王 弋，董 晨，魏永贊，鄭雪文，李偉才

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院南亞熱帶作物研究所，農(nóng)業(yè)部熱帶果樹生物學重點實驗室，廣東 湛江 524091)

【研究意義】荔枝起源于我國，是嶺南地區(qū)的特色水果，因其甜美的風味和豐富的營養(yǎng)深受消費者的歡迎。但是大部分荔枝品種果核大，影響食用口感及商品價值。‘妃子笑’是目前產(chǎn)量最大的荔枝品種，具有果大核小的優(yōu)點，因此對‘妃子笑’果核發(fā)育相關(guān)的基因進行分析，有助于理解荔枝果核發(fā)育的分子機制，為今后利用生物技術(shù)定向改良果核性狀提供基因資源?！厩叭说难芯窟M展】利用分子生物學及遺傳學的方法，科學家已在擬南芥和水稻等植物中鑒定了多個調(diào)控種子大小的基因如DA1，GS3，GW7，DEP1等[1-4]。其中DA1是一個重要的種子大小調(diào)控基因，該基因編碼一泛素受體。擬南芥中的研究發(fā)現(xiàn)，該基因突變后種子和器官大小顯著增加，細胞學觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)DA1通過抑制珠被細胞的增殖控制種子大小[5]。蛋白序列分析表明，DA1蛋白具有兩個泛素受體典型的ubiquitin interaction motifs (UIM)和一個single zinc-binding(LIM)結(jié)構(gòu)域。生化實驗表明，DA1蛋白與E3連接酶DA2存在直接的蛋白互作，推測DA1通過DA2識別并降解特異底物。此外，DA1與UBP15也存在直接的相互作用，并且通過影響其蛋白穩(wěn)定性調(diào)控種子大小[5]。DA1不僅影響種子大小，調(diào)控該基因的表達水平還能夠提高作物產(chǎn)量。在油菜中，下調(diào)DA1同源基因BnDA1的表達能夠顯著增加種子大小，提高種子產(chǎn)量及生物量[6]；而在玉米中，通過上調(diào)突變形式DA1的表達水平也可增加產(chǎn)量并增強淀粉的合成[7]。這表明DA1在作物生產(chǎn)中具有重要的利用價值，但目前該基因在荔枝中并未見報道。【本研究切入點】根據(jù)前期RNA-seq數(shù)據(jù)，預測荔枝DA1的同源基因。利用生物信息學軟件分析3個基因及其編碼蛋白的序列特征?！緮M解決的關(guān)鍵問題】分析荔枝DA1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域及其進化關(guān)系，為進一步研究荔枝DA1基因的生物學功能提供重要信息。

1 材料與方法

1.1 植物材料

以荔枝種質(zhì)資源圃種植的16年樹齡、樹勢較壯的‘妃子笑’荔枝結(jié)果樹為實驗母樹。取雌花謝花后50 d果實中的果核為實驗材料，果核以液氮處理，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2 基因序列的獲得

根據(jù)前期RNA-seq數(shù)據(jù)，分析鑒定荔枝LcDA1基因轉(zhuǎn)錄本，利用NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)的Open Reading Frame Finder在線軟件分析荔枝LcDA1的開放閱讀框[1]。

1.3 蛋白理化性質(zhì)分析

利用ProtParam網(wǎng)站(http://web.expasy.org/protparam/)，對荔枝DA1蛋白的相對分子量、氨基酸數(shù)量及理論等電點等理化性質(zhì)進行分析。

1.4 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測

蛋白二級結(jié)構(gòu)利用PredictProtein (https://www.predictprotein.org/)在線平臺進行分析。

1.5 結(jié)構(gòu)域分析

使用EBI數(shù)據(jù)庫的interProScan功能(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)對荔枝LcDA1蛋白保守結(jié)構(gòu)域進行分析。

1.6 進化樹分析

利用AlignX軟件對利荔枝LcDA1蛋白以及來自油菜、擬南芥、玉米等物種的DA1蛋白進行多重序列比對，并利用MEGA 6.06軟件的neighbor-joining工具進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 荔枝LcDA1基因的鑒定及序列分析

