馬慧嬌，郭洪偉，曾朝瑋，郭家俊，章 中

(寧夏大學農(nóng)學院，寧夏 銀川 750021)

【研究意義】細菌芽孢易致食品腐敗和食品安全問題，且難以被各種殺菌處理殺滅。在芽孢萌發(fā)而轉(zhuǎn)變成營養(yǎng)體的過程中，皮層裂解酶會被激活，進而將芽孢皮層肽聚糖水解，導致芽孢核心的水化而失去極端抗性，這是造成芽孢死亡的重要原因，因此將皮層裂解酶分離純化出來就顯得尤為重要[1-4]?！厩叭搜芯窟M展】芽孢的極端抗性是與其特有結(jié)構(gòu)息息相關(guān)的，其從外到里有7層結(jié)構(gòu)，分別是孢外壁、芽孢衣、外膜、皮層、細胞壁、內(nèi)膜、核心[5]。芽孢皮層主要由肽聚糖構(gòu)成，是維持芽孢休眠狀態(tài)和極端抗性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。皮層裂解酶是芽孢所特有的專一水解皮層肽聚糖的酶，枯草芽孢桿菌基因組中有許多皮層裂解酶同系物的存在，最常見的就是CwlJ(Cell wall hydrolase CwlJ)[6-7]。CwlJ位于孢外層，在母細胞中合成，休眠態(tài)芽孢中，CwlJ不能獨立定位，仍需外衣蛋白YwdL的輔助，其屬何型酶及具體功能還有待實驗證實[8-9]?！颈狙芯壳腥朦c】從天然菌種中提取皮層裂解酶，工作量大、難以分離純化且產(chǎn)率還低，所以本文通過基因工程操作技術(shù)，構(gòu)建了皮層裂解酶CwlJ的基因工程菌，以獲得大量的皮層裂解酶?！緮M解決的關(guān)鍵問題】獲得大量的皮層裂解酶CwlJ，為后續(xù)研究提供實驗材料，為推動CwlJ水解肽聚糖進而殺滅芽孢并應用于食品殺菌奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要試劑 Protein Marker：Thermo公司；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、Tris：購自Sigma 公司；SDS：Amresco公司；TEMED：BIO-RAD公司；胰蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(Yeast Extract)：OXOID 公司；瓊脂粉、分析純氯化鈉(NaCl)購自北京化學試劑公司；DNA marker：TaKaRa公司；普通質(zhì)粒小提試劑盒、PCR回收試劑盒(Wizard?SV Gel and PCR Clean-U system)：天根生化科技(北京)有限公司；Amp(氨芐青霉素)：上海求德生物化工；30 %丙烯酰胺溶液：北京雷根生物科技有限公司；pH 8.8的4×Tris/SDS分離膠緩沖液、pH 6.8的4×Tris/SDS濃縮膠緩沖液：上海雙螺旋生物科技有限公司；10 %過硫酸銨溶液、TEMED、甘氨酸：北京博奧拓達科技有限公司。

1.1.2 菌種 pCZN 1 質(zhì)粒、TOP10 菌株、Arctic-Express TM(DE3)表達菌均來自于南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備 AL204型電子天平：梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；DSX-280B型高壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；LRH系列生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；GL-10C型冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠；722型可見分光光度計：上海馳唐電子有限公司；DYCZ-24DN 型電泳槽：北京六一生物科技有限公司；GE AKTA Pure蛋白質(zhì)層析純化系統(tǒng)：美國通用電氣有限公司；DYY-6C型電泳儀電源：北京市六一儀器廠；JY92-2D超聲波細胞粉碎機：中國新芝科器研究所；SIM-F140AY65-PC型雪花狀制冰機：日本SANYO公司；SW-CJ-1D型超凈工作臺：中國蘇凈集團。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L， 氯化鈉5 g/L，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH 7.0；LB固體培養(yǎng)基是在LB液體培養(yǎng)基中加入15 g/L的瓊脂粉，培養(yǎng)基的滅菌條件皆為：121 ℃，20 min。

