王 瑩，林 多，楊延杰，王莉月，馬 靜

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，青島市園藝植物遺傳改良與育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109)

【研究意義】辣椒(CapsicumannuumL.)作為一種重要的蔬菜和工業(yè)加工原料，年種植面積持續(xù)穩(wěn)定在147萬平方公頃以上，是我國(guó)種植面積最大的蔬菜作物之一[1]。由于辣椒整個(gè)生育時(shí)期受外界環(huán)境影響較大，環(huán)境因素成為限制產(chǎn)量和品質(zhì)的主要因素，例如高溫、干旱、鹽堿等非生物脅迫都會(huì)致使產(chǎn)量和品質(zhì)下降[2]。因此對(duì)辣椒NAC家族CaNAC61基因進(jìn)行克隆與表達(dá)分析，對(duì)辣椒耐鹽新品種的研究具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】NAC轉(zhuǎn)錄因子家族是近年來發(fā)現(xiàn)的植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子[3]，該家族基因的N端含有高度保守的氨基酸序列[4]，C端序列高度多樣化，能轉(zhuǎn)錄激活或抑制其活性。NAC參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的多個(gè)過程，如植物的開花、次生壁的形成、葉片衰老等過程[5]，很多研究結(jié)果表明，NAC參與干旱、高鹽、低溫等非生物脅迫，其轉(zhuǎn)錄表達(dá)可以明顯提高植物的抗性。在水稻中，過表達(dá)OsNAC5、OsNAC9和OsNAC10，可以提高水稻的產(chǎn)量及其對(duì)干旱脅迫的抗性[6-7]。在擬南芥中，AtNAC072和AtNAC019是ABA信號(hào)通路的關(guān)鍵基因，AtNAC072的表達(dá)受高鹽、脫落酸、乙烯等多種因素誘導(dǎo)并參與植物的信號(hào)傳導(dǎo)，AtNAC019的表達(dá)受ABA、熱、高鹽、干旱應(yīng)答等因素誘導(dǎo)，并調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育[8-10]。【本研究切入點(diǎn)】鑒于NAC基因在植物逆境中的重要作用，前期結(jié)合對(duì)辣椒NAC家族的基因表達(dá)和功能研究的基礎(chǔ)上，從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得CaNAC61基因，采用同源序列法從辣椒中克隆出目的基因?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究中以‘青農(nóng)干椒2號(hào)’和‘青農(nóng)干椒8號(hào)’為試驗(yàn)材料，利用 RT-PCR方法，克隆得到CaNAC61基因的全長(zhǎng)片段，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并對(duì)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)等進(jìn)行預(yù)測(cè)，采用RT-PCR技術(shù)分析干制辣椒在不同脅迫下的表達(dá)模式，為深入研究辣椒NAC基因功能提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料選用‘青農(nóng)干椒2號(hào)’和‘青農(nóng)干椒8號(hào)’六葉期幼苗，由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)干制辣椒育種課題組提供。植物總RNA提取試劑盒購(gòu)自天根(上海)生化科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自寶生物生物技術(shù)(北京)有限公司；DNA膠回收試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；質(zhì)粒載體pMD19-T simple Vector購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；引物合成和DNA測(cè)序由青島擎科梓熙科技技術(shù)有限公司完成。

干制辣椒材料種植于植物生長(zhǎng)室，待辣椒苗長(zhǎng)至6到7片葉，對(duì)正常植株進(jìn)行6種處理，分別用100 μM PEG、MEJA、SA、ABA溶液、200 mM NaCl和38 ℃高溫進(jìn)行處理，設(shè)置未做任何處理的植株為對(duì)照，每處理3次生物學(xué)重復(fù)。分別在處理3、6、12 h取植株的根、莖、葉各0.1 g，取樣完成后放入液氮保存，對(duì)辣椒的葉片進(jìn)行總RNA的提取及cDNA的合成。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物