根據(jù)前期RNA-seq數(shù)據(jù)，對擬南芥DA1的同源基因進行進行鑒定，并在種子cDNA中進行擴增。鑒定到3個荔枝DA1同源基因，分別命名為LcDA1-1，LcDA1-2和LcDA1-3。3個基因轉(zhuǎn)錄本長度分別3039、2525和2187 bp，ORF長度分別為1419、1479和1104 bp。3個荔枝DA1同源基因的信息列于表1。

2.2 荔枝LcDA1蛋白理化性質(zhì)分析

利用ProtParam網(wǎng)站，對3個荔枝LcDA1的理化性質(zhì)進行分析。結(jié)果顯示LcDA1-1、LcDA1-2和LcDA1-3蛋白分子式分別為C2347H3606N670O709S36、C2436H3775N683O773S33和C1807H2756N514O553S32，相對分子量分別為53706.67、56055.86和41554.79，理論等電點分別為5.89、5.16和6.46，不穩(wěn)定系數(shù)分別為68.83、69.84和56.10(表2)。

2.3 荔枝LcDA1基因與DA1的序列相似性比較

利用Vector NTI軟件的Alignx工具，對荔枝LcDA1-1，LcDA1-2和LcDA1-3基因及擬南芥DA1基因堿基及氨基酸序列進行比對，分析不同DA1基因及編碼蛋白之間的相似性。結(jié)果顯示在堿基和蛋白水平LcDA1-1和LcDA1-2具有較高的相似性，而與LcDA1-3的相似性較差(表3)。這與LcDA1-3在C末端較LcDA1-1和LcDA1-2缺少100多個蛋白相關(guān)。

表1 荔枝LcDA1基因的基本特征

表2 LcDA1蛋白理化性質(zhì)分析

表3 荔枝LcDA1與擬南芥DA1基因及編碼蛋白相似性分析

2.4 荔枝LcDA1基因保守結(jié)構(gòu)域分析

為了分析LcDA1的蛋白結(jié)構(gòu)，利用EBI數(shù)據(jù)庫的interProScan功能對LcDA1蛋白的結(jié)構(gòu)域進行分析。結(jié)果顯示在LcDA1-1、LcDA1-2和LcDA1-3蛋白均具有LIM-type鋅指結(jié)構(gòu)域[8-9]；LcDA1-1、LcDA1-2還有2個與泛素互作的基序UIM1和UIM2[10]。這些保守基序及結(jié)構(gòu)域暗示LcDA1蛋白具有與DA1蛋白相同的功能(圖1)。

2.5 荔枝LcDA1二級結(jié)構(gòu)分析

利用predictprotein對LcDA1的二級結(jié)構(gòu)進行預測。結(jié)果顯示LcDA1-1由27.54 %的α-螺旋，8.69 %的β折疊及63.70 %的無規(guī)則卷曲組成；LcDA1-2由28.05 %的α-螺旋，6.10 %的β折疊及65.85 %的無規(guī)則卷曲組成；LcDA1-3由16.08 %的α-螺旋，7.36 %的β折疊及76.57 %的無規(guī)則卷曲組成(表4)。

2.6 荔枝LcDA1進化樹分析

將擬南芥DA1蛋白序列在NCBI中進行Blast檢索，獲得多個物種的DA1同源蛋白序列并下載(圖2)。物種包括水稻(Oryzasativa)，醉蝶花(Tarenayahassleriana)，月季(Rosachinensis)，蘿卜(Raphanussativus)，桃(Prunuspersica)，梅(Prunusmume)，櫻桃(Prunusavium)，毛果楊(Populustrichocarpa)，桑樹(Morus notabilis)，木薯(Manihotesculenta)，錦葵(Herraniaumbratica)，棉花(Gossypiumhirsutum)，野草莓(Fragariavesca)，山萮菜(Eutremasalsugineum)，桉樹(Eucalyptusgrandis)，番木瓜(Caricapapaya)，甘藍(Brassicaoleracea)，油菜(Brassicanapus)。不同物種中的DA1同源蛋白序列以MEGA 6.06軟件進行分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果顯示LcDA1-1、LcDA1-2和LcDA1-3分別于不同的植物聚類在一起，其中LcDA1-1與番木瓜的進化關(guān)系最近，LcDA1-2和LcDA1-3與水稻的進化關(guān)系最近。

