曾雯珺,王東雪
(廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院/廣西油茶良種與栽培工程技術(shù)中心/廣西特色經(jīng)濟(jì)林培育與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 南寧 530002)
【研究意義】油茶(Camelliaoleifera)為異花授粉樹(shù)種,具有耐貧瘠,耐干旱的生長(zhǎng)特性,廣泛種植于南方低山丘陵地區(qū)[1-2]。油茶主產(chǎn)區(qū)屬于雨、旱季節(jié)性明顯的亞熱帶季風(fēng)性氣候,旱季正值油茶花芽發(fā)育、果實(shí)膨大、油脂轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵時(shí)期,嚴(yán)重的供水不足往往影響油茶樹(shù)體生長(zhǎng),枝葉焦枯,進(jìn)而抑制了樹(shù)體的光合作用,導(dǎo)致油茶生理落果,或者油脂合成率低,嚴(yán)重影響油茶產(chǎn)果量和產(chǎn)油量[3]。因此,開(kāi)展油茶抗旱性評(píng)價(jià)研究,不僅可以提高油茶造林成活率,且對(duì)提高油茶林分的經(jīng)濟(jì)效益、促進(jìn)農(nóng)民增收均具有重要意義?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來(lái),有關(guān)植物葉片解剖結(jié)構(gòu)與其抗旱性的研究已有不少,結(jié)果表明葉片特性與植物抗旱性相關(guān),如厚度大的葉片儲(chǔ)水能力強(qiáng),則抵御干旱能力強(qiáng)[4-8]??购敌暂^好的植物,其葉片角質(zhì)層較厚,具有比較發(fā)達(dá)的柵欄組織,柵欄組織/海綿組織的比例以及氣孔密度均較高,具有細(xì)胞細(xì)長(zhǎng)、排列緊密的特征[9-10]。在有關(guān)芒果[11]、香蕉[12]、柚木[13]、等熱帶植物及核桃[14]、板栗[15]等經(jīng)濟(jì)林樹(shù)種或果樹(shù)的抗旱性研究中發(fā)現(xiàn),葉片形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)與抗旱性之間均存在一定相關(guān)性。對(duì)油茶抗旱性的研究主要是在干旱脅迫條件下,油茶生長(zhǎng)發(fā)育、光合特性、內(nèi)源激素及生理生化參數(shù)等方面的變化,當(dāng)土壤含水率低于24.0 %~26.8 %,油茶葉片內(nèi)源激素開(kāi)始啟動(dòng)對(duì)干旱的響應(yīng)機(jī)制,新、老葉SPAD值降幅增大,凈光合速率也開(kāi)始下降,氮代謝功能減弱,干旱脅迫對(duì)油茶籽和茶油產(chǎn)量的影響比較顯著,對(duì)花徑、花苞長(zhǎng)生長(zhǎng)的影響相對(duì)不顯著[1-3,16-22]。從曹林青[1]、張規(guī)富[23]的研究中可知,葉片結(jié)構(gòu)發(fā)生諸如葉片厚度、大小、質(zhì)量、皮氣孔面積、柵欄組織厚度、柵海比減小等變化,均是油茶應(yīng)對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)特征。而通過(guò)葉片解剖結(jié)構(gòu)分析抗旱性的方法在油茶中還未見(jiàn)有報(bào)道?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】以廣西主栽的岑軟2號(hào)、岑軟3號(hào)等岑軟系列無(wú)性系為研究對(duì)象,通過(guò)電鏡觀察葉片解剖結(jié)構(gòu),分析篩選葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo),采用隸屬函數(shù)法對(duì)各無(wú)性系的抗旱性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】改善干旱地區(qū)油茶營(yíng)養(yǎng)生殖生長(zhǎng)不佳及座果率不高導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)效益低下等問(wèn)題,為干旱地區(qū)造林時(shí)的抗性品種改良及選擇提供科學(xué)參考,