1.2 CaNAC61基因的克隆

總RNA提取和cDNA合成按照天根公司的RNA試劑盒和寶日醫(yī)公司的 pMD 19-T simple vector試劑盒操作說明完成。根據(jù)辣椒的CaNAC61基因設(shè)計(jì)1對(duì)引物，分別為CaNAC61-F和CaNAC61-R(表1)。PCR擴(kuò)增體系及方法參考王莉月等的方法[11]，采用 20 μl體系。將擴(kuò)增產(chǎn)物使用1 %瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，回收目標(biāo)片段，連接pMD19-T simple Vector載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌、陽性克隆后，送至青島擎科梓熙科技技術(shù)有限公司測(cè)序，并用BioXM 2.6軟件驗(yàn)證結(jié)果。

1.3 CaNAC61基因的生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN 軟件獲得基因編碼序列；利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；用DNAMAN進(jìn)行氨基酸序列的多重比對(duì)[12-13]；利用Prot Scale程序(https://expasy.org/cgibin/protscale.pl)完成蛋白質(zhì)疏水性分析[14]；利用Prot-Param軟件進(jìn)行理化性狀分析[15]；利用SWISS-MODEL工具進(jìn)一步預(yù)測(cè)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，并模擬蛋白結(jié)構(gòu)[16]。

1.4 CaNAC61基因的表達(dá)分析

使用LightCycler 480 II qRT-PCR檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。根據(jù)擴(kuò)增的CaNAC61序列設(shè)計(jì)表達(dá)檢測(cè)引物，分別為CaNAC61-F1和CaNAC61-R1(表1)。使用 LightCycler?480 SYBR Green I Master試劑盒，操作按說明書進(jìn)行。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系及方法參考王莉月等方法[11]。采用20 μl體系，反應(yīng)體系設(shè)置為dd H2O 7 μl，SYBR Green I Master 10 μl，PCR Forward Primer (10 μM) 1 μl，PCR Reverse Primer (10 μM)1 μl，DNA模板1 μl。反應(yīng)體系為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 5 s，65 ℃ 1 min，97 ℃；40 ℃ 10 s。以Actin-F和Actin-R(表1)作為內(nèi)參，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3個(gè)對(duì)照，使用Excel軟件進(jìn)行不同組織內(nèi)表達(dá)水平的分析，基因相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法[17]進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 CaNAC61基因的克隆與序列分析

以青農(nóng)干椒2號(hào)和8號(hào)品種的cDNA為模板擴(kuò)增目的基因，得到2個(gè)均在800 bp左右的片段(圖1)。結(jié)果表明兩個(gè)辣椒品種中的CaNAC61均含有一個(gè)全長(zhǎng)885 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼294個(gè)氨基酸(圖2)。

M: BM2000 DNA marker; 1:‘青農(nóng)干椒 2 號(hào)’; 2:‘青農(nóng)干椒 8 號(hào)’BM2000 DNA marker; 1: ‘Qingnong dried pepper No. 2’; 2: ‘Qingnong dried pepper No. 8’圖1 CaNAC45 基因 PCR 擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification CaNAC45 gene

2.2 多序列比較和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用DNAMAN 軟件對(duì)CaNAC61與擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)煙草(Nicotianatabacum)、番茄(Solanumlycopersicum)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)ATAF亞家族NAC蛋白進(jìn)行序列比對(duì)，由圖3可得，CaNAC61具有特征性N端和C端區(qū)域即N端具有多個(gè)高度保守序列，而C端是高度多變的轉(zhuǎn)錄激活調(diào)控域，由此可得，CaNAC61具有NAC轉(zhuǎn)錄因子ATAF亞家族的典型特征，表明CaNAC61屬于ATAF亞家族。

為了分析CaNAC61的親緣關(guān)系，將干制辣椒與煙草(Nicotianatabacum)；向日葵(Helianthusannuus)；辣椒(Capsicumannuum)；菠菜(Spinaciaoleracea)；可可(Theobromacacao)等植物的蛋白序列比對(duì)顯示(圖4)，氨基酸序列被聚為兩大類，馬鈴薯、番茄、辣椒、煙草的親緣關(guān)系最近，與鷹嘴豆、綠豆、大豆、蓖麻等其他物種在進(jìn)化上的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；推測(cè)CaNAC61基因的功能可能與馬鈴薯、番茄、煙草的功能相似。

圖2 CaNAC61基因的核苷酸及氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and amino sequences of CaNAC61 gene