1.2.2 皮層裂解酶CwlJ基因的克隆 依據(jù)在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫UniProtKB中搜索到的來自Bacillussubtilis-P42249的皮層裂解酶CwlJ氨基酸序列，通過NCBI序列比對獲得CwlJ基因序列。根據(jù)CwlJ基因序列設(shè)計引物，其中上游引物序列：5’-GAATCACAAAGTGCATCATCATCATCATCATATGGCAGTTGT TCGTGCGACCAGCGCGGATGTTGA TCTGAT-3’；下游引物序列：5’-GTGCTTTTAAGCAGAGATTACCT ATCTAGATTAAAAGGTATTATAAACATTTTCACAGGTTTCTGCGGTAGG-3’(下劃線部分分別為NdeI和XbaI酶切位點識別序列)。目的基因CwlJ的合成基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)法，即基因異源表達時通過兩步PCR簡單快速合成長片段DNA[10]。具體反應方法如表1。

1.2.3 重組表達載體pCZN 1-CwlJ的構(gòu)建 合成的基因產(chǎn)物CwlJ進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并采用回收試劑盒對目的條帶進行切膠回收和純化。對質(zhì)粒pCZN 1和目的基因CwlJ同時使用限制性核酸內(nèi)切酶NdeI和XbaI進行雙酶切后用T4DNA連接酶于16 ℃連接過夜(圖1)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP 10克隆菌株，并涂布在含100 g/mL氨芐霉素的LB固體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取陽性克隆子進行菌液測序，并按照質(zhì)粒提取試劑盒說明對陽性克隆提取質(zhì)粒進行雙酶切鑒定。按照質(zhì)粒3 μl，NdeI和XbaI各0.25 μl，10×Buffer 1.0 μl，加雙蒸水至10 μl的酶切體系進行鑒定。測序結(jié)果通過NCBI網(wǎng)站進行ORF(開放閱讀框)查找，從而驗證所測序列編碼的氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫中編碼該酶的氨基酸序列是否相否。測序和酶切鑒定結(jié)果均正確的克隆子的質(zhì)粒載體命名為pCZN 1-CwlJ。大腸桿菌具有效率高、成本低、穩(wěn)定、表達水平高、容易放大規(guī)模等優(yōu)點，是目前最常用的表達系統(tǒng)[11-12]，故將重組質(zhì)粒pCZN 1-CwlJ轉(zhuǎn)化大腸桿菌Arctic Express TM(DE3)，用于下一步異源表達皮層裂解酶CwlJ。

表1 PCR反應物及反應體系

圖1 原核表達載體pCZN 1-CwlJ的構(gòu)建Fig.1 Construction of prokaryotic expression vector pCZN 1-CwlJ

1.2.4 IPTG誘導pCZN 1-CwlJ表達重組蛋白 將已驗證過的陽性克隆表達菌接種于含50 μg/mL Amp(氨芐青霉素)的5 mL LB培養(yǎng)基的試管中，37 ℃ 220 r/min 振蕩過夜；次日按1∶100的比例接種于含50 μg/mL Amp的 30 mL LB 培養(yǎng)基中，37 ℃ 220 r/min振搖至菌體OD600值為0.6～0.8；從中取出1 mL培養(yǎng)物，10 000 r/min室溫離心2 min，棄上清，用100 μl 1×蛋白上樣緩沖液重懸菌體沉淀，得到樣①；向剩余的培養(yǎng)物中加入IPTG 至終濃度為0.5 mM，37 ℃ 220 r/min 振搖4 h，誘導重組蛋白表達；取出1 mL培養(yǎng)物，10 000 r/min室溫離心2 min，棄上清，用100 μl 1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀，得到樣②。剩余培養(yǎng)物4000 r/min，離心10 min，棄上清，用 PBS緩沖液重懸菌體沉淀，重懸液進行超聲波破碎后(破碎功率400 W，工作4 s，休息8 s，破碎20 min)，分別取上清液與沉淀液各自加入上樣緩沖液重懸，得到樣③④。對上述4個樣進行12 % SDS-PAGE，考馬斯亮藍染色顯帶，檢測并分析目的基因是否表達，以及表達形式在上清液還是離心沉淀物里。

1.2.5 重組皮層裂解酶CwlJ的變復性及純化 由于目的蛋白表達形式在離心沉淀物里，說明該蛋白為包涵體。通常外源蛋白過表達會導致蛋白聚集形成包涵體，需通過分離并將其變性溶解使蛋白質(zhì)去折疊、復性、純化等流程進而恢復蛋白活性[13]。故將菌體沉淀液重懸于20 mL裂解液繼續(xù)超聲破碎；破碎后的細胞裂解液于4 ℃ 10 000 r/min離心20 min，繼續(xù)收集沉淀；使用包涵體洗滌液(20 mM Tris，1 mM EDTA，2 M尿素，1 M NaCl，1 % Triton X-100，pH 8.0)洗滌包涵體3次；用溶解緩沖液(20 mM Tris，5 mM DTT，8 M尿素，pH 8.0)，按一定比例溶解包涵體，4 ℃放置過夜；室溫下梯度稀釋并緩慢攪拌，將蛋白溶液裝入透析袋于緩沖液中(20 mM Tris-HCl，0.15 M NaCl，pH 8.0)透析過夜[14]。