試驗(yàn)林位于廣西南寧市北郊,地處濕潤(rùn)的南亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū),年平均氣溫21.6 ℃左右,最冷的1月份平均12.8 ℃,最熱的7、8月份平均28.2 ℃,年均降雨量1304 mm左右,四季常綠。土壤為磚紅壤性紅壤,壤土厚度5~25 cm。
于2018年8月20日11:00-12:00,每個(gè)無(wú)性系中選取3株無(wú)明顯病蟲害、長(zhǎng)勢(shì)相似的植株(即3個(gè)重復(fù)),于每植株樹(shù)冠第3層的第5葉位摘取健康、成熟葉片3片,沖洗干凈并晾干,用FAA固定液固定24 h以上。
將葉片切割成以主脈為中心10 mm×5 mm組織塊,經(jīng)不同梯度的酒精脫水,二甲苯透明,石蠟滲透包埋后,用石蠟切片機(jī)制成4~10 μm厚的切片,放入烘箱脫水。
采用番紅-固綠染色法染色,再次脫水、透明后用中性樹(shù)膠封片,置于Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察葉片表皮和柵欄、海綿組織等指標(biāo)。
取固定液固定過(guò)的葉片,依次放入兩個(gè)裝有70 %酒精的燒杯中放置1 h,取出后利用解剖剪刀剪取5 mm×5 mm方形小塊葉片,使下表皮向下平放在載玻片上,用切片刀片垂直葉片表面,輕輕地把葉片的上表皮和葉肉刮下,僅留薄膜狀的下表皮,再用清水漂洗后,放置于載玻片上,蓋上蓋玻片,制成臨時(shí)制片。在放大100倍電鏡下進(jìn)行觀察,利用數(shù)碼顯微鏡攝像系統(tǒng)(Olympus CX 32) 和TOPVIEW軟件進(jìn)行圖像處理及測(cè)量。每個(gè)葉片隨機(jī)選取3個(gè)橫切面,各切面選取5個(gè)視野,每個(gè)視野測(cè)量一組指標(biāo),所有指標(biāo)為15個(gè)數(shù)據(jù)的平均值。
參照文獻(xiàn)[24],測(cè)定如下指標(biāo):葉片厚度(LT)、上表皮細(xì)胞的長(zhǎng)度(LU)和厚度(TU)、下表皮細(xì)胞的長(zhǎng)度(LL)和厚度(TL)、角質(zhì)層厚度(LCT)、柵欄組織厚度(TP)、海綿組織厚度(TS)、中脈厚度(MT),同時(shí)測(cè)定氣孔的長(zhǎng)度(SL) 、寬度(SW),統(tǒng)計(jì)氣孔的密度(SD)、張開(kāi)度(SO),計(jì)算孔徑(SA)。
并按照下列公式計(jì)算柵/海比(P /S)、組織結(jié)構(gòu)緊密度(CTR)和組織結(jié)構(gòu)疏松度(SR) 及變異系數(shù)(c.v.)。
人上了年紀(jì),記性大不如從前,常常忘事,那么,柴松巖是如何保持好記性的呢?她坦言,保持平和、寬容的心態(tài),是對(duì)身體和精神最好的保養(yǎng)。
柵海比(P/S)=柵欄組織厚度(TP)/海綿組織厚度(TS)
組織結(jié)構(gòu)緊密度(CTR, %)=柵欄組織厚度(TP)/葉片厚度(LT)×100
組織結(jié)構(gòu)疏松度(SR, %)=海綿組織厚度(TS)/葉片厚度(LT)×100
變異系數(shù)(c.v., %)=(標(biāo)準(zhǔn)差/平均值)×100
所得數(shù)據(jù)利用SPSS 17.0和Microsoft Excel 2007軟件進(jìn)行分析。
表1 油茶9個(gè)無(wú)性系的葉片及其表皮特征
注:* 表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01)。同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05), 下同。
Note:* means significant difference(P<0.05); **means extremely significant difference(P<0.01). Different small letters in the same column indicate significant difference. The same as below.
