x=pH值)模擬，在pH=6.92時，固氮酶活性達最大，為397.42 nmol/(mL·h)。pH值對菌株A02與菌株A08固氮酶的影響規(guī)律大致相同，2個菌株都在pH為中性范圍內(nèi)表現(xiàn)出較強的固氮酶活性，且菌株A02最大固氮酶活性高于菌株A08。

菌株A02和菌株A08固氮酶活性隨溫度的升高呈先升后降的變化趨勢(圖2)。A02菌株固氮酶活性與溫度變化的關(guān)系可用拋物線方程：(y=-2.8959x2+163.52x-1801，R2=0.9705，y=固氮酶活性，x=溫度)模擬，在溫度=28.23 ℃時，固氮酶活性達最大，為507.33 nmol/(mL·h)。菌株A08固氮酶活性與溫度變化的關(guān)系可用拋物線方程：(y=-2.450 9x2+144.67x-1728.6，R2=0.704，y=固氮酶活性，x=溫度)模擬，在溫度=29.51 ℃時，固氮酶活性達最大，為406.27 nmol/(mL·h)。溫度對菌株A02與菌株A08固氮酶活性的影響規(guī)律大致相同，2個菌株都在29 ℃左右時表現(xiàn)出較強的固氮酶活性，但菌株A02最大固氮酶活性高于菌株A08。

圖1 pH對A02和A08固氮酶活性的影響Fig.1 Effect of pH on nitrogenase activity of A02 and A08

圖2 溫度對A02和A08固氮酶活性的影響Fig.2 Effect of temperature on nitrogenase activity of A02 and A08

圖3 KNO3對A02和A08固氮酶活性的影響Fig.3 Effect of KNO3 on nitrogenase activity of A02 and A08

2.2 不同KNO3和NH4Cl濃度對菌株A02和A08活性的影響

試驗結(jié)果表明，菌株A02和菌株A08固氮酶活性均隨KNO3濃度的升高呈先升后降的變化趨勢(圖3)。A02菌株固氮酶活性與KNO3濃度變化的關(guān)系可用拋物線方程：(y=-9.0529x2+93.222x+419.74，R2=0.827 6，y=固氮酶活性，x=KNO3濃度)模擬，在KNO3濃度=5.15 g/L時，固氮酶活性達最大，為659.73 nmol/(mL·h)。菌株A08固氮酶活性與KNO3濃度變化的關(guān)系可用拋物線方程:(y=-5.5477x2+54.763x+296.58，R2=0.6376，y=固氮酶活性，x=KNO3濃度)模擬，在KNO3濃度= 4.94 g/L時，固氮酶活性達最大，為431.73 nmol/(mL·h)。KNO3濃度對菌株A02與菌株A08的影響規(guī)律大致相同，2個菌株都在KNO3濃度為5 g/L左右時表現(xiàn)出較強的固氮酶活性，但菌株A02固氮酶活性總體水平高于菌株A08。

菌株A02和菌株A08固氮酶活性隨NH4Cl濃度的升高的變化趨勢相似(圖4)，隨著NH4Cl濃度的升高兩個菌株固氮酶活力都呈下降趨勢，且菌株A02下降趨勢更快。菌株A02固氮酶活性與NH4Cl濃度變化的關(guān)系可用線性方程：(y=-25.993x+537.86，R2=0.869 9，y=固氮酶活性，x=NH4Cl濃度)模擬。菌株A08固氮酶活性與NH4Cl濃度變化的關(guān)系可用線性方程：(y=-8.272 3x+344.88，R2=0.365 7，y=固氮酶活性，x=NH4Cl濃度)模擬。在供試濃度范圍內(nèi)，A02對NH4Cl濃度變化更加敏感。

圖4 NH4Cl對A02和A08固氮酶活性的影響Fig.4 Effect of NH4Cl on nitrogenase activity of A02 and A08