黑色背景表示氨基酸序列完全一致，灰色背景表示氨基酸序列出現(xiàn)保守替換The black background indicates that the amino acid sequence is completely consistent, and the gray background indicates the conservative substitution of the amino acid sequence圖3 辣椒NAC61的氨基酸多序列比較Fig.3 The alignment of amino acid sequences of NAC from pepper

圖4 辣椒CaNAC61轉(zhuǎn)錄因子亞族的進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of CaNAC61 from pepper and other plants

表2 其他植物的NAC蛋白氨基酸組分及理化性質(zhì)分析

圖5 辣椒CaNAC61蛋白疏水和親水性預(yù)測(cè)Fig.5 Predication of hydrophobic and hydrophilic properties of CaNAC61 from pepper

2.3 氨基酸組分及理化性質(zhì)分析

將CaNAC61轉(zhuǎn)錄因子蛋白與另外14種植物NAC轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行氨基酸組成成分及理化性質(zhì)分析。結(jié)果顯示干制辣椒CaNAC61的蛋白質(zhì)相對(duì)分子量為33.67 kD，理論等電點(diǎn)為6.26。干制辣椒和其他14種植物的NAC蛋白氨基酸數(shù)在289～303，酸性蛋白。在干制辣椒CaNAC61和15種其他植物NAC蛋白中，脂肪族氨基酸比例大于芳香族氨基酸比例(表2)。

干制辣椒CaNAC61蛋白由22種氨基酸組成，其中，脯氨酸(Pro)含量最高，為9.5 %，半胱氨酸(Cys)含量最低，為 1.7 %；脂肪族系數(shù)(Aliphatic amino acid)為67.69 ；不穩(wěn)定系數(shù)為54.98；親水性平均系數(shù)為-0.660，表現(xiàn)為親水性(圖5)。

2.4 二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析

將CaNAC61利用SOPMA在線工具上進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示CaNAC61編碼的294個(gè)氨基酸中，α螺旋占 35.75 %，β轉(zhuǎn)角占6.74 %，無規(guī)則卷曲有39.38 %。采用在線工SWISS MODEL對(duì)CaNAC61蛋白同源建模，進(jìn)而預(yù)測(cè)其三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖6)。

2.5 干制辣椒CaNAC61基因在不同逆境中的表達(dá)分析

為研究干制辣椒CaNAC61對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)CaNAC61基因在不同脅迫(100 μM PEG、MeJA、SA、ABA溶液、200 mM NaCl溶液、38 ℃高溫)處理下，不同處理時(shí)間(0、3、6、12 h)的基因相對(duì)表達(dá)水平變化。從圖7可知，CaNAC61基因在不同脅迫處理下均有一定程度的影響，其中，CaNAC61基因在NaCl、干旱處理3 h時(shí)，相比對(duì)照，分別為6.62和4.24倍，表達(dá)量顯著升高；12 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最低水平，分別為4.28和0.20倍；在高溫、SA和ABA處理中，CaNAC61基因隨著時(shí)間的增加表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，脅迫處理12 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高水平，分別為0.80、3.74、1.37倍；在MeJA中表達(dá)量則無顯著變化。隨著時(shí)間的推移CaNAC61基因在鹽和干旱處理中呈下調(diào)趨勢(shì)，而在高溫、SA和ABA處理中，隨時(shí)間推移呈下調(diào)趨勢(shì)，而MeJA處理則無顯著變化。在6種非生物脅迫處理中，CaNAC61在NaCl條件下誘導(dǎo)后表達(dá)量顯著升高，因此，CaNAC61基因在應(yīng)答鹽脅迫中發(fā)揮著重要作用。

圖6 CaNAC61蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.6 The three-dimension structure prediction of CaNAC61 protein

不同小寫字母表示在同一時(shí)間段不同脅迫處理下差異顯著(P<0.05)Different lowercase letters indicate significant differences under different stress treatments at the same time(P<0.05)圖7 辣椒NAC61基因在不同逆境中的表達(dá)水平Fig.7 Expression levels of NAC61 transcription factor gene of pepper plant in different abiotic stress treatments