9個(gè)油茶無(wú)性系抗旱性利用Fuzzy數(shù)學(xué)中的隸屬函數(shù)法進(jìn)行綜合評(píng)價(jià):
f(xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)。
其中,f(xi)為無(wú)性系i的抗旱性隸屬函數(shù)值;Xi為無(wú)性系i的指標(biāo)測(cè)定值;Xmin和Xmax分別為各無(wú)性系對(duì)應(yīng)指標(biāo)的最小值和最大值。若某一指標(biāo)與該無(wú)性系抗旱性呈負(fù)相關(guān),則用反隸屬函數(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換:f(xi)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)。
根據(jù)以上公式計(jì)算出油茶無(wú)性系葉片解剖結(jié)構(gòu)各指標(biāo)的平均隸屬度,平均隸屬度越大抗旱性越強(qiáng)。
2.1.1 葉表皮特征 油茶葉片解剖結(jié)構(gòu)可分為葉表皮、葉肉和葉脈。葉片厚度通常被視為衡量植物抗旱能力的一個(gè)重要指標(biāo)[25]。從9個(gè)油茶無(wú)性系的葉片橫切面解剖結(jié)構(gòu)及各指標(biāo)的測(cè)量數(shù)據(jù)(圖1和表1)可見(jiàn),葉片厚度為356.80~517.57 μm,各無(wú)性系間呈極顯著差異(P<0.01,下同),變異系數(shù)為14.49,其中岑軟2號(hào)葉片最厚,無(wú)性系岑軟ZJ11、岑軟ZJ14、岑軟ZJ24最薄。
9個(gè)油茶無(wú)性系的葉上表皮細(xì)胞外覆有4.01~6.33 μm的角質(zhì)層,可限制其表面水分的非氣孔性散失[26],通常角質(zhì)層越厚表明其耐熱性越強(qiáng)[24]。9個(gè)油茶無(wú)性系的平均角質(zhì)層厚度為5.05 μm,其中無(wú)性系岑軟2號(hào)、岑軟ZJ14、岑軟3-62的厚度超過(guò)平均值,各無(wú)性系之間有極顯著差異,變異系數(shù)22.04,為所有指標(biāo)中的最大。
如圖2所示,葉表皮分為上表皮和下表皮,其中上表皮較厚、細(xì)胞形狀長(zhǎng),下表皮薄、細(xì)胞體積較小。上表皮細(xì)胞長(zhǎng)度為22.33~31.94 μm,平均值為26.81,岑軟ZJ24最小,岑軟3號(hào)最大;上表皮細(xì)胞厚度為11.59~18.13 μm,平均值15.62 μm,岑軟ZJ24最小,岑軟24號(hào)最大。下表皮長(zhǎng)度與厚度分別為18.60~25.70與8.53~12.50 μm,對(duì)應(yīng)的平均值為21.36和10.17 μm,均為岑軟3號(hào)最大,岑軟ZJ24最小。各無(wú)性系上、下表皮指標(biāo)均呈顯著差異(P<0.05,下同)。葉片上下表皮越厚,減少水分蒸發(fā)的作用越強(qiáng),抗旱性則強(qiáng)[14],由此可見(jiàn),岑軟3號(hào)具有較強(qiáng)的抗旱性。
如圖1、2所示,油茶氣孔散生在下表皮。一般認(rèn)為,氣孔的大小和數(shù)量與植物蒸騰失水量直接相關(guān),孔徑小且密度大的氣孔有助于光合作用和散熱[27]。在100倍鏡下觀察的結(jié)果顯示,9個(gè)油茶無(wú)性系葉片的氣孔長(zhǎng)度為30.60~34.75 μm,其平均值為33.07 μm;氣孔平均寬度為28.12 μm,變異系數(shù)為6.31 %;氣孔平均面積為8070.77 μm2,變異系數(shù)為8.43 %。3個(gè)指標(biāo)均為岑軟2號(hào)最大,岑軟ZJ11最小。氣孔器小而密集,平均密度為229.23個(gè)/μm2,最大的為岑軟ZJ14,最小的為岑軟3號(hào)。平均氣孔張開(kāi)度為0.10(表2)。