圖5 O2對A02和A08固氮酶活性的影響Fig.5 Effect of O2 on nitrogenase activity of A02 and A08

2.3 不同O2水平對菌株A02和A08活性的影響

試驗結(jié)果表明，菌株A02和菌株A08固氮酶活性隨O2濃度的升高呈下降趨勢，其中A08的降幅更大(圖5)。菌株A02固氮酶活性與O2濃度變化的關(guān)系可用線性方程：(y=-1.9569x+516.32，R2=0.069 1，y=固氮酶活性，x= O2濃度)模擬。菌株A08固氮酶活性與O2濃度變化的關(guān)系可用線性方程：(y=-9.5538x+494.18，R2=0.879 6，y=固氮酶活性，x=KNO3濃度)模擬。菌株A02固氮酶活性總體水平高于菌株A08，且菌株A08固氮酶活性對O2濃度變化表現(xiàn)更加敏感。

2.4 2種固氮菌培養(yǎng)條件的正交試驗優(yōu)化

2.4.1 菌株A02正交試驗優(yōu)化 通過pH、溫度、KNO3，NH4Cl及O2等5因素的正交試驗，進一步優(yōu)化菌株A02和A08的培養(yǎng)條件，以提高其固氮酶性(表3)。以固氮酶活性高低為判定標準，確定菌株A02的培養(yǎng)條件最佳組合為A4B2C5D1E5(pH 7.5，溫度25 ℃，KNO38 g/L，NH4Cl 0 g/L，O221 %)，在此最佳條件下的固氮酶活性為905 nmol·mL·h-1。由調(diào)整后的極差R值可知，5個因素對菌株A02固氮酶活力影響大小為溫度> O2> pH > NH4Cl> KNO3。驗證試驗表明，在正交實驗獲得的最優(yōu)因素組合培養(yǎng)條件下的A02菌固氮酶活性為935 nmol·mL·h-1，2次試驗結(jié)果非常相近。

2.4.2 菌株A08正交試驗優(yōu)化 菌株A08的最佳影響因素組合為A4B2C3D5E1(pH為7.5，溫度為25 ℃，KNO3為6 g/L，NH4Cl為8 g/L，O2濃度為0 %)，此時固氮酶活性為729 nmol/(mL·h)。由調(diào)整后的極差R值可知，5個因素對菌株A08固氮酶活力影響大小為溫度>O2>pH值>NH4Cl>KNO3。驗證試驗表明，在正交實驗獲得的最優(yōu)因素組合培養(yǎng)條件下的A08菌固氮酶活性為768 nmol/(mL·h)，考慮到實驗誤差，2次實驗結(jié)果視為相同。

3 討 論

在生物固氮過程中固氮酶扮演重要的角色，而固氮酶的活力水平受植株營養(yǎng)水平和外界環(huán)境共同影響[2]。在本研究中，不同培養(yǎng)條件下菌株A02和A08固氮酶活性表現(xiàn)出不盡相同的規(guī)律。因此，研究不同培養(yǎng)條件(pH、溫度、KNO3，NH4Cl及O2)對內(nèi)生固氮菌固氮能力的影響，優(yōu)化固氮菌培養(yǎng)條件，可為固氮菌在木薯生產(chǎn)實踐的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

表3 菌株A02固氮酶活性優(yōu)化正交設(shè)計及試驗結(jié)果

3.1 pH和溫度對內(nèi)生固氮菌A02和A08固氮酶活性的影響

許沛冬等[8]從草地早熟禾根際所篩選的8株固氮菌株，發(fā)現(xiàn)在20～30 ℃、中性或偏堿性的條件范圍內(nèi)的菌株生長狀況均良好；杜宇等[9]發(fā)現(xiàn)水稻根際固氮菌NX-2的最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度28 ℃、初始pH值6.5；羅霆等[10]發(fā)現(xiàn)甘蔗體內(nèi)固氮菌株L03在溫度為33 ℃的條件下固氮活性最高。在單因素影響試驗中，菌株A02與菌株A08在溫度為30 ℃左右，pH值為7.0左右表現(xiàn)出較強的固氮酶活性，高于或低于最適溫度和最適pH，其固氮酶活性顯著下降。A02和A08菌株的固氮酶活性對pH和溫度的反應(yīng)規(guī)律與上述其它植物的內(nèi)生固氮菌相比，差異不大，且對溫度及pH的適應(yīng)性與木薯適宜的生長環(huán)境相似，木薯生長最適宜溫度為25～29 ℃，最適宜pH在6.0～7.5[15]。