表2 SDS-PAGE相關(guān)試劑的配制

根據(jù)His標簽采用鎳柱在蛋白層析純化系統(tǒng)的輔助下進行親和純化，過柱所用樣品及緩沖液皆用0.22 μm濾膜過濾。首先用平衡緩沖液(20 mM磷酸鈉緩沖液，0.5 mM NaCl)以4 mL/min的流速平衡5個柱體積，至UV 280 nm監(jiān)測曲線為水平后開始上樣；樣品過柱期間保存破碎處理后的樣品原液和流穿液，上樣流速1.5 mL/min；用洗脫緩沖液(20 mM磷酸鈉緩沖液，0.5 mM NaCl，500 mM Imidazole) 洗脫，流速1.5 mL/min；用1.5 mL EP管收集洗脫下的蛋白峰；12 %分離膠進行SDS-PAGE電泳檢測[15]。

1.2.6 SDS-PAGE凝膠電泳檢測 按照表2準備試劑，表3配制膠，參考郭堯君等[16]的方法進行電泳，控制電壓在濃縮膠中為75 V，走過濃縮膠后電壓調(diào)為120 V。電泳時觀察凝膠板上的樣品溴酚藍的色條帶走至近底端1 cm 時，停止電泳，關(guān)閉電源，然后對凝膠染、脫色。

表3 SDS-PAGE膠的配制

1.2.7 重組皮層裂解酶CwlJ的Western-blot鑒定 Western Blot蛋白質(zhì)印跡法通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細胞或組織中表達情況的信息[17]。本實驗以His標簽鼠單抗進行Western-blot以鑒定His標簽蛋白CwlJ的表達情況。取5 μl樣品進行SDS-PAGE，電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳；恒壓100 V轉(zhuǎn)膜，約為1.5 h，恒流250 mA；電轉(zhuǎn)結(jié)束后，取下膜后先用PBST洗滌4次，每次5 min；將膜置于5 %脫脂奶粉封閉液中37 ℃封閉1 h；用封閉液稀釋一抗his(稀釋比例1∶1000)，膜在一抗稀釋液中4 ℃過夜；次日將膜取出后用PBST洗膜4次，每次5 min；用含5 %牛奶的封閉液稀釋二抗羊抗兔(稀釋比例1∶5000)，膜在二抗中37 ℃反應1 h；反應完畢后，把膜取出后置于干凈的盒子中洗膜4次，每次5 min進行ECL顯影，曝光。

1.2.8 重組皮層裂解酶CwlJ活性分析 皮層裂解酶會導致脫芽孢衣芽孢萌發(fā)，芽孢萌發(fā)時，其核心部分水化，導致其折光性發(fā)生變化，表現(xiàn)為脫芽孢衣芽孢懸浮液OD600值顯著下降，下降程度越高，芽孢的萌發(fā)率就越高，皮層裂解酶活性也就越高[18-19]，所以以此來分析該重組蛋白的生物活性，并參照章中方法[21]將酶活性單位(U/L) 定義為: 每分鐘OD600值降低0.001所需的酶量，具體計算公式如下。

將純化后凍干的1 mg重組蛋白溶于5 mL pH 7、12.5 mM的PBS緩沖液，并作用于0.2 mL脫芽孢衣芽孢溶液，60 min后根據(jù)分光光度計OD600值的變化計算酶活性X及比酶活力。

1.2.9 溫度、pH對皮層裂解酶CwlJ活性的影響 將皮層裂解酶CwlJ凍干粉按照0.2 mg/mL的比例溶于12.5 mM的PBS緩沖液，分成9等份置于不同溫度(4、10、20、30、40、50、60、70、80 ℃)條件下的水浴鍋中恒溫10 min，按照1.2.8中酶活性計算公式計算酶活，將測得的最大活性定為 100 %，并繪制溫度對皮層裂解酶CwlJ活性影響的相對酶活曲線圖。