圖中標(biāo)尺大小為200 m1:岑軟2號(hào) ; 2:岑軟3號(hào); 3:岑軟11號(hào); 4:岑軟22號(hào); 5:岑軟24號(hào); 6:岑軟ZJ11; 7:岑軟ZJ14; 8:岑軟ZJ24; 9:岑軟 3-621:Cenruan 2; 2:Cenruan 3; 3:Cenruan11;4:Cenruan 22;5: Cenruan 24;6: CenruanZJ11;7: CenruanZJ14;8: CenruanZJ24;9: Cenruan 3-62圖1 9個(gè)油茶無(wú)性系的葉片橫切面Fig.1 Leaf cross sections of nine Camellia clones
圖中標(biāo)尺大小為200 m1:岑軟2號(hào); 2:岑軟3號(hào); 3:岑軟11號(hào); 4:岑軟22號(hào); 5:岑軟24號(hào); 6:岑軟ZJ11; 7:岑軟ZJ14; 8:岑軟ZJ24; 9:岑軟3-62 1:Cenruan 2;2: Cenruan 3;3:Cenruan11;4: Cenruan 22;5: Cenruan 24;6:CenruanZJ11;7: CenruanZJ14;8: CenruanZJ24;9: Cenruan 3-62圖2 9個(gè)油茶無(wú)性系葉片氣孔的顯微結(jié)構(gòu)Fig.2 Microscopic images of leaf stomatal of nine Camellia clones
表2 9個(gè)油茶無(wú)性系的葉片氣孔特征
2.1.2 葉肉特征 油茶葉肉由柵欄組織和海綿組織兩部分組成,葉片為典型的異面葉。從圖2可見(jiàn),油茶葉片的柵欄組織緊靠上表皮,由2~3層長(zhǎng)柱形細(xì)胞緊密排列而成,海綿組織緊靠下表皮,由短柱形或近圓形細(xì)胞組成,排列疏松,胞間隙大。
9個(gè)油茶無(wú)性系的葉肉細(xì)胞解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)間存在極顯著差異(表3)。柵欄組織的厚度為134.87~209.63 μm,平均厚度為160.97 μm,其中岑軟2號(hào)最厚,岑軟ZJ14最薄; 各無(wú)性系海綿組織厚度均厚于柵欄組織,平均厚度為215.89 μm,排列較疏松; 因此,柵海比為0.64~0.85,其中岑軟2號(hào)最大,岑軟3號(hào)最小,變異系數(shù)在葉肉組織中最大,為17.66 %;細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)緊密度為34.16 %~43.37 %,為岑軟ZJ11最大,岑軟3號(hào)最小,組織結(jié)構(gòu)疏松度在48.10 %~54.67 %,岑軟2號(hào)最大,岑軟3-62最小。
2.1.3 葉脈特征 葉片主脈的大小跟植物體內(nèi)水分的運(yùn)輸效率直接相關(guān),主脈越粗說(shuō)明其水分控制能力越強(qiáng),從而有能力讓植物體避免在高溫干旱條件下受傷害[28]。9個(gè)無(wú)性系的中脈結(jié)構(gòu)如圖3所示,中脈厚度存在極顯著差異(表4)。中脈厚度最大的是岑軟11號(hào),最小的是岑軟ZJ24,相差1.26倍,變異系數(shù)為10.76 %。
表3 9個(gè)油茶無(wú)性系葉片的葉肉結(jié)構(gòu)特征
表4 9個(gè)油茶無(wú)性系葉片中脈特征
Note:MT:Midrib thickness.