3 討 論

在植物抗逆反應(yīng)過程中，NAC家族發(fā)揮著重要作用。對(duì)NAC基因生物信息學(xué)方面的研究可以促進(jìn)對(duì)NAC家族生物學(xué)功能的研究。本文通過對(duì)CaNAC61基因進(jìn)行氨基酸比對(duì)和多重序列分析表明，該轉(zhuǎn)錄因子是NAC家族的成員之一。辣椒的CaNAC61基因與馬鈴薯、番茄、辣椒、煙草親緣關(guān)系較近，而與綠豆、可可、木椿等作物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這符合植物各科屬在進(jìn)化中的關(guān)系，而與番茄、煙草等親緣關(guān)系較近，表明CaNAC61基因與茄科模式植物功能的相似性，這為以后研究CaNAC61的功能提供了參考依據(jù)。通過對(duì)CaNAC61編碼的氨基酸進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，表明二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋、β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲構(gòu)成；通過與不同植物的NAC蛋白的理化性質(zhì)分析，推測(cè)該蛋白為親水性蛋白。與辣椒CaNAC45分析結(jié)果一致[11]。在蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型中，多個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)圍繞反向平行結(jié)構(gòu)形成NAC結(jié)構(gòu)域，這符合典型的NAC轉(zhuǎn)錄因子三維結(jié)構(gòu)特征[2]。

轉(zhuǎn)錄因子作為一種重要的響應(yīng)因子，能夠快速應(yīng)答和調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)以提高植物的抵抗能力[21]。近年來已經(jīng)有大量的文獻(xiàn)證實(shí)，NAC家族轉(zhuǎn)錄因子在許多植物如擬南芥[22]、水稻[23]中的過表達(dá)能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性。將小麥TaNAC2基因轉(zhuǎn)入擬南芥后，DREB2A、ABI2、ABI5和RD22等基因的共表達(dá)可以提高對(duì)非生物脅迫的抗性[24]。CaNAC61基因在非生物脅迫和激素處理下的表達(dá)分析顯示，6種處理下均有響應(yīng)，表明6種處理均能誘導(dǎo)CaNAC61的表達(dá)量，其中NaCl處理表達(dá)顯著，其次干旱處理較為顯著；分別在3 h表達(dá)量達(dá)到最高水平，12 h表達(dá)量最低，表達(dá)量隨時(shí)間的推移呈先升高增加后降低趨勢(shì)；而水楊酸和茉莉酸甲酯處理與對(duì)照相比，整體上呈先升高后降低趨勢(shì)，并隨時(shí)間推移再次增加，他們的表達(dá)量分別在12和6 h達(dá)到最高水平，對(duì)熱處理和脫落酸處理則變化不顯著；CaNAC61基因?qū)}脅迫具有顯著的響應(yīng)作用，這表明CaNAC61在提高辣椒的耐鹽性方面起著重要作用，這對(duì)進(jìn)一步研究辣椒耐鹽品種提供理論依據(jù)；水楊酸和茉莉酸甲酯誘導(dǎo)CaNAC61基因的表達(dá)量提高，但不如鹽脅迫處理效果顯著，有研究表明棉花GhATAF1基因通過調(diào)控ABA、JA、和SA等信號(hào)，使其在非生物和生物脅迫中發(fā)揮重要作用[25]，這表明CaNAC61基因可能與水楊酸和茉莉酸甲酯誘導(dǎo)有關(guān)，但具體的作用機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。綜上所述，CaNAC61可能參與調(diào)節(jié)植物非生物脅迫響應(yīng)變化，下一步將從功能方面對(duì)其進(jìn)行深入研究。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)通過克隆獲得干制辣椒CaNAC61基因，對(duì)該基因編碼的氨基酸序列組成、理化性狀、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等，使用相關(guān)軟件對(duì)其編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析，獲得ORF全長(zhǎng)，編碼294個(gè)氨基酸；同源性比對(duì)和進(jìn)化樹分析表明CaNAC61是NAC轉(zhuǎn)錄因子家族ATAF亞家族成員之一。進(jìn)一步研究了CaNAC61在高鹽、干旱、高溫、SA、MeJA和ABA脅迫下的響應(yīng)。對(duì)其脅迫下的相關(guān)表達(dá)量進(jìn)行了分析，結(jié)果表明該基因在各種非生物脅迫下上調(diào)較為顯著，表明該基因可能在植物抗逆方面具有重要作用。下一步將通過功能等方面對(duì)該基因進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，以期為增強(qiáng)植物抗逆性奠定基礎(chǔ)。