將皮層裂解酶CwlJ凍干粉按照0.2 mg/mL的比例分成六等份，分別溶于不同pH(1、3、5、7、9、11)條件下的12.5 mM的PBS緩沖液中，加入反應底物脫芽孢衣芽孢溶液0.2 mL，按照1.2.8中酶活性計算公式計算酶活，并將測得的最大活性定為100 %，并繪制pH對皮層裂解酶CwlJ活性的影響的相對酶活曲線圖。

A: M. DNA marker SM0331；泳道1.CwlJ基因的克隆產(chǎn)物電泳圖B: M. DNA marker SM0331；泳道1.重組質(zhì)粒pCZN 1-CwlJ的雙酶切驗證電泳圖圖2 皮層裂解酶基因的克隆(A)與重組質(zhì)粒的雙酶切驗證(B)Fig.2 Cloning of the cleavage enzyme gene (A) and double enzyme digestionof recombinant plasmid (B)

2 結(jié)果與分析

2.1 CwlJ基因的克隆與重組質(zhì)粒的構(gòu)建

通過PAS法，兩步PCR合成目的基因CwlJ，所得產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳分析檢測，結(jié)果顯示在Marker為500 bp處有一清晰條帶，目的條帶上方出現(xiàn)的陰影可能是引物不特異或者退火溫度不合理等原因。將CwlJ基因的PCR合成片段連接到載體上，獲得重組質(zhì)粒pCZN 1-CwlJ。該質(zhì)粒經(jīng)NdeI和XbaI雙酶切鑒定(圖2)，很明顯該列有2條條帶，其中一個條帶大于3000 bp，符合載體大小；另一個條帶在500 bp附近，符合目的條帶大小，可初步斷定CwlJ已經(jīng)插入到質(zhì)粒pCZN 1中。

2.2 重組菌菌液測序驗證及序列比對

按照1.2.2的方法合成了目的基因CwlJ，轉(zhuǎn)入克隆菌株TOP10后挑取陽性克隆子進行測序，對測序結(jié)果序列進行ORF(開放閱讀框)查找(表4)，發(fā)現(xiàn)CwlJ基因的克隆產(chǎn)物含有1個462 bp的開放閱讀框，編碼153個氨基酸，蛋白理論分子量約為17.9 KDa，具體氨基酸種類名稱如圖3。該結(jié)果同蛋白數(shù)據(jù)庫給出的皮層裂解酶CwlJ氨基酸序列比對后相似性為100 %(圖4)。由此得出結(jié)論pCZN 1-CwlJ重組表達載體構(gòu)建成功，可用于下一步目標蛋白CwlJ的誘導表達。

2.3 重組皮層裂解酶CwlJ的表達鑒定及SDS-PAGE分析

重組質(zhì)粒pCZN 1-CwlJ轉(zhuǎn)入大腸桿菌Arctic-Express TM(DE3)中后，37 ℃下以終濃度0. 5 mM / L IPTG誘導培養(yǎng)12 h，然后用SDS-PAGE檢測蛋白質(zhì)表達情況，從電泳結(jié)果(圖5)可以看出：IPTG誘導下pCZN 1-CwlJ轉(zhuǎn)化的菌體成功誘導17.9 KD左右的重組蛋白質(zhì)，在離心沉淀物中較為明顯(泳道4)，說明蛋白并未以可溶性形式釋放，不在上清中。

表4 開放閱讀框ORF的查找結(jié)果

圖3 重組菌菌液測序后的ORF查找結(jié)果 Fig.3 ORF Searching results after sequencing of recombinant bacteria solution

圖4 重組皮層裂解酶CwlJ序列同標準序列比對Fig.4 Comparison of recombinant cortical lyase CwlJ sequence with standard sequence

M: 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1: 未誘導；2: 誘導后；3: 誘導破碎后上清；4: 誘導破碎后沉淀圖5 重組皮層裂解酶CwlJ的表達鑒定及SDS-PAGE分析Fig.5 Expression and identification of recombinant cortical lyase CwlJ and SDS-PAGE analysis

2.4 pCZN 1-CwlJ表達產(chǎn)物的純化

構(gòu)建好的重組表達載體pCZN 1-CwlJ轉(zhuǎn)化大腸桿菌Arctic-Express TM ( DE3 )后，在37 ℃下，經(jīng)0. 5 mM/L IPTG誘導，重組皮層裂解酶CwlJ充分表達(圖6)。通過鎳柱親和層析，逐漸遞增咪唑濃度，在咪唑濃度為250 mM時出現(xiàn)目的蛋白峰，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳檢測出一條大小約為17.9 KD左右的目的條帶，表明目的蛋白CwlJ在大腸桿菌中得以表達，并成功純化。且1 L的誘導培養(yǎng)基可獲得約15 mg的CwlJ，蛋白得率明顯高于從天然芽孢中提取所得的皮層裂解酶的量，便于大量制備[22]。