圖中標(biāo)尺大小為200 m1:岑軟2號(hào); 2:岑軟3號(hào); 3:岑軟11號(hào); 4:岑軟22號(hào); 5:岑軟24號(hào); 6:岑軟ZJ11; 7:岑軟ZJ14; 8:岑軟ZJ24; 9:岑軟3-621: Cenruan 2;2: Cenruan 3;3: Cenruan11;4: Cenruan 22;5: Cenruan 24;6: CenruanZJ11;7:CenruanZJ14;8: CenruanZJ24;9: Cenruan 3-62圖3 9個(gè)油茶無(wú)性系葉片主脈橫切面Fig.3 Cross sections of leaf midrib of nine Camellia clones
2.2.1 葉片抗旱性解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)篩選 選擇彼此獨(dú)立、具有代表性的指標(biāo)作為抗旱性評(píng)價(jià)的最優(yōu)指標(biāo)[29],對(duì)9個(gè)油茶無(wú)性系的17項(xiàng)葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)進(jìn)行聚類分析。17項(xiàng)指標(biāo)分為3類時(shí),各類距離較大且特點(diǎn)突出(圖4)。第Ⅰ類包括葉片厚度、柵欄組織厚度、氣孔面積、上表皮長(zhǎng)度、氣孔寬度、下表皮厚度、氣孔長(zhǎng)度、海綿組織厚度、中脈厚度、上表皮厚度、上表皮長(zhǎng)度11項(xiàng)指標(biāo);第Ⅱ類包括氣孔開(kāi)度、組織結(jié)構(gòu)疏松度2項(xiàng)指標(biāo);第Ⅲ類包括柵海比、組織結(jié)構(gòu)緊密度、氣孔密度、角質(zhì)層厚度4項(xiàng)指標(biāo)。
根據(jù)聚類結(jié)果和相關(guān)矩陣計(jì)算得出各類中指標(biāo)的相關(guān)指數(shù),并進(jìn)行排序。如表6所示,第1類中葉片厚度的相關(guān)指數(shù)最大,可作為該類型的典型指標(biāo);第2類中氣孔開(kāi)度和組織結(jié)構(gòu)疏松度的相關(guān)指數(shù)相等,但前者的變異系數(shù)較大(13.8 %),故選氣孔開(kāi)度為該類的典型指標(biāo);第3類則選擇相關(guān)指數(shù)最大的柵海比為典型指標(biāo)。
圖4 17項(xiàng)指標(biāo)的變量聚類分析Fig.4 Variable cluster analysis of 17 indexes
表5 葉片結(jié)構(gòu)指標(biāo)的相關(guān)矩陣
2.2.2 抗旱性綜合評(píng)價(jià) 根據(jù)隸屬函數(shù)公式計(jì)算所選3個(gè)指標(biāo)的平均隸屬度(表7),綜合評(píng)價(jià)9個(gè)油茶無(wú)性系的抗旱性,抗性由強(qiáng)至弱依次為:岑軟ZJ11>岑軟ZJ24>岑軟2號(hào)>岑軟22號(hào)>岑軟3-62>岑軟11號(hào)>岑軟3號(hào)>岑軟24號(hào)>岑軟ZJ14。
干旱是影響植物生長(zhǎng)代謝和生命活動(dòng)最主要的非生物脅迫因素之一[31], 植物長(zhǎng)期處于干旱生境時(shí),會(huì)在根、莖、葉等外部形態(tài)上發(fā)生結(jié)構(gòu)性的變化[32],作出一定的形態(tài)學(xué)適應(yīng),因此植物的葉片解剖結(jié)構(gòu)與抗旱性密切相關(guān)。曹林青[1]、張規(guī)富[23]、張誠(chéng)誠(chéng)[33]等的研究顯示,隨著干旱脅迫的增強(qiáng)油茶葉片逐漸變薄,上表皮、下表皮、柵欄組織等厚度均呈下降趨勢(shì)。角質(zhì)層厚度顯著增加,氣孔面積、氣孔周長(zhǎng)、氣孔開(kāi)度、氣孔器大小均顯著減小,氣孔密度先減小后增大,主脈厚度顯著增加。這與酸棗、枸杞、蘋果等其他樹(shù)種的研究結(jié)論基本一致[32-38]。但在脅迫后的柵海比這一指標(biāo)中表現(xiàn)各不相同,對(duì)7年生長(zhǎng)林4號(hào)油茶進(jìn)行干旱脅迫時(shí),柵海比隨著干旱脅迫的增加而顯著降低,而2年生長(zhǎng)林3號(hào)油茶幼苗隨著脅迫強(qiáng)度增加?xùn)藕1戎饾u升高。