圖1 LcDA1蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.1 Conserved domains of LcDA1 protein

表4 蛋白二級結(jié)構(gòu)

3 討 論

DA1編碼一類泛素受體蛋白，受體蛋白既能夠識別游離泛素，也能夠識別被泛素化的底物[11-12]，擬南芥中的研究發(fā)現(xiàn)該基因參與調(diào)控植物種子大小。擬南芥DA1蛋白編碼532個氨基酸，包含2個泛素作用結(jié)構(gòu)域(UIM)和1個鋅指結(jié)構(gòu)域(LIM)。在育種中DA1也表現(xiàn)出很好的應用潛力，有研究表明調(diào)控油菜和玉米中通過調(diào)控DA1同源基因的表達水平可顯著增加產(chǎn)量和生物量[6-7]。

本研究在荔枝中鑒定到3個DA1同源基因(LcDA1-1、LcDA1-2和LcDA1-3)，基因編碼蛋白長度分別為473、493和368個氨基酸。生物信息分析表明LcDA1-1、LcDA1-2編碼蛋白與擬南芥DA1蛋白的相似性達到58.6 %和53.0 %。而LcDA1-3與擬南芥DA1相似性偏低，僅有27.9 %，這與LcDA1-3相比擬南芥DA1缺少164個氨基酸相關(guān)。雖然蛋白相似性并不是非常高，但LcDA1-1、LcDA1-2和LcDA1-3均具有典型的LIM結(jié)構(gòu)域，而LcDA1-1和LcDA1-2還具有UIM結(jié)構(gòu)域，這表明LcDA1-1、LcDA1-2和LcDA1-3確為擬南芥DA1的同源基因。UIM是泛素受體重要的保守結(jié)構(gòu)域，其能夠作為接頭與泛素化底物相互作用，并將底物引導至降解的位置。生化實驗發(fā)現(xiàn)，UIM中的UIM2負責與泛素和E3泛素連接酶結(jié)合[13]。LIM也是一類保守的結(jié)構(gòu)域，其包含鋅指串聯(lián)結(jié)構(gòu)域，為特異的蛋白互作提供平臺[14-15]。LcDA1-1、LcDA1-2和LcDA1-3基因編碼蛋白中關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域的保守性也表明其在進化中受到嚴格的選擇，也暗示LcDA1-1、LcDA1-2和LcDA1-3具有與擬南芥DA1蛋白類似的生物學功能。

圖2 荔枝和21種植物LcDA1蛋白系統(tǒng)進化樹分析Fig.2 Phylogenetic tree of LcDA1 protein in litchi and 20 other plants

進化樹分析表明，LcDA1-1、LcDA1-2和LcDA1-3并未聚類在一起，而是分別與不同植物的DA1蛋白聚類在一起，這表明LcDA1-1、LcDA1-2和LcDA1-3已經(jīng)出現(xiàn)了一定的分化。LcDA1-1與來自熱帶果樹番木瓜的進化關(guān)系最近，LcDA1-2和LcDA1-3與水稻的OsDA1聚類在一起。

4 結(jié) 論

本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，在荔枝中鑒定了3個DA1同源基因的全長序列。生物信息學分析結(jié)果顯示3個基因的編碼蛋白均含有DA1蛋白典型的LIM結(jié)構(gòu)域，暗示LcDA1-1、LcDA1-2和LcDA1-3具有保守的蛋白功能。本研究為利用DA1基因調(diào)控荔枝種子大小，從而改善荔枝果實品質(zhì)改良提供了重要基因資源。