M: 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1: 破碎后處理樣品；2: 流出；3: 洗脫圖6 pCZN 1-CwlJ表達產(chǎn)物的純化Fig.6 Purification of pCZN 1-CwlJ expression product

M: 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1: 純化后CwlJ樣品圖7 重組皮層裂解酶CwlJ的Western Blot鑒定分析Fig.7 Western Blot analysis of Recombinant cortical lyase CwlJ

圖8 溫度對皮層裂解酶CwlJ活性的影響Fig.8 Effect of temperature on the activity of cortical lyase CwlJ

2.5 重組皮層裂解酶CwlJ的Western-blot鑒定

以his標簽為抗體對重組皮層裂解酶CwlJ進行Western-blot 鑒定，發(fā)現(xiàn)重組蛋白與his標簽抗體能發(fā)生特異性反應，在17.9 KD處出現(xiàn)特異性條帶，完整性良好(圖7)，與純化后的表達產(chǎn)物條帶大小相一致。表明表達的重組蛋白質(zhì)是目的蛋白CwlJ，便于后續(xù)試驗研究。

圖9 pH對皮層裂解酶CwlJ活性的影響Fig.9 Effect of pH on CwlJ activity of cortical lyase

2.6 重組皮層裂解酶CwlJ的活性分析

根據(jù)1.2.8的實驗方法，測得60 min后加入酶液的脫芽孢衣芽孢懸浮液OD600值降低了0.044，所得酶活性值為146.67 U/L，比酶活力146.67 U/mg，相比從天然芽孢中提取出來的皮層裂解酶終活性值67.63 U/L[21]，重組皮層裂解酶的活性提高了2倍。

如圖8所示，在40 ℃以下時皮層裂解酶CwlJ活性隨溫度的升高而升高，溫度達到40 ℃時CwlJ活性最大，表明其最適反應溫度為40 ℃。皮層裂解酶CwlJ在30～50 ℃時具有較高活性，在 50 ℃后活性隨著溫度的升高而降低。溫度低于20 ℃以及高于60 ℃時CwlJ活性較小。

如圖9所示，皮層裂解酶CwlJ在pH 5.0 以下時活性隨pH的升高而升高，當pH達到5.0時CwlJ活性最高，pH超過5.0后活性又逐漸降低，因此最適p H為5.0。皮層裂解酶CwlJ在pH為3～5時具有較高活性，在pH 5以后的活性隨著pH的升高而降低。pH低于3以及高于7時CwlJ活性較小，接近失活。

3 討 論

本實驗構(gòu)建了pCZN 1-CwlJ重組表達載體，建立了高效表達皮層裂解酶CwlJ的基因工程菌，并成功誘導重組皮層裂解酶CwlJ基因表達。雖然表達產(chǎn)物為包涵體，但是仍然沒有阻礙實驗的進行，起初包涵體確實沒有活性，這是因為蛋白的錯誤折疊并形成了不可溶性的蛋白聚集體，參照近年來包涵體活性恢復的相應文獻，采用了一系列蛋白變復性方法，最終成功純化并獲得有活性的皮層裂解酶CwlJ，為后期實驗奠定了基礎(chǔ)。作為包涵體，由于其是蛋白聚集體，純化相對容易，而且包涵體的形成避免了蛋白水解酶對蛋白產(chǎn)物的降解而大大提高了蛋白產(chǎn)率，但是缺點在于酶蛋白的活性會受影響。后續(xù)研究如果時間和條件允許可以嘗試改變誘導表達條件或者更換載體質(zhì)粒，讓其表達形式是在上清夜里，而非沉淀里，并實現(xiàn)可溶性表達，酶的活性可能會進一步提高。

4 結(jié) 論

研究發(fā)現(xiàn)0.5 mM的IPTG能實現(xiàn)CwlJ基因的大量表達。純化后的重組皮層裂解酶CwlJ分子量為17.9 KD，Western-Blot實驗進一步表明表達的重組蛋白質(zhì)是目的蛋白CwlJ，其最適溫度為40 ℃、最適pH值為5，比酶活力146.67 U/mg，相比從天然芽孢中提取出來的皮層裂解酶，重組皮層裂解酶的活性提高了2倍，保證了皮層裂解酶CwlJ進一步水解肽聚糖實驗的進行。