表6 各類中指標(biāo)相關(guān)指數(shù)及排序
表7 9個(gè)油茶無(wú)性系的抗旱性綜合評(píng)價(jià)
本研究選擇葉片厚度、氣孔開(kāi)度和柵海比作為典型指標(biāo)綜合分析抗旱性,得出9個(gè)油茶無(wú)性系的抗旱性強(qiáng)弱順序。其中岑軟ZJ11和岑軟ZJ24抗旱性最強(qiáng),二者的柵海比相應(yīng)的也較高,但葉片厚度和氣孔開(kāi)度并不突出。這是由于柵欄組織/海綿組織比值提高可提高植物的光合效率,而光合效率的提高可能是植物可抵御干旱脅迫的一個(gè)重要原因[39]。一般來(lái)說(shuō),處于水分虧缺狀態(tài)時(shí),植物葉片柵欄組織變發(fā)達(dá),海綿組織相對(duì)減??;而本研究中抗旱性最強(qiáng)的岑軟ZJ11和岑軟ZJ24柵欄組織并不算發(fā)達(dá)(分別為149.64和151.68 μm,平均值為160.97 μm),海綿組織較小(分別為182.07和185.03 μm,平均值為215.89 μm),且葉片厚度相對(duì)較小(分別為356.80和379.65 μm,平均值為421.16 μm),因此可認(rèn)為,其抗旱性不僅取決于柵欄組織的絕對(duì)厚度,而是與柵欄組織與海綿組織厚度占葉片厚度的比例相關(guān),這與陳豫梅等[12]、白重炎等[14]的研究結(jié)果一致。氣孔開(kāi)度與氣孔面積、氣孔密度呈負(fù)相關(guān),其中與氣孔密度的相關(guān)性顯著。岑軟ZJ11氣孔面積與密度分別為7329.49 μm2和265.22 μm,氣孔器小而密,氣孔開(kāi)度為0.10;岑軟ZJ24氣孔面積與密度分別為8060.92 μm2和205.57 μm,氣孔雖然大小稍大密度較小,氣孔開(kāi)度為0.09,各無(wú)性系之間的差異并不顯著。由此可知,雖然油茶與板栗[15]、桃[27]等植物一樣,都是通過(guò)表皮氣孔加大密度或縮小孔徑來(lái)對(duì)干旱環(huán)境做出迅速響應(yīng),但在水分條件適宜的情況下,油茶的抗旱性強(qiáng)弱不能簡(jiǎn)單通過(guò)氣孔的大小或密度來(lái)判定,需要結(jié)合聚類分析,運(yùn)用隸屬函數(shù)法通過(guò)降低單一指標(biāo)的片面性,增加評(píng)價(jià)結(jié)果的可靠性。盡管如此,植物的抗逆性涉及諸多物質(zhì)及其生理生化變化,對(duì)油茶的抗旱性分析還需運(yùn)用各種新技術(shù)和檢測(cè)手段,綜合抗性生理指標(biāo)對(duì)其進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。本研究條件下,岑軟ZJ11和岑軟ZJ24可初步被認(rèn)為作為今后南緣地區(qū)推廣造林的油茶新品種,但推廣應(yīng)用時(shí)還需進(jìn)行抗性脅迫試驗(yàn)作進(jìn)一步驗(yàn)證。
通過(guò)葉片解剖結(jié)構(gòu)可以判斷,抗旱性強(qiáng)弱排序?yàn)椋横沍J11>岑軟ZJ24>岑軟2號(hào)>岑軟22號(hào)>岑軟3-62>岑軟11號(hào)>岑軟3號(hào)>岑軟24號(hào)>岑軟ZJ14,即岑軟ZJ11和岑軟ZJ24在干旱條件下的抗性最強(qiáng)。
致 謝:感謝廣西林業(yè)科學(xué)研究員院特聘專家——美國(guó)南卡羅萊納州克萊姆森大學(xué)梁海英博士對(duì)本論文的指導(dǎo)。