表4 菌株A08固氮酶活性優(yōu)化正交設(shè)計及試驗結(jié)果

3.2 不同KNO3和NH4Cl濃度對菌株A02和A08活性的影響

3.3 不同O2水平對菌株A02和A08活性的影響

研究表明通氣量可有效提高菌體培養(yǎng)的生物量，培養(yǎng)過程需要通氧。但固氮反應(yīng)是一個嚴格厭氧條件下的還原過程，固氮酶對氧具有敏感性[29]。羅霆等[10]發(fā)現(xiàn)甘蔗內(nèi)生固氮菌L03在O2濃度為4 %時，固氮酶活性最高。董兆麟[29]等發(fā)現(xiàn)固氮菌B8-G菌株在高通氧條件下具有較高生物量。本研究發(fā)現(xiàn)，菌株A02在O2濃度在21 %時依然有較高的固氮酶活性；菌株A08固氮酶活性對O2濃度變化表現(xiàn)更加敏感，在O2濃度上升后固氮酶活性顯著下降。不同O2水平下菌株A02固氮酶活性水平均高于菌株A08，推測菌株A02的耐氧性高于A08。

3.4 2種固氮菌培養(yǎng)條件的正交試驗優(yōu)化

在正交試驗中，通過極差分析發(fā)現(xiàn)各個培養(yǎng)條件對菌株A02固氮酶活力影響大小順序依次為溫度>O2>pH值>NH4Cl>KNO3。最優(yōu)固氮酶活力條件是溫度為25 ℃，pH為7.5，KNO3為8 g/L，NH4Cl為0 g/L，O2濃度為21 %，在最優(yōu)固氮酶活力條件下菌株A02固氮酶活力為935 nmol/(mL·h)。而極差分析發(fā)現(xiàn)各個影響因素對菌株A08固氮酶活力影響大小順序依次為溫度>KNO3>pH值>O2>NH4Cl，最優(yōu)固氮酶活力條件是溫度為25 ℃，pH為7.5，KNO3為6 g/L，NH4Cl為8 g/L，O2濃度為0 %。在最優(yōu)固氮酶活力條件下菌株A08固氮酶活力為768 nmol/(mL·h)。目前，從植物體中分離固氮內(nèi)生菌并研究其固氮活性的研究報道較多，不同固氮菌株的固氮酶活性通常差異較大，尹坤[30]等采用乙炔還原法分析藥用野生稻內(nèi)生菌(KlebsiellavariicolaCX24)固氮酶活性最高為298.64 nmol/(mL·h)；Xing等[31-32]采用乙炔還原法分析甘蔗內(nèi)生固氮菌StenotrophomonasmaltophiliaB11S和AgrobacteriumdiazotrophicusB8S固氮酶活性分別為1456.23和19.87 nmol/(mL·h)；邢永秀等[2]采用乙炔還原法測定甘蔗莖中克雷伯氏菌(Klebsiellasp.) B5R和B4R的固氮酶活性分別為 137.51和98.12 nmol/(mL·h)。A02和A08的固氮酶活性經(jīng)過培養(yǎng)條件優(yōu)化之后，分別為935和768 nmol/(mL·h)，與其他固氮菌株相比，具有一定優(yōu)勢。

4 結(jié) 論

pH、溫度、KNO3、NH4Cl、O2均對菌株A02和A08的固氮酶活性有重要影響。A02和A08對環(huán)境的喜好差異主要表現(xiàn)在氮源類型和O2濃度上。菌株A02明顯喜歡硝態(tài)氮作為氮源，而A08菌株喜歡不同形態(tài)混合氮源(硝態(tài)氮∶氨態(tài)氮≈3∶4)；A02在大氣氧濃度下仍具有較高固氮酶活性，而A08菌株喜歡厭氧條件。通過優(yōu)化培養(yǎng)基后，A02和A08的固氮酶活性都得到顯著提升，因此A02、A08可很好的發(fā)揮固氮能力，有較好的應(yīng)